轉(zhuǎn)基因香石竹遺傳穩(wěn)定性及其對(duì)土壤微生物群落影響初探.pdf

1、香石竹是一種重要的觀賞類園藝植物。為提高其觀賞價(jià)值，澳大利亞Florigene公司和日本Suntory公司通過轉(zhuǎn)基因方法，將二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavono1-4-Reductase，DFR）基因和類黃酮-3’，5’-羥化酶（flavonoid-3’，5’-Hydroxylase，F(xiàn)3'5'H）基因?qū)氲桨咨闶馞E123中，獲得了花色呈藍(lán)紫色的轉(zhuǎn)基因香石竹，月之霓裳“Moonshadc”和月之伊人“Moonlit

2、e”是其中兩個(gè)品系。
　　 由于轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境釋放可能存在著潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全評(píng)估十分必要。轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的遺傳穩(wěn)定性，以及轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)可能存在的影響是評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全性的重要組成部分。作為在中國進(jìn)行環(huán)境安全評(píng)價(jià)中間試驗(yàn)的第一例轉(zhuǎn)基因花卉，本文對(duì)轉(zhuǎn)基因香石竹中的外源基因.F3'5'H的遺傳穩(wěn)定性，以及轉(zhuǎn)基因香石竹的栽培對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響這兩方面進(jìn)行了初步探討。<

3、br>　　 針對(duì)雜交矮牽牛中的F3'5'H全長基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，經(jīng)克隆獲得轉(zhuǎn)基因香石竹中的F3'5' H全長基因約1.5 kb。經(jīng)序列比對(duì)，獲得的F3'5'H序列與已報(bào)道的雜交矮牽牛中的F3'5' H序列同源性為100％。構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，獲得了工程菌株E.coli BL21（DE3）（+F3'5'H），經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，該菌株高效表達(dá)出F3'5'H重組蛋白，約占菌體總蛋白的30％。用經(jīng)純化的F3

4、'5'H重組蛋白作為抗原制備抗血清，經(jīng)ELISA免疫學(xué)分析表明，該抗血清的滴度為1:25600。Western blot結(jié)果表明F3'5'H重組蛋白具有良好的IgG結(jié)合活性，且抗血清與轉(zhuǎn)基因香石竹品系Moonshade和Moonlite中的外源基因F3'5'H所表達(dá)的蛋白發(fā)生明顯的抗原抗體反應(yīng)。
　　 采用菌落計(jì)數(shù)法對(duì)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因香石竹植株的根系土壤微生物進(jìn)行了數(shù)量分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因香石竹與非轉(zhuǎn)基因香石竹根系土壤中2大類微

5、生物（細(xì)菌和真菌）的數(shù)量存在一些差異，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明差異不顯著，說明轉(zhuǎn)基因香石竹尚未對(duì)土壤微生物的數(shù)量造成顯著影響。
　　 比較了試驗(yàn)室手提法和試劑盒法提取土壤基因組DNA的效果。結(jié)果表明，手提法所得DNA量要高于試劑盒法，但是純度不及試劑盒法，且耗時(shí)長，步驟繁瑣。因此最終采用試劑盒法完成后續(xù)試驗(yàn)。
　　 通過16S rDNA克隆文庫分析方法，比較了轉(zhuǎn)基因香石竹和非轉(zhuǎn)基因香石竹土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的文庫

6、的細(xì)菌多樣性十分豐富，存在8個(gè)主要類群，其中轉(zhuǎn)基因香石竹和非轉(zhuǎn)基因香石竹土壤共有的優(yōu)勢菌群有α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）。在轉(zhuǎn)基因香石竹土壤中得到少量的疣微菌門（Verrucomicrobia）相似株，其余3個(gè)菌群在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因香石竹土壤中都有分布。總體來說，轉(zhuǎn)基因香石竹和