甲殼動物血藍(lán)蛋白免疫學(xué)活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目前我國是世界上最大的甲殼動物(蝦蟹)集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)國。然而,與國際蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)相比,我國商業(yè)化的蝦蟹養(yǎng)殖整體效益較低,可持續(xù)發(fā)展前景不容樂觀。究其原因,主要與蝦蟹病害和生物安全等有關(guān)。為此,學(xué)者們認(rèn)為選育優(yōu)質(zhì)、抗逆優(yōu)良蝦蟹品種,建立安全、生態(tài)、環(huán)保的健康養(yǎng)殖模式,是解決目前蝦蟹養(yǎng)殖疾病,提高蝦蟹品質(zhì)的有效途徑。要成功解決這些問題,關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一就是揭示蝦蟹自身免疫防御機(jī)制,尋找蝦蟹病害防治的有效方法。近年來研究表明,存在于對蝦等無脊椎動物

2、血淋巴中的血藍(lán)蛋白是一種具有抗病毒和抗細(xì)菌等多種免疫活性的多功能蛋白。本研究以凡納濱對蝦、鋸緣青蟹血藍(lán)蛋白為研究對象,在國內(nèi)外所獲研究結(jié)果的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步對其免疫學(xué)活性及作用機(jī)理等進(jìn)行了深入的研究,所獲研究結(jié)果具體如下:
　　1、發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白抑菌活性與其糖基化修飾有關(guān),且OmpC為其抑菌作用靶標(biāo)之一
　　首先,在本課題組已分離得到的2種糖含量和抑菌活性存在顯著差異的凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白(LHt和LH75)的基礎(chǔ)之上

3、,本研究采用凝集素印跡、Tricine-SDS-PAGE和HPLC等技術(shù),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)LH75、LHt糖基化修飾存在顯著性差異,其中前者α-D-甘露糖、α-D-葡萄糖修飾程度比后者高;前者胰酶水解肽段分子量明顯高于后者;前者胰酶酶解HPLC圖譜表現(xiàn)為10個峰,而后者為24個峰。同時,2-DE顯示,LHt主要蛋白點(diǎn)為7個,大小亞基分別為3和4個點(diǎn),LH75主要蛋白點(diǎn)為6個,大小亞基分別為4和2個點(diǎn)。由此說明該2種血藍(lán)蛋白不僅在蛋白質(zhì)水平存在

4、差異,其糖基化修飾也存在差異。
　　繼而,選用副溶血弧菌人工感染對蝦,發(fā)現(xiàn)對蝦刺激后蝦血清中LHt、LH75表達(dá)均呈上升趨勢,且LH75上升幅度明顯高于LHt。結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)LH75抑菌活性顯著高于LHt抑菌活性的研究結(jié)果,提示LH75可能是血藍(lán)蛋白發(fā)揮抑菌作用的重要組分,其抑菌活性應(yīng)該與糖基化修飾有關(guān)。
　　最后,利用親和孵育獲得3種與LH75相結(jié)合的副溶血弧菌外膜蛋白(Omp),p1、p2和p3,經(jīng)質(zhì)譜鑒定p2為Omp

5、C,根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)LH75對外膜蛋白敲除菌△OmpC的抑菌活性明顯降低的結(jié)果,推測OmpC應(yīng)為為LH75抑菌作用靶標(biāo)之一,至于其是否還存在其他作用靶標(biāo)還有待于進(jìn)一步研究和證實(shí)。
　　2、發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍(lán)蛋白具有凝集活性,凝集作用靶標(biāo)為OmpA和OmpX
　　首先,采用親和蛋白質(zhì)組學(xué)策略,發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍(lán)蛋白由分子量分別為70、72、75、76、80kDa的5個亞基組成,其與岸蟹(Carcinusaestuarii)、藍(lán)蟹(

6、Callinectessapidus)和黃道蟹(Cancermagister)血藍(lán)蛋白亞基具有高度的同源性,且3個主要亞基(p75、p76和p80)與兔抗蝦血藍(lán)蛋白抗血清呈顯著陽性,說明所獲得的青蟹血藍(lán)蛋白成分單一、可靠,適合于進(jìn)一步研究。
　　繼而,采用凝集實(shí)驗(yàn)和凝集抑制實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)青蟹血藍(lán)蛋白對副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌K12和金黃色葡萄球菌等7種細(xì)菌具有凝集活性,且其凝集活性能被葡萄糖、

7、半乳糖、木糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸部分或完全抑制。說明青蟹血藍(lán)蛋白確實(shí)具有凝集活性。
　　最后,運(yùn)用SDS-PAGE、Western-blotting、凝集抑制實(shí)驗(yàn)、基因敲除凝集實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)青蟹血藍(lán)蛋白凝集活性作用亞基為76kDa亞基;大腸桿菌Omp能夠抑制血藍(lán)蛋白對7種細(xì)菌的凝集活性;與大腸桿菌K12野生菌株相比,血藍(lán)蛋白對△OmpA和Omp△X凝集活性明顯降低。由此推測,青蟹血藍(lán)蛋白可能主要依賴其76kDa亞基,通過與病原菌OmpA

8、和OmpX相結(jié)合而發(fā)揮凝集活性。3、發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍(lán)蛋白具有溶血活性,溶血作用機(jī)制為膠體滲漏機(jī)制
　　采用溶血實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍(lán)蛋白對雞、鼠、兔、人等多種紅細(xì)胞表現(xiàn)出依賴于鈣離子的溶血活性。其溶血活性具有“劑量-效應(yīng)”效應(yīng),同時對pH、溫度敏感,在pH5-8范圍內(nèi),溶血活性隨pH上升而降低;隨著溫度的升高,溶血活性逐漸增強(qiáng),37℃時溶血活性達(dá)到100％。
　　在上述研究的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步采用SDS-PAGE、Western

9、-blotting、滲透保護(hù)實(shí)驗(yàn)等,發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹血藍(lán)蛋白5個亞基均可與紅細(xì)胞膜相結(jié)合,且青蟹溶血活性隨著滲透保護(hù)劑分子的增大而降低。由此推測,青蟹血藍(lán)蛋白可能依賴其全部亞基通過膠體滲漏機(jī)制而發(fā)揮溶血活性。
　　綜上所述,本課題研究主要發(fā)現(xiàn):甲殼動物(蝦、蟹)血藍(lán)蛋白具有凝集活性、抑菌活性和溶血活性,其中凝集、抑菌活性作用靶標(biāo)為細(xì)菌外膜蛋白,溶血作用機(jī)制為膠體滲漏機(jī)制。所獲研究結(jié)果為揭示血藍(lán)蛋白的免疫學(xué)分子作用機(jī)制,闡明血藍(lán)蛋白與病