沈繼龍nsfcproposal

1、<p>　申請代碼：</p><p>　受理部門：</p><p>　收件日期：</p><p>　受理編號：</p><p><b>　　國家自然科學基金</b></p><p><b>　　申 請 書</b></p><p><b&

2、gt;　　資助類別： </b></p><p><b>　　亞類說明： </b></p><p><b>　　附注說明： </b></p><p><b>　　項目名稱： </b></p><p>　　申 請 者： 電話： <

3、;/p><p><b>　　依托單位： </b></p><p><b>　　通訊地址： </b></p><p>　　郵政編碼： 單位電話： </p><p><b>　　電子郵件： </b></p><p>　　申報日期：

4、 2005年3月12日</p><p>　　國家自然科學基金委員會</p><p>　　基本信息yoKWT/OQ</p><p>　　項目組主要成員(國家杰出青年科學基金不填此欄)</p><p>　　說明: 1. 高級、中級、初級、博士后、博士生、碩士生人員數(shù)由申請者負責填報，總?cè)藬?shù)自動生成。</p>&l

5、t;p>　　說明: 2. 項目組主要成員不包括項目申請者。</p><p>　　經(jīng)費申請表 （金額單位：萬元）</p><p><b>　　報告正文</b></p><p>　?。ㄒ唬┝㈨椧罁?jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）： </p&

6、gt;<p>　　1. 項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及分析，附主要參考文獻目錄。）</p><p>　　血吸蟲病是熱帶亞熱帶發(fā)展中國家的嚴重寄生蟲病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，該病在全世界74個國家中流行，6億多人口受到威脅，2億多人受到感染，其中1.2億伴有臨床癥狀，2000萬伴有嚴重后遺癥；全世界每年死于血吸蟲病性肝纖維化及其并發(fā)癥的患者達50萬-100萬；血吸蟲病在14歲以下的

7、兒童中發(fā)病率之高，嚴重影響了兒童的智力發(fā)育和身心健康[1]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有6種血吸蟲引起人類疾病，我國是日本血吸蟲病流行最嚴重的國家[2]。該病主要分布于我國長江流域及其南部的12個省（區(qū)、市），受威脅的人群達1億以上，感染人數(shù)超過1000萬[2]。目前，我國日本血吸蟲病的流行尚未得到有效控制，湖區(qū)患病人數(shù)急劇增加。該病已成為嚴重影響我國人民身心健康和國民經(jīng)濟、社會發(fā)展和穩(wěn)定的主要疾病之一[2]。</p><p>　

8、　血吸蟲病是一種蟲卵肉芽腫引起的慢性免疫性疾病，其病理基礎(chǔ)是沉積于組織內(nèi)大量的成熟蟲卵對機體的刺激、宿主對活毛蚴分泌的可溶性抗原產(chǎn)生的病理性免疫應答，并形成蟲卵肉芽腫和繼發(fā)肝纖維化的形成[2]。肝纖維化是血吸蟲病嚴重的后果，它可進一步導致門靜脈高壓癥如食管胃底靜脈曲張、脾腫大和脾功能亢進，最后引發(fā)上消化道大出血導致死亡[2]。日本血吸蟲病肝纖維化/肝硬化及其并發(fā)癥是血吸蟲病患者死亡的主要原因[3]。根據(jù)以上的發(fā)病機理和病理進程，針對日本

9、血吸蟲病的治療應包括殺蟲，抑制蟲卵肉芽腫，減輕、延緩甚至阻止纖維化形成等三個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)外治療血吸蟲病主要采用殺蟲療法（即第一環(huán)節(jié)），尤其是首選吡喹酮為抗血吸蟲病藥物[2, 4]，因此，這就產(chǎn)生了以下問題：第一，吡喹酮只對童蟲、成蟲和組織內(nèi)成熟蟲卵具有殺滅作用，所以，殺蟲治療后肝臟及腸壁組織內(nèi)未成熟蟲卵仍可繼續(xù)發(fā)育，組織蟲卵肉芽腫反應仍在繼續(xù)[5, 6]；第二，由于慢性患者（此類患者在血吸蟲感染者中占大多數(shù)）臨床上多無癥狀或只表現(xiàn)

10、為慢性腹瀉而易延誤診斷[2]，結(jié)果往往不能及時使用殺蟲藥，導致肝肉芽腫和纖維化的形成；第三，近年國外已從經(jīng)有效劑量吡喹酮治</p><p>　　日本血吸蟲蟲卵肉芽腫的形成與細胞及體液免疫有關(guān)，尤其是前者在肉芽腫形成早期起主要作用[2]。血吸蟲尾蚴通過疫水經(jīng)皮膚感染人體，先后經(jīng)過童蟲、成蟲階段，最后主要移行于肝門靜脈和腸系膜靜脈并寄生、產(chǎn)卵。蟲卵隨血流主要沉積于門靜脈分支、肝血竇前，在此，蟲卵內(nèi)成熟的毛蚴分泌可溶性

11、蟲卵抗原（soluble egg antigen,SEA）并經(jīng)卵殼上的微孔滲入肝周圍組織。SEA被周圍組織中的巨噬細胞吞噬處理，經(jīng)過處理的抗原被遞呈到輔助性的T淋巴細胞（Th）。同時，攝取了抗原的巨噬細胞釋放白細胞介素1（IL-1），激活TH，后者產(chǎn)生多種細胞因子，其中促進肉芽腫形成的有IL-1、IL-2 、IL-4 、IL-5、IL-13等；抑制肉芽腫形成的有IL-10、IL-2、IFN-γ等；還有各類細胞趨化因子、移動抑制因子等。在

12、上述各種細胞因子的共同參與下，大量巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、成纖維細胞和嗜酸粒細胞等聚集到蟲卵周圍形成炎性肉芽腫，隨后肉芽腫中心壞死，形成嗜酸性膿腫，卵內(nèi)毛蚴逐漸死亡，SEA分泌量減少，最終停止，肉芽腫退化并開始局部纖維化，由此可引出嚴重臨床癥狀[2, 4]。在這些細胞因子</p><p>　　雖然目前對于血吸蟲性肝纖維化的發(fā)生機制尚不清楚，但國際上對非血吸蟲病性肝纖維化的發(fā)生機理研究較多，也較明確

13、。肝纖維化是指肝臟纖維組織過度沉積，是纖維增生和分解不平衡的結(jié)果。反復或持續(xù)的慢性肝實質(zhì)炎癥、壞死，可使細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM），主要為膠原纖維，合成過多而降解相對不足，從而形成肝纖維化，它是肝硬化的必經(jīng)階段[4]。肝星狀細胞（hepatic stellate cell, HSC）目前被公認為是ECM的主要來源細胞，HSC的激活是肝纖維化形成初始的中心環(huán)節(jié)[4, 11]。所以，研究HSC的激活對探

14、索血吸蟲病肝纖維化發(fā)生機理及肝纖維化的有效預防均有特別重要的現(xiàn)實意義。</p><p>　　HSC的激活是一個級聯(lián)反應過程，其過程如下[4, 12]：當肝臟受到各種損傷時，局部的肝細胞、枯否細胞（巨噬細胞）、竇內(nèi)皮細胞、血小板、淋巴細胞、中性粒細胞等釋放多種細胞因子，其中最主要的是血小板源性生長因子（platel et-derived growth factor, PDGF）和轉(zhuǎn)化生長因子β（transformi

15、ng growth factor-β1,TGFβ1）等，它們共同作用于HSC，使其激活。被激活的HSC向肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）轉(zhuǎn)化，同時表達大量的平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）、多種細胞因子受體（例如PDGF受體和TGFβ1受體等）、以及Ⅰ、Ⅲ型膠原等ECM成分；并且被激活的HSC自身又激活κ基因結(jié)合核因子（nuclear factor-κ-gene-binding

16、, NFκB）、分泌TGFβ1等細胞因子。此外，ECM中的Ⅰ型膠原等成分也可激活HSC。因此，一旦HSC被激活，受細胞旁分泌、自分泌的直接作用及所處環(huán)境膠原的間接作用，HSC活化將逐漸放大并持續(xù)存在，即使除去誘因，活化也將繼續(xù)下去[4]</p><p>　　HSC的激活主要是因為某些細胞因子作用于該細胞的信號轉(zhuǎn)導通路所致，在這些細胞因子中，研究的最多，也最重要的是PDGF和 TGFβ1[4, 13, 14]因子。

17、</p><p>　　PDGF為HSC最強的促分裂劑[4]。枯否細胞（巨噬細胞）是主要合成PDGF的細胞。肝臟受損時，枯否細胞、血小板、竇內(nèi)皮細胞及激活的HSC均可以分泌PDGF[4]。當其與PDGF受體（為酪氨酸蛋白激酶受體）結(jié)合時，促使受體形成二聚體而被激活，隨后受體的酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，繼而先后激活Ras、Raf-1、MAPK(mitogen-activated protein kinase)激酶、E

18、RK（extracellular signal-regulated kinase）。ERK向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，促進有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化及基因表達而引起HSC的活化、增殖[4]。 </p><p>　　TGFβ1是一種對細胞生長、分化和多種生理、病理過程起重要調(diào)節(jié)作用的細胞因子。在肝受損時，TGFβ1由枯否細胞、淋巴細胞、竇內(nèi)皮細胞及激活的HSC等合成，能促進HSC的增殖和基因表達、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix meta

19、lloproteinases， MMPs）合成、促進基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of MMPs, TIMPs）合成、阻滯ECM的降解、促進ECM（例如，Ⅰ、Ⅲ型膠原）的生成。此外，TGFβ1還能增加PDGF對HSC的增殖作用，故TGFβ1被認為是最強的促膠原生成因子，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4, 13]。TGFβ1通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用，而Smads是迄今為止發(fā)現(xiàn)的TGFβ1

20、惟一作用底物[4]，故TGFβ1-Smads信號通路對HSC激活、ECM產(chǎn)生的影響引起極大關(guān)注。</p><p>　　Smads是線蟲Sma蛋白以及果蠅Mad蛋白具有同源性的蛋白家族，他們可以將TGFβ1信號直接由細胞膜受體（為絲/蘇氨酸受體）傳導入細胞核內(nèi)。根據(jù)Smads功能不同分為三類：第一類是膜受體激活的Smad (R-Smads)，包括Smad2、3等，它們可與TGFβ1受體直接作用，并被磷酸化，之后與S

21、mad4結(jié)合，轉(zhuǎn)位入核以調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄；第二類是通用Smad (co-Smad)，目前只有Smad4；第三類是Smad7等，為TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導通路的抑制因子，可與R-Smads競爭性地結(jié)合受體，阻止R-Smads的磷酸化，從而阻斷TGFβ1的效應。 進入細胞核內(nèi)的 Smads復合物可與不同的轉(zhuǎn)錄活化因子或轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合而調(diào)節(jié)TGFβ1的生物效應[4, 13]。</p><p>　　總之，因為PDGF

22、、TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導通路在肝纖維化發(fā)病中起著舉足輕重的作用，干預這些信號通路就成為肝纖維化防治的理想選擇。</p><p>　　如前所述，HSC活化時伴有NFκB激活，而NFκB是一種重要的抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄因子[15, 16]。當HSC處于靜息狀態(tài)時，NFκB與其抑制蛋白結(jié)合，不表現(xiàn)活性，當HSC被激活后，NFκB與其抑制蛋白解離而移位入核，誘導產(chǎn)生一組基因產(chǎn)物，它們的協(xié)同作用能抑制TNF-α誘發(fā)的cas

23、pase-8激活從而抑制HSC的凋亡，使HSC持續(xù)活化[17, 18]。</p><p>　　此外，B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）家族的成員是細胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子[19]。Bcl-2蛋白家族細胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL等；細胞凋亡促進因子有:Bax等。有實驗顯示[20]，給予抗肝纖維化的藥物，可以使激活的HSC中的B

24、cl-2/Bax比率下調(diào)，從而促進HSC凋亡。所以，通過抑制NF-κB活性以及下調(diào)Bcl-2/Bax比率來增加HSC凋亡,可能成為肝纖維化治療的新的靶點之一。</p><p>　　HSC活化后還表達多種MMPs、TIMPs，從而調(diào)節(jié)ECM的成分和含量，使纖維化不斷持續(xù)發(fā)展。MMPs是一組鋅蛋白酶，共有5類不同的酶蛋白分子，包括膠原酶（MMP1、MMP8、MMP13）、明膠酶（MMP2、MMP9）、基質(zhì)分解素（MM

25、P3、MMP10、MMP11）等5類，它們能水解ECM中的多種成分，例如，其中的膠原酶水解ECM中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原；TIMPs是MMPs天然的體內(nèi)抑制因子，包括TIMP-1～TIMP-4，它們與活化的MMPs分子以1∶1的比例結(jié)合，抑制MMPs活性[4]，尤其是TIMP-1在調(diào)節(jié)膠原水解中起重要作用[21]。此外，TIMP-1還能抑制活化的HSC凋亡[22]。顯然，通過抑制TIMP-1即可以增加ECM中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的水解，又可以促

26、進HSC凋亡。所以，抑制TIMP-1將可能成為肝纖維化治療的又一新的靶點。</p><p>　　以上主要是關(guān)于血吸蟲蟲卵肉芽腫與細胞因子免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系，以及非血吸蟲病性肝纖維化發(fā)生的機理。但血吸蟲?。ㄓ绕涫侨毡狙x病）性肝纖維化發(fā)生機理如何，至今知之甚少。例如，蟲卵肉芽腫早期淋巴細胞、枯否細胞（巨噬細胞）、嗜酸粒細胞等分泌的細胞因子是否作為始動因子促進后續(xù)的肝纖維化的進程？是否也存在HSC的激活、增殖？從整體、

27、細胞、蛋白質(zhì)、和核酸分子水平上了解日本血吸蟲病肝纖維化的發(fā)生機理是本項目研究內(nèi)容之一。</p><p>　　中醫(yī)認為，肝纖維化主要因“氣滯血瘀”所致，治療上應以活血化瘀、疏肝理氣、抗炎保肝為主[4]。而赤芍具有活血化瘀功效，白芍具有養(yǎng)血保肝、抗炎止痛等作用[23, 24]，所以，臨床治療肝纖維化中藥方劑中，有不少含有赤芍、白芍成分[4]。我們近年來研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷（為白芍的有效部位，其中芍藥苷含量占70%以上）

28、通過清除自由基及減少TGFβ1的生成，對抗人白蛋白所致的免疫性大鼠肝纖維化；此外，白芍總苷可以明顯抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)巨噬細胞樣滑膜細胞的IL-1分泌，并且抑制成纖維樣滑膜細胞內(nèi)MAPK信號通路中ERK等的磷酸化、減弱成纖維樣滑膜細胞的增殖?？傊?，白芍總苷通過對T細胞、B細胞、巨噬細胞、滑膜成纖維細胞以及自由基、IL-1 、IL-2等的影響而發(fā)揮其抗炎、保肝、抗肝纖維化、以及雙相免疫調(diào)節(jié)等作用。</p><p&

29、gt;　　赤芍（Radix Paeoniae Rubra）和白芍（Radix Paeoniae Alba）均取材于中藥芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）根[23]。芍藥苷（paeoniflorin）是芍藥根的提取物，也是白芍和赤芍的主要活性單體成分[24]。芍藥苷分子結(jié)構(gòu)式為：</p><p>　　其分子式為：C23H28O11 ；分子量為：480.45；熔點：196℃，毒性極低，具有抗炎[

30、25, 26]、抑制血小板凝聚、鎮(zhèn)痛[26]、抗過敏[25]、免疫調(diào)節(jié)[27]等作用。有報道，芍藥苷通過誘導某些淋巴細胞凋亡、改變淋巴細胞亞群分布來發(fā)揮其抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用[28]；此外，芍藥苷還通過保護肝細胞，同時抑制肝細胞分泌Ⅳ型膠原等ECM成分來發(fā)揮抗肝纖維化作用[29]。但芍藥苷在蟲卵肉芽腫形成的早期，如何通過免疫調(diào)節(jié)作用，抑制或降低炎性反應的強度；而在肝纖維化形成的早期，又如何干預HSC的信號轉(zhuǎn)導、影響HSC的凋亡，減輕或延

31、緩纖維化的形成，國內(nèi)外尚未見報道。研究藥物在這些方面的作用機制，對于減輕血吸蟲病的肝臟損害，抑制殺蟲治療后肝臟持續(xù)纖維化過程，具有十分重要的意義。所以，研究中藥芍藥苷對蟲卵肉芽腫炎性反應的影響，及其對肝纖維化的作用機制是本項目研究內(nèi)容之二。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　1. World Health Organisation.

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42、tumor necrosis factor receptor-mediated mouse hepatocyte apoptosis, but not fas-mediated apoptosis: role of nuclear factor-kappaB. Hepatology, 2000; 32: 1272-1279.</p><p>　　17. Lang A, Brenner DA, Rippe RA:

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49、t;p>　　23. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會, 編著: 中華人民共和國藥典二000年版一部. 北京: 人民衛(wèi)生出版社、化學工業(yè)出版社, 2000: 78,125.</p><p>　　24. 田代華, 主編, 謝宗萬, 主審: 實用中藥詞典（上卷）. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2002: 568-575.</p><p>　　25. Yamahara J, Yamada T,

50、Kimura H, Sawada T, Fujimura H: Biologically active principles of crude drugs:Antiallergic principles of "shoseiryu-to":l.Effect on delayed-type allergy reaction. Yakugaku Zasshi, 1982; 102: 881-886.</p>

51、<p>　　26. 國家醫(yī)藥管理局中草藥情報中心站, 編著: 植物藥有效成分手冊. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 1986: 797-798.</p><p>　　27. Liang J, Zhou A, Chen M, Xu S: Negatively regulatory effects of paeoniflorin on immune cells. Eur J Pharmacol, 1990; 18

52、3: 901-902.</p><p>　　28. Tsuboi H, Hossain K, Akhand AA, et al.: Paeoniflorin induces apoptosis of lymphocytes through a redox-linked mechanism. J Cell Biochem, 2004; 93(1): 162-72.</p><p>　　29.

53、 于世瀛, 賁長恩, 白錦雯, 楊美娟, 趙麗云: 芍藥苷對離體培養(yǎng)纖維化后肝細胞的定量細胞化學研究. 中國組織化學與細胞化學雜志， 1995; 4(4): 356-360.</p><p>　　2、項目的研究內(nèi)容、研究目標,以及擬解決的關(guān)鍵問題。（此部分為重點闡述內(nèi)容）</p><p>　?。?）研究內(nèi)容：本項目以芍藥苷作用于日本血吸蟲病肝臟肉芽腫小鼠模型，主要研究內(nèi)容為：</p&

54、gt;<p>　?、?制備ICR株小鼠日本血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫和肝臟纖維化模型；觀察藥物治療前后小鼠肝組織大體以及光、電鏡下肉芽腫和肝纖維化的形態(tài)學改變；肝組織蟲卵計數(shù)、肝蟲卵肉芽腫大小及數(shù)量檢測；肉芽腫內(nèi)嗜酸性粒細胞計數(shù)；肝纖維化染色及纖維化程度判斷；HSC觀察；細胞凋亡小體觀察；</p><p>　?、?用免疫組織化學法檢測芍藥苷治療前后肝組織中IL-4、IFN-γ、TGFβ1及其受體、PDGF

55、及其受體、NFκB、Bcl-2、Bax 、MMP13、TIMP1表達情況； </p><p>　　③ 肝組織HSC分離、培養(yǎng)；用流式細胞術(shù)檢測小鼠HSC凋亡；檢測小鼠HSC中的Smad3、Smad7以及ERK表達；用RT-PCR法檢測芍藥苷治療前后小鼠HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達情況；</p><p>　　通過上述實驗觀察和檢測，圍繞蟲卵肉芽腫形成、HSC激活、凋亡和膠原產(chǎn)生的過程，探

56、討芍藥苷對血吸蟲蟲卵肉芽腫以及肝纖維化的作用機制。</p><p><b>　?。?）研究目標：</b></p><p>　?、?探討細胞因子對日本血吸蟲蟲卵肉芽腫免疫調(diào)節(jié)作用；</p><p>　　② 闡明肝纖維化過程中參與纖維化形成的HSC信號轉(zhuǎn)導的分子機制；</p><p>　?、?研究芍藥苷對蟲卵肉芽腫炎性反應的

57、免疫調(diào)節(jié)；</p><p>　　④ 研究芍藥苷對肝纖維化細胞信號轉(zhuǎn)導的干預。</p><p>　　(3) 擬解決的關(guān)鍵問題:</p><p>　　本項目通過芍藥苷對小鼠血吸蟲蟲卵肉芽腫炎性細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，對肝纖維化中HSC激活、凋亡信號通路中的信號分子、凋亡因子的作用，以及對MMPs、TIMPs、Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響，從而闡明芍藥苷對蟲卵肉芽腫及肝纖維化的作用機

58、制，為研發(fā)抗血吸蟲肉芽腫及抗血吸蟲病肝纖維化新藥提供理論和實驗根據(jù)。</p><p>　　3、擬采取的研究方案及可行性分析。（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明）</p><p><b>　　研究方案：</b></p><p>　?。?）健康ICR株小鼠600只，雌雄各半，隨機分成6組：正常對照組、模型對照組、生理鹽水組、低劑量藥

59、物組、中劑量藥物組、高劑量藥物組，每組100只。除正常對照組以外，其余各組均被制成血吸蟲病肝纖維化模型； </p><p>　?。?）制作ICR株小鼠血吸蟲病肝纖維化模型：以日本血吸蟲尾蚴40±5條經(jīng)腹部皮膚感染小鼠，常規(guī)飲食于并感染后第4周給藥，第6、7、8、12、16周從每組中隨機捉拿20只小鼠，其中10只立即處死，稱量肝臟，留取肝組織標本待測，另10只作肝組織的分離、培養(yǎng)；</p>

60、<p>　?。?）鏡下觀察上述各組小鼠肝組織形態(tài)學改變：</p><p>　　① 取1克肝組織，常規(guī)固定、石蠟切片、HE染色，在普通光鏡下觀察肝的病理組織學改變情況并攝片；取1㎜3大小肝組織，固定、脫水、包埋、烤干、切片，在透射電鏡下觀察并攝片（注意觀察凋亡小體的形態(tài)及數(shù)量）； </p><p>　?、?蟲卵肉芽腫大小、數(shù)量檢測：以此作為肉芽腫炎性反應程度的一個指標。取1克肝組織

61、，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片厚約4～5μm，HE染色。應用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測量切片中所有含完整毛蚴的單蟲卵肉芽腫面積，用標準計算紙測量肝組織面積，全部數(shù)據(jù)輸入計算機，計算以下指標：a.蟲卵肉芽腫大?。喊ㄏx卵肉芽腫截面面積（mm2/個）和體積(mm3/個)；b.蟲卵肉芽腫數(shù)量：即單位面積肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的數(shù)量（個/cm2）；</p><p>　　③ 肝組織蟲卵計數(shù)：以此作為小鼠感染程度的一個指標。稱取肝組織

62、1g，剪碎，置于小燒杯中，加入50g/L的KOH 10ml，于37℃孵箱中消化12 h（過夜），直至組織消化完全，攪勻，吸取100μl，涂片4張，加蓋玻片在顯微鏡下計數(shù)全部4張涂片蟲卵數(shù)，再乘以100，即為蟲卵數(shù)/g肝組織(EPG)。以EPG值乘以每只小鼠的肝臟重量，即為肝臟蟲卵總數(shù)；</p><p>　?、?在普通顯微鏡下對肉芽腫內(nèi)嗜酸性粒細胞進行計數(shù)，并計算各組均值，以此作為肉芽腫炎性反應程度的另一個指標；&

63、lt;/p><p>　?、?用免疫組織化學法(PicTure二步法)檢測肝組織中IL-4、IFN-γ、TGFβ1及其受體、PDGF及其受體、NFκB(p65)、Bcl-2、Bax 、MMP13、TIMP1表達情況。每批實驗均設(shè)立陰、陽性對照。采用MetaMorph顯微圖象分析系統(tǒng)對圖象定量分析。 </p><p>　?、?用免疫組織化學法檢測激活的HSC：肝組織切片在室溫下與抗α-SMA單抗對

64、切片孵育30分鐘后，再與抗鼠IgG2a-過氧化物酶結(jié)合物反應，用DAB顯色、蘇木精、伊紅復染。光鏡下激活的HSC呈棕褐色。用MetaMorph顯微圖象分析系統(tǒng)對圖象進行定量分析，了解HSC被激活的情況；</p><p>　?、?用Van Gieson苦味酸-酸性品紅法對肝組織切片進行染色，膠原纖維呈紅色，肌纖維、胞漿和紅細胞呈黃色，細胞核呈藍黑色。用MetaMorph顯微圖象分析系統(tǒng)進行定量分析，以此來判斷、比較

65、肝纖維化程度；</p><p>　?。?）分離、培養(yǎng)肝組織中的HSC：小鼠在給予麻醉、抗凝后，無菌下以16號套管針作門靜脈插管，灌注D-Hanks液至肝臟充盈，剪開下腔靜脈放血后結(jié)扎。用另一個16號套管作上腔靜脈插管，形成門靜脈-上腔靜脈循環(huán)。分別以0.1%鏈霉蛋白酶E、0.03%Ⅰ型膠原酶灌注3～4分鐘后取出肝臟、剪碎，用鏈霉蛋白酶E、DNA酶消化后，200目篩網(wǎng)過濾、Percoll密度梯度離心、無血清RPMI

66、1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。在光鏡下培養(yǎng)原代肝星狀細胞呈星形或多邊形，胞漿豐富，內(nèi)含脂滴而激活的肝星狀細胞脂滴減少或消失，有的細胞變成梭形。用臺盼藍排斥實驗檢測HSC活力；</p><p>　　（5）用流式細胞儀檢測各組HSC的DNA含量，分析細胞凋亡指數(shù)，了解藥物對HSC凋亡的影響；</p><p>　?。?）用Western blot 法分別檢測HSC中Smad3、7和 ERK的含量（采用凝膠

67、成像系統(tǒng)掃描，以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達水平），以了解蟲卵肉芽腫及藥物對HSC信號轉(zhuǎn)導通路中蛋白激酶的影響；</p><p>　　（7）提取HSC中的總mRNA，用RT-PCR法分別檢測HSC中的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，以了解肝纖維化時藥物對Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響；</p><p><b>　　可行性分析：</b></p><

68、;p>　　血吸蟲病肝肉芽腫及纖維化模型已成為常規(guī)實驗模型；本室已掌握肝星狀細胞的分離培養(yǎng)技術(shù)；已完成國家自然基金血吸蟲細胞信號轉(zhuǎn)導的研究；本實驗室具有完備、先進的實驗儀器和設(shè)備（見“工作條件”）；課題組人員配備合理、并掌握了分子生物學、免疫學及細胞生物學有關(guān)實驗技術(shù)；本課題組已完成白芍總苷對實驗性關(guān)節(jié)炎的滑膜細胞信號轉(zhuǎn)導的影響的研究，并對白芍總苷進行了抗炎、免疫調(diào)節(jié)等研究。</p><p><b>

69、;　　附實驗流程圖：</b></p><p>　　4、本項目的特色與創(chuàng)新之處。</p><p>　　探討芍藥苷對血吸蟲蟲卵肉芽腫的免疫調(diào)節(jié)和早期肝纖維化細胞信號轉(zhuǎn)導的干預，為血吸蟲性肝病治療尋找新的藥物和靶點；選擇繼“殺蟲治療”之后“抗病治療”的新型藥物。探討中藥有效成分對血吸蟲蟲卵肉芽腫及肝纖維化的治療作用，此項研究國內(nèi)外未見報道。</p><p>　

70、　探討細胞因子及HSC內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的主要激酶在血吸蟲病肝纖維化中的作用；</p><p>　　從肝纖維化中起決定作用的HSC及炎性反應和早期纖維化的形成著手，探討血吸蟲病肝纖維化的發(fā)生機理。</p><p>　　5、年度研究計劃及預期研究結(jié)果。（包括擬組織的重要學術(shù)交流活動、國際合作與交流計劃等）</p><p>　　（1）2006年1月-6月：制作血吸蟲病肝纖維化小

71、鼠模型；預實驗；光鏡、電鏡觀察； </p><p>　　（2）2006年7月-12月： 免疫組化，流式細胞術(shù)檢測</p><p>　?。?）2007年1月-6月: 肝星狀細胞分離、培養(yǎng)； </p><p>　　2007年7-12月：細胞因子檢測；實驗檢測、收集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析；</p><p>　　（5）2008年1月-6月：HSC凋亡檢測，肝

72、臟纖維化相關(guān)細胞信號轉(zhuǎn)導通路因子檢測；（6）2008年7月-12月：結(jié)題；撰寫論文并在SCI期刊上發(fā)表4-5篇論著。</p><p>　　（二）研究基礎(chǔ)與工作條件</p><p>　　工作基礎(chǔ)（與本項目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績）</p><p>　?。?）本室掌握了雜交瘤細胞技術(shù)、免疫組化、體液與細胞免疫、PCR技術(shù)、基因克隆、蛋白質(zhì)原核及真核表達、

73、蛋白質(zhì)分析等相關(guān)的技術(shù)方法；</p><p>　?。?）本室掌握了小鼠血吸蟲病肝肉芽腫及纖維化模型的制作方法；</p><p>　?。?）本室熟悉小鼠肝星狀細胞分離、培養(yǎng)技術(shù)；</p><p>　?。?）本室掌握了醫(yī)學統(tǒng)計分析方法及相關(guān)軟件的應用；</p><p>　?。?）本室已進行了白芍總苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用的研究，實驗證明：&l

74、t;/p><p>　?、侔咨挚傑湛擅黠@減輕大鼠的足爪腫脹度及全身繼發(fā)性關(guān)節(jié)病變；有效減緩大鼠體重減輕及關(guān)節(jié)病理變化，如減輕滑膜增生，減少淋巴細胞侵潤等；</p><p>　?、诎咨挚傑湛杉m正關(guān)節(jié)滑膜細胞的增殖和分泌功能；抑制滑膜細胞內(nèi)的ERK、JNK、P38磷酸化程度；對滑膜細胞內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶表達也有一定的調(diào)節(jié)作用；</p><p>　　③白芍總苷可糾正關(guān)節(jié)滑膜細胞

75、內(nèi)G蛋白偶聯(lián)信號通路的紊亂；抑制IL-1a的作用；</p><p>　?。?）本室已進行了白芍總苷對小鼠免疫性肝纖維化治療作用的研究，并于今年在《World Journal of Gastroenterology》上將發(fā)表相關(guān)研究成果（Therapeutic effects of total glucosides of paeony on rats with immunological hepatic fibro

76、sis. in press ）,該研究表明白芍總苷可以減緩小鼠免疫性肝纖維化；</p><p>　?。?）本室還對白芍總苷進行了抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等一系列藥理作用的研究，以及白芍總苷對細胞內(nèi)某些信號轉(zhuǎn)導通路的影響；</p><p>　?。?）本科研小組成員配備合理，對科學孜孜不倦地追求，具有良好的合作精神和奉獻精神；</p><p>　?。?）近年來本科研小組參

77、與的研究及成果：詳見“3、申請人簡歷”</p><p><b>　　參與科研項目：</b></p><p>　?、?關(guān)節(jié)炎滑膜細胞G蛋白的功能變化及治療類風關(guān)中藥有效部位對其的影響.起止年：2005～2006.安徽省自然科學基金資助項目；</p><p>　?、?白芍總苷對實驗性關(guān)節(jié)炎的滑膜細胞信號轉(zhuǎn)導的影響.起止年：2003～2005,編號

78、：30271606.國家自然科學基金資助項目；</p><p>　?、?治療肝炎中藥芍芪多苷及其膠囊的研制.起止年：2002～2005；編號：（2002AA2Z3235）.國家863計劃項目（中藥現(xiàn)代化專項）；</p><p>　　④ 日本血吸蟲rSj14-3-3/mAb和rSjGST標準化抗原診斷試劑的研究（2004AA2Z3570）.國家”863”項目；</p><

79、p>　　⑤ 血吸蟲14-3-3信號轉(zhuǎn)導及其干預（編號30170841）.國家自然科學基金（已結(jié)題 ）。</p><p><b>　　發(fā)表論文：</b></p><p>　?、?Yong-Qiu Zheng, Wei Wei, Xiao-Yi Jia, Lei Zhu. Total glucosides of paeony suppresses adjuvant

80、arthritis in rats and intervenes cytokine-signaling between different types of synoviocytes, Int Immunopharmacol, (accepted)</p><p>　　② 鄭詠秋，魏偉.調(diào)節(jié)類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達的信號轉(zhuǎn)導和相應的藥物作用靶點. 中國藥理學通報, 2005；21(2):133-13

81、7</p><p>　　③ Yong-Qiu Zheng, Wei Wei. Relationship between G proteins-associated transmembrane cascades and MAPK phosphorylation induced by recombinant interleukin-1α in fibroblast-like synoviocytes from rat

82、s with adjuvant arthritis (abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004; 25 (11): p1541-1543</p><p>　　④ Wei Wei, Yong-Qiu Zheng. Total glucosides of paeony suppressed adjuvant arthritis in rats by intervening G prote

83、ins associated transmembrane signal transduction (abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004;25 (11): p1562-1564</p><p>　?、?Lei Zhu, Wei Wei, Yong-Qiu Zheng, Xiao-Yi Jia. Effects and mechanisms of total glucosides

84、of paeony on joint damage in rat collagen-induced arthritis. Inflammation Res. （accepted）</p><p>　?、?查任遠，沈繼龍，汪學龍.日本血吸蟲重組信號蛋白14-3-3（Sr14-3-3）及其單克隆抗體用于診斷的價值.中國人獸共患病雜志,2004；20（10）：847-849</p><p>　　

85、⑦ 沈際佳，蔣作君，汪學龍，王維，江寶玲.抗童蟲表膜單克隆抗體與吡喹酮協(xié)同殺血吸蟲作用.中國藥理學通報，1998；14（5）：440-442</p><p>　?、?李德發(fā)，陳月生，祖瑩，沈繼龍.日本血吸蟲DNA疫苗的構(gòu)建及其保護性免疫.中華預防醫(yī)學雜志，2004；38（3）：193-195</p><p>　?、?李德發(fā)，祖瑩，沈繼龍.rSj14-3-3 和rSj14-3-3/GST對日

86、本血吸蟲蟲卵肉芽腫形成的影響.中國人獸共患病雜志,2003;19（5）：55-58</p><p>　　⑩ Shen JL, Chen SG.Cloning, Expression and purification of human 14-3-3 zeta: a marker for the diagnosis of prion diseases.CAB Abstract Veterinary Bulletin,

87、2001；71(4):393-395</p><p>　　工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑，包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的計劃與落實情況。）</p><p>　?。?）本室具備寄生蟲免疫學和分子生物學研究的基本設(shè)備條件，現(xiàn)有：754-紫外分光光度計，PCR擴增儀，紫外分析儀，HYGRA-96 micro-dispenser，超低溫冰箱，高速冷凍離心機

88、，超聲粉碎儀，全套電泳及蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，超純水系統(tǒng)，CO2孵箱，超凈工作臺，紫外凝膠成像儀，冷凍干燥機，計算機聯(lián)網(wǎng)等。</p><p>　?。?）本實驗室已和中國科技大學生命科學院中心實驗室、中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)所劉德培實驗室建立了良好的協(xié)作關(guān)系。課題主持人為省基因研究重點實驗室副主任，具有良好的研究平臺。</p><p>　?。?）本校臨床藥理研究所為安徽省最早的博士點學科，省和教育廳重

89、點實驗室，在中藥有效部位及單體研究方面具有雄厚的技術(shù)實力和研究條件。</p><p>　　附本實驗室部分基本實驗設(shè)備清單：</p><p>　　3、申請人簡歷（包括申請者和項目組主要成員的學歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項目有關(guān)的主要論著目錄和獲得學術(shù)獎勵情況及在本項目中承擔的任務(wù)。論著目錄要求詳細列出所有作者、論著題目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止頁碼等；獎勵情況也須詳細列出全

90、部受獎人員、獎勵名稱等級、授獎年等。）</p><p>　　（1）沈繼龍：教授，博士生導師，1982年于山東醫(yī)科大學畢業(yè)并獲碩士學位；1987年赴日本帝京大學研修；1990年畢業(yè)并獲得中山醫(yī)科大學博士學位；1996-1998年赴美國CWRU高訪學者；長期從事寄生蟲學的教學與科研，先后主持國際合作、國家“863”、國家自然科學基金及省部級科研項目10余項，在國內(nèi)外學術(shù)刊物上發(fā)表論文100余篇；已獲省級、廳級科技成果

91、二、三等獎5項。近年主要從事寄生蟲病基因工程疫苗、轉(zhuǎn)基因寄生蟲與信號轉(zhuǎn)導的研究。主編、副主編及參加編寫專著及教材10部。</p><p><b>　　發(fā)表論文：</b></p><p>　?、?查任遠，沈繼龍，汪學龍.日本血吸蟲重組信號蛋白14-3-3（Sr14-3-3）及其單克隆抗體用于診斷的價值.中國人獸共患病雜志,2004；20（10）：847-849</

92、p><p>　?、?李德發(fā)，祖瑩，陳月生，沈繼龍.日本血吸蟲重組抗原rS14-3-3免疫保護作用的初步研究.中國寄生蟲病防治雜志,2004；17（2）：106-108</p><p>　?、?李德發(fā)，陳月生，祖瑩，沈繼龍.日本血吸蟲DNA疫苗的構(gòu)建及其保護性免疫.中華預防醫(yī)學雜志，2004；38（3）：193-195</p><p>　?、?劉慶中，沈繼龍.日本血吸蟲重

93、組信號蛋白14-3-3 DNA 免疫保護作用的觀察.中國人獸共患病雜志.2004；20（3）：47-49</p><p>　?、?李德發(fā)，祖瑩，沈繼龍.rSj14-3-3 和rSj14-3-3/GST對日本血吸蟲蟲卵肉芽腫形成的影響.中國人獸共患病雜志,2003；19（5）：55-58</p><p>　　⑥ 劉慶中，沈繼龍.日本血吸蟲重組信號蛋白14-3-3及其DNA疫苗免疫保護性的觀察

94、.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2003；21（5）：257-259</p><p>　　⑦ 汪學龍，沈繼龍，蔣作君.日本血吸蟲Sj14-3-3抗原編碼基因的克隆及序列測定.中國人獸共患病雜志，2001；17（5）：45-47</p><p>　?、?Shen JL, Chen SG.Cloning, Expression and purification of human 14-3-3 z

95、eta: a marker for the diagnosis of prion diseases.CAB Abstract Veterinary Bulletin,2001；71(4):393-395</p><p>　?、?沈繼龍，陳曙光.朊蛋白病診斷標志分子14-3-3 ZETA亞型基因克隆、表達及純化.中國人獸共患病雜志，2000；16（5）：8-10</p><p>　?。?）

96、鄭詠秋：1991年9月－1995年7月在安徽中醫(yī)學院藥學系學習，獲學士學位；1995年7月－2001年3月在安徽中醫(yī)學院藥學系從事教學、科研工作；1997年9月－2001年7月在安徽中醫(yī)學院藥學系中藥專業(yè)學習，獲碩士學位；2001年9月－2005年1月在安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所學習，獲博士學位。</p><p><b>　　發(fā)表論文：</b></p><p>　　①

97、 Yong-Qiu Zheng, Wei Wei, Xiao-Yi Jia, Lei Zhu. Total glucosides of paeony suppresses adjuvant arthritis in rats and intervenes cytokine-signaling between different types of synoviocytes, Int Immunopharmacol, (accepted)&

98、lt;/p><p>　　② 鄭詠秋，魏偉.調(diào)節(jié)類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達的信號轉(zhuǎn)導和相應的藥物作用靶點. 中國藥理學通報, 2005；21(2):133-137</p><p>　　③鄭詠秋，魏偉，戴敏，汪倪萍.木瓜苷抑制小鼠接觸性超敏反應及對其胸腺T淋巴細胞亞型的調(diào)節(jié)作用. 中國藥理學通報, 2004；20(9):1016-1020</p><p>　?、?/p>

99、Yong-Qiu Zheng, Wei Wei. Relationship between G proteins-associated transmembrane cascades and MAPK phosphorylation induced by recombinant interleukin-1α in fibroblast-like synoviocytes from rats with adjuvant arthritis

100、(abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004; 25 (11): p1541-1543</p><p>　　⑤ Wei Wei, Yong-Qiu Zheng. Total glucosides of paeony suppressed adjuvant arthritis in rats by intervening G proteins associated transmembra

101、ne signal transduction (abstract). Acta Pharmacol Sin, 2004;25 (11): p1562-1564</p><p>　　⑥ Lei Zhu, Wei Wei, Yong-Qiu Zheng, Xiao-Yi Jia. Effects and mechanisms of total glucosides of paeony on joint damage

102、in rat collagen-induced arthritis. Inflammation Res. （accepted）</p><p>　　（3） 儲德勇： 1990年在上海第二醫(yī)科大學兒科系獲學士學位；1995年在安徽省省立兒童醫(yī)院兒內(nèi)科工作；2002年在四川成都華西醫(yī)科大學學習，獲醫(yī)學碩士學位；2004.10-至今在安徽醫(yī)科大學攻讀博士學位。</p><p><b>

103、　　發(fā)表論文：</b></p><p>　　① 儲德勇，李煒如，廖清奎.三磷酸腺苷生物發(fā)光法在白血病細胞株K562化療藥物敏感實驗中應用探討.兒科藥學雜志，2003；9（6）：7-9</p><p>　?、?儲德勇.缺氧缺血性腦損害新生豬海馬皮層病理改變及ATP生成率、ATP合成酶活性變化.成都：華西醫(yī)科大學碩士學位論文，2002</p><p>　?、?/p>

104、 儲德勇，李煒如，姚裕家，唐瑟.兒童周圍血單個核細胞端粒酶活性檢測在診斷急性淋巴細胞白血病中的臨床意義.四川醫(yī)學，2002；23（5）：490-491</p><p>　?。?） 王維： 1987年畢業(yè)于安徽醫(yī)科大學并獲學士學位，留校后一直從事寄生蟲學教學、科研等工作，現(xiàn)任安徽醫(yī)科大學病原生物學副教授。主要從事寄生蟲分子生物學研究，內(nèi)容包括基因克隆、DNA重組技術(shù)、基因產(chǎn)物的表達及鑒定，并在此基礎(chǔ)上進一步研究寄生