水稻OsiICK1和OsiICK6分子特征分析及過表達(dá)OsiICK6對(duì)植株生長和發(fā)育的影響.pdf

1、細(xì)胞分裂及其周而復(fù)始的循環(huán)是植物(包括其它生物)生長發(fā)育的基本動(dòng)力。正常的細(xì)胞周期,即從上一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程,是由一種高度保守的分子機(jī)制調(diào)控。細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子(Inhibitors of Cyclin-dependent Kinase,ICKs)即是這種分子調(diào)控機(jī)制中重要的一環(huán).在水稻上,根據(jù)基因組序列預(yù)測的粳稻和秈稻ICK基因各有6個(gè)。目前,除了個(gè)別粳稻ICK基因-Orysa；KRP1和Orysa；KR

2、P3的功能得到驗(yàn)證之外,其它粳稻和秈稻ICK基因的功能分析尚未開展。本研究以秈稻ICK基因?yàn)檠芯繉?duì)象,運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行了蛋白質(zhì)序列聚類、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位和蛋白質(zhì)相互作用分析,并在此基礎(chǔ)上,利用本實(shí)驗(yàn)室自主克隆的一個(gè)表達(dá)強(qiáng)度中等的33kDa分泌蛋白啟動(dòng)子(33kDa secretary protein promoter,33SP)對(duì)其中的一個(gè)秈稻ICK基因進(jìn)行了有限的過量表達(dá)和表型觀察。所獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下
　　 (

3、1)、蛋白質(zhì)序列聚類分析結(jié)果表明:6個(gè)秈稻ICKs和已經(jīng)報(bào)道的粳稻ICKs一樣可以分成兩類,其中,ICK1-4為第一類,ICK5和6為第二類。進(jìn)一步的保守功能域分析結(jié)果顯示:除了基序1和2外,其它3個(gè)基序也都呈現(xiàn)在秈稻ICK蛋白上,唯有ICK4缺失這后3個(gè)基序。另外,除了ICK5之外,其它5個(gè)秈稻ICK蛋白都具有核定位信號(hào)。為了與粳稻ICKs的命名相區(qū)別,我們將秈稻的ICKs依次定名為OsiICK1-6,它們與粳稻ICKs的對(duì)應(yīng)關(guān)系是:

4、OsilCK1／Orysa；KRP1,OsilCK2／Orysa；KRP2,OsilCK3／Orysa；KRP3,OsiICK4／Orysa；KRP6 OsilCK5／Orysa；KRP5和OsilCK6／Orysa；KRP4。本研究選用作過量表達(dá)分析的ICK基因?yàn)镺siICK6,它與功能已知的OsiICK1分屬不同的聚類。
　　 (2)利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)OsiICK6與不同的CDKs及Cyclins的相互作用情況進(jìn)行了分析,

5、結(jié)果表明:當(dāng)用AD-ICKs和BD-CDKs／cyclins共轉(zhuǎn)化酵母菌株May203時(shí),OsiICK1和OsiICK6都可以與CYCD2；1相互作用,但是它們與CDKA；1,CDKB2；1,CYCA2；1,CYCB2；2都沒有相互作用.反過來用BD-ICKs和AD-CDKs／Cyclins共轉(zhuǎn)化酵母時(shí),OsiICK1和OsiICK6都和CYCD2；1有相互作用,同時(shí),OsiICK6與CDKA；1有相互作用,而OsiICKl與CDKA；

6、1不互作。
　　 (3)利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)進(jìn)行的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明:OsiICK1和OsiICK6都定位在核內(nèi),說明他們主要在核內(nèi)起作用。然而,仔細(xì)的觀察發(fā)現(xiàn)OsiICK6在核內(nèi)的分布是不均勻的,成亮點(diǎn)分布,而OsilCK-1在核內(nèi)的分布則比較均勻。
　　 (4)熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明:OsilCK6在檢測的根、莖、葉組織和幼穗和小花器官中都有表達(dá),且在葉片中的表達(dá)量最高。
　　 (5)將

7、33SP驅(qū)動(dòng)的OsilCK6導(dǎo)入秈稻恢復(fù)系明恢63中進(jìn)行有限度的過量表達(dá),結(jié)果顯示:其轉(zhuǎn)化體及其后代植株明顯矮化,葉片交窄外卷,發(fā)育至3核的花粉粒比對(duì)照顯著減少,大量種子不能結(jié)實(shí),或即便結(jié)實(shí),但種子的發(fā)育也出現(xiàn)異常.進(jìn)一步的莖組織縱切和葉組織橫切觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),OsilCK6過表達(dá)植株的細(xì)胞體積增大,但數(shù)目減少.對(duì)葉片進(jìn)行掃描電鏡觀察還發(fā)現(xiàn),OsiICK6過表達(dá)植株的葉片近軸面氣孔比對(duì)照變大,而遠(yuǎn)軸面的變化不大,同時(shí)發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)近軸面的氣孔列也