酯酶在錦鈴蟲氰戊菊酯和久效磷抗性中的作用.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Hübner)(Lepidoptera:Noctuidae)屬鱗翅目夜蛾科害蟲,廣泛分布在南緯40°至北緯40°之間。棉鈴蟲食性雜,寄主包括棉花、玉米、小麥、蔬菜等多種農(nóng)作物,在亞洲、大洋洲、非洲和歐洲均有為害報道。在防治棉鈴蟲的過程中,大量使用殺蟲劑,世界各地相繼報道棉鈴蟲對有機磷類、氨基甲酸酯類及擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。在棉鈴蟲對擬除蟲菊酯的抗性機理中,大量研究集中于細胞色素P4

2、50介導(dǎo)的氧化解毒代謝。在棉鈴蟲對有機磷的抗性機理中,解毒代謝增強及乙酰膽堿酯酶敏感性下降的相對作用還不清楚。有關(guān)酯酶在棉鈴蟲對擬除蟲菊酯及有機磷抗性中的作用還缺乏深入研究。
　　 本文通過對抗性品系中活性升高的酯酶同工酶進行分離純化及質(zhì)譜鑒定,系統(tǒng)研究了酯酶在棉鈴蟲氰戊菊酯抗性中的作用。結(jié)果表明棉鈴蟲氰戊菊酯抗性涉及到多個CCE001家族基因,且抗性品系中CCE001家族酯酶基因在解毒代謝組織中的過量表達與棉鈴蟲氰戊菊酯抗性相

3、關(guān)。酯酶在棉鈴蟲對久效磷的抗性中也起著重要作用。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.棉鈴蟲氰戊菊酯抗性相關(guān)酯酶同工酶的分離純化及對氰戊菊酯的離體水解
　　 棉鈴蟲氰戊菊酯抗性品系YGF3齡幼蟲的酯酶活性是敏感品系SCD的1.9倍,同時在YGF品系中存在更多具有高酯酶活性的個體。YGF品系與SCD品系酯酶Native PAGE圖譜也有差異,特別是遷移率為0.4和0.35兩個區(qū)域的酯酶同工酶(以下命名為A組和B組)顯現(xiàn)出染色強度的

4、顯著不同。在YGF品系中A組酯酶的染色強度是SCD品系的4.9倍,B組是SCD品系的12.7倍。YGF品系中這兩組酯酶同工酶都能水解氰戊菊酯類似物,但在SCD品系的相同區(qū)域幾乎沒有染色反應(yīng)。A組及B組酯酶活性升高可能與棉鈴蟲對氰戊菊酯的抗性有關(guān)。
　　 利用離心、硫酸銨分級沉淀、凝膠過濾層析及離子交換層析技術(shù)對YGF品系中A組和B組酯酶同工酶進行分離純化。A組酯酶純化倍數(shù)達50倍,回收率為0.13％。A組酯酶的純化產(chǎn)物在酯酶Na

5、tive-PAGE上顯現(xiàn)為一條主要的同工酶帶,在SDS-PAGE上顯現(xiàn)為一條主要蛋白帶,分子量約為60kDa。這是真核生物典型的單聚體羧酸/膽堿酯酶分子。純化后的A組及B組酯酶均可離體水解氰戊菊酯,A組酯酶水解氰戊菊酯更迅速。
　　 2.棉鈴蟲氰戊菊酯抗性相關(guān)酯酶同工酶的質(zhì)譜鑒定及基因克隆
　　 通過液質(zhì)聯(lián)用鑒定出A組酯酶蛋白含有四種同工酶,分別為CCE001a、-d、-i和j,其中CCE001a在A組酯酶中蛋白豐度最高

6、。在YGF和SCD品系中擴增了CCE001a,-d,-i和-j基因的全長cDNA,四個酯酶基因由堿基序列推導(dǎo)的氨基酸序列都含有維持酯酶功能的催化三聯(lián)體及氧陰離子洞,屬于羧酸酯酶。四個酯酶基因編碼的氨基酸序列在YGF及SCD品系間都存在一些差異,這些差異可能是氨基酸多態(tài)性而與棉鈴蟲菊酯抗性無關(guān)。
　　 3.棉鈴蟲氰戊菊酯抗性和敏感品系CCE001家族酯酶基因轉(zhuǎn)錄水平的比較
　　 采用實時定量PCR技術(shù)檢測YGF和SCD品系

7、中CCE001a,-d,-i和-j的轉(zhuǎn)錄水平。四個CCE001家族酯酶基因在YGF品系中腸及脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平均高于SCD品系,特別是豐度最高的CCE001a酯酶,其在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平是敏感品系的90倍。抗性品系YGF中CCE001家族酯酶基因在解毒代謝組織中的過量表達與YGF品系對氰戊菊酯的抗性有關(guān)。
　　 4.酯酶在棉鈴蟲久效磷抗性中的作用
　　 相對SCD敏感品系,室內(nèi)篩選的棉鈴蟲久效磷抗性品系A(chǔ)YR對久效磷的抗

8、性達到137倍。DEF對久效磷的增效作用達到27倍,PBO及DEM沒有明顯增效作用。AYR品系中非特異性酯酶的活力是SCD敏感品系的1.4倍,且差異達到顯著水平。兩品系間多功能氧化酶及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性差異不顯著。因此,酯酶活性升高可能是棉鈴蟲AYR品系對久效磷產(chǎn)生抗性的主要機理。
　　 5.棉鈴蟲久效磷抗性和敏感品系乙酰膽堿酯酶生化特性及基因克隆
　　 在AYR和SCD品系中,久效磷對乙酰膽堿酯酶的抑制中濃度(Ⅰ5

9、0)分別是0.011和0.007 mg·ml-1(差異不顯著)；抗性品系和敏感品系間乙酰膽堿酯酶酶動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax也無顯著差異。利用鱗翅目昆蟲ace1基因某些結(jié)構(gòu)域的保守性設(shè)計簡并引物,擴增到棉鈴蟲acel基因全長cDNA。棉鈴蟲acel基因含有2085bp開放閱讀框,編碼695氨基酸殘基。同時在前人研究的基礎(chǔ)上擴增了棉鈴蟲的ace2基因。從棉鈴蟲ace1和ace2基因的全長推導(dǎo)其氨基酸序列,兩個ace基因在抗性和敏感品系間均有