小溪自然保護(hù)區(qū)非鹽環(huán)境土壤嗜鹽和耐鹽菌多樣性研究.pdf

1、本研究從湖南小溪國家級自然保護(hù)區(qū)采集普通非鹽環(huán)境(ordinary non-saline environment)土壤樣品,用純培養(yǎng)法(culture-dependent method)分離其中的嗜鹽和耐鹽原核生物,進(jìn)而采用基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogenetic analysis)方法研究這些分離菌株的多樣性,并對分離菌株進(jìn)行抗菌活性篩選,以及對部分代表潛在新分類單元(potential new taxa)的

2、菌株進(jìn)行系統(tǒng)分類學(xué)(systematic taxonomy)研究,以期初步了解小溪自然保護(hù)區(qū)非鹽土壤(non-saline soil)樣品中的可培養(yǎng)嗜鹽和耐鹽細(xì)菌多樣性,并從中發(fā)現(xiàn)一批具有開發(fā)潛力的抗菌物質(zhì)產(chǎn)生菌株,以及利用多相分類方法(polyphasic taxonomic approach)確定部分潛在新類群的分類地位,為深入開展普通非鹽環(huán)境中的嗜鹽和耐鹽原核生物資源的研究、保護(hù)及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
　　用補(bǔ)充5～20％(w

3、/v)NaCl的MA、ISP2、ISP5、NA和HAA培養(yǎng)基從湖南小溪國家級自然保護(hù)區(qū)非鹽環(huán)境土壤樣品中分離到114株細(xì)菌(含放線菌)菌株,其中18株為中度嗜鹽菌,8株為輕度嗜鹽菌,88株為耐鹽菌。根據(jù)形態(tài)觀察和部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果去冗余,選取61個代表性菌株進(jìn)行基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析。結(jié)果表明,這些分離菌株屬于3個大的系統(tǒng)發(fā)育類群 (門;phylum)(Actinobacteria,Firmicutes,Pro

4、teobacteria) 的16個科(Alteromonadaceae,Bacillaceae,Brevibacteriaceae,Chromatiaceae,Dermabacteraceae,Enterobacteriaceae,Microbacteriaceae,Micrococcaceae,Nocardiaceae,Planococcaceae,Pseudomonadaceae,Sphingomonadaceae,Staphylo

5、coccaceae,Streptomycetaceae,Thermomonosporaceae,Yaniellaceae)、18個屬(Actinomadura,Arthrobacter,Bacillus,Brachybacterium,Brevibacterium,Erwinia,Halobacillus,Jeotgalibacillus,Microbacterium,Microbulbifer,Nocardia,Pseudomonas

6、,Rheinheimera,Rhodococcus,Sphingomonas, Staphylococcus,Streptomyces,Yaniella),代表了41個物種。多數(shù)菌株屬于Firmicutes門(38株,62.3%),其中芽孢桿菌科(Bacillaceae)菌株有33株(54.1%),為優(yōu)勢科,Bacillus屬(29株;47.5%)為優(yōu)勢屬;其次是Actinobacteria門(18株,29.5%)和Proteobact

7、eria門(5株,8.2%)。Shannon-winner多樣性指數(shù)(H)為3.4968,均勻度指數(shù)(E)為0.9416,表明湖南小溪國家級自然保護(hù)區(qū)普通非鹽環(huán)境土壤中可培養(yǎng)嗜鹽及耐鹽菌具有較高的物種多樣性和均勻度。大多數(shù)菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的已知物種的典型菌株之間存在一定的遺傳差異(16S rRNA基因序列相似性為96.9%～99.8%),其中有7個菌株(JSM070026, JSM 081004,JSM081006,JSM08

8、1008,JSM083058, JSM083085和JSM084035)代表7個潛在新種(potential novel species)。
　　以8個敏感菌株(3株革蘭氏陽性菌、3株革蘭氏陰性菌和2株真菌)作為指示菌,采用管碟法對分離菌株進(jìn)行抗菌活性篩選,并對抗菌活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行了基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和生物學(xué)特性研究。結(jié)果顯示,114個受試菌株中有74株的發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性,陽性率為64.9%,其中9個菌

9、株的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性較強(qiáng)、抗菌譜較廣。綜合分析形態(tài)特征、生理生化特征和基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析數(shù)據(jù),結(jié)果表明,9株具有較強(qiáng)抗菌活性的菌株分別屬于Bacillus屬(JSM081049,JSM082021-1,JSM082056,JSM082080,JSM082081-1,JSM082097)、Arthrobacter屬(JSM082018)、Brachybacterium屬(JSM082044)和Streptomyces

10、屬(JSM082030)。
　　運(yùn)用多相分類方法對部分潛在新分類單元進(jìn)行了系統(tǒng)分類學(xué)研究。綜合分析表型特征、化學(xué)分類特征、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果和DNA-DNA雜交數(shù)據(jù),確立了4個分離菌株的分類地位,即菌株JSM070026、JSM081004、JSM081008和JSM083058已經(jīng)被確定分別代表了4個屬的4個新種,分別被命名為土壤閻氏菌(Yaniella soli),小溪芽孢桿菌(Bacillus xiaoxiensis),土壤泡