銀杏葉中七種活性成份的HSCCC制備.pdf

1、銀杏(Ginkgo Biloba L.)為現(xiàn)存古代孑遺植物，藥用范圍廣泛，在中藥應(yīng)用中有悠久的歷史。銀杏葉主要活性成分為銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯，銀杏黃酮可抵抗自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、擴(kuò)張血管、改善腦動(dòng)脈，對(duì)老年癡呆、高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化、腦功能障礙等疾病有防治作用；銀杏內(nèi)酯是血小板活化因子拮抗劑，具有一定程度的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，在治療哮喘、內(nèi)毒素休克、器官移植排異、心腦血管疾病等方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 銀杏黃酮主要成分為

2、槲皮素、異鼠李素和山奈酚，銀杏內(nèi)酯則主要包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯。這七種化合物不僅是銀杏提取物中具有藥理作用的活性成分，同時(shí)也是銀杏葉制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，國(guó)內(nèi)外銀杏葉制劑的質(zhì)量檢測(cè)則以此七種成分為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)黃酮和銀杏內(nèi)酯的含量。隨著中藥質(zhì)量檢測(cè)的日益完善以及銀杏葉單一藥用成分研究的日益增多，對(duì)這七種化合物單一純品的需求越來(lái)越大。
　　 傳統(tǒng)的分離純化方法主要有溶劑萃取法和柱色譜法。但3種黃酮、4種內(nèi)酯均為化學(xué)類似物，

3、彼此的化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性很相似，單純以溶劑萃取結(jié)晶，很難得到高純度的內(nèi)酯或黃酮單體；普通的柱色譜技術(shù)也不易分離得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95％的單品；而且傳統(tǒng)的分離方法工藝復(fù)雜、純化步驟多、樣品損耗大、成本較高。高速逆流色譜(HSCCC)是近十幾年發(fā)展起來(lái)的新型液-液分配技術(shù)，具有回收率高、進(jìn)樣量大、分離能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外已有將其應(yīng)用于黃酮類和萜內(nèi)酯分離與純化的報(bào)道。3種黃酮成分中，異鼠李素和山奈酚化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性極為相似，很難分離。經(jīng)一次

4、高速逆流色譜，可將槲皮素與異鼠李素、山奈酚分開(kāi)，但后兩者不能分離；Fuquan Yang等利用多維高速逆流色譜分離異鼠李素和山奈酚取得了較好的效果，但需要兩臺(tái)高速逆流色譜儀串聯(lián)使用，一般實(shí)驗(yàn)室難以做到。余佳紅等利用高速逆流色譜以氯仿-甲醇-水為溶劑體系從銀杏葉提取物中分離得到白果內(nèi)酯單體，但未能分離其它三種內(nèi)酯成分。
　　 本文則以銀杏葉為原料，篩選了銀杏葉粗取物的制備工藝，分別制備了較高純度的總黃酮粗提物和總內(nèi)酯粗提物；利用高

5、速逆流色譜(HSCCC)從總黃酮粗提物中分離得到了槲皮素單體；首次嘗試?yán)醚h(huán)高速逆流色譜(循環(huán)HSCCC)在一臺(tái)高速逆流色譜儀上將難以分離的異鼠李素和山奈酚分開(kāi)，從總黃酮粗提物中高回收率地得到了異鼠李素和山奈酚單體；并利用高速逆流色譜從總內(nèi)酯粗提物中分離得到了白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C四種內(nèi)酯單體，其中銀杏內(nèi)酯A、B、C單體是首次利用高速逆流色譜技術(shù)獲得；本文主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴制備槲皮素單體：利用高效液相色譜

6、(HPLC)測(cè)定了銀杏葉中總黃酮含量為1.16％，其中槲皮素的含量為0.5％。銀杏葉烘干粉碎，70％乙醇超聲提取，氯仿萃取，D101大孔吸附樹(shù)脂純化，得總黃酮粗提物，總黃酮含量大于24％；利用HSCCC以正己烷：乙酸乙酯∶甲醇∶水(5.5∶4.5∶5∶5)為溶劑體系，從總黃酮粗提物中分離得到了槲皮素單體，最高純度達(dá)98.6％
　　 ⑵制備異鼠李素和山奈酚單體：經(jīng)上述HSCCC，可將槲皮素與異鼠李素和山奈酚分開(kāi)，但后兩者由于結(jié)構(gòu)和

7、極性極為相近，不能分離。在此基礎(chǔ)上采用循環(huán)HSCCC法，即簡(jiǎn)單的利用一臺(tái)高速逆流色譜儀將難以分離的異鼠李素和山奈酚的混合物作為樣品，以正己烷：乙酸乙酯∶甲醇∶水(5∶5∶5∶5)為溶劑體系，進(jìn)樣后將檢測(cè)器出口與輸液泵入口相連接，再次將待分離部分泵入主機(jī)中進(jìn)行分離，循環(huán)三次后，異鼠李素和山奈酚達(dá)到了很好的分離，得到兩者的單體，最高純度均在97％以上。
　　 ⑶制備白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C單體：銀杏葉烘干粉碎，經(jīng)25％乙醇熱提取

8、、醋酸乙酯萃取、D-101大孔吸附樹(shù)脂柱和pH4.0的Al2O3柱純化，得總內(nèi)酯粗提物，總內(nèi)酯含量達(dá)44.98％。以總內(nèi)酯粗提物為樣品，以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶5∶3∶5)為溶劑體系，經(jīng)HSCCC分離得到白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B單體，最高純度分別達(dá)98.3％、98.9％和98.8％；利用上述溶劑體系，銀杏內(nèi)酯C和雜質(zhì)不能很好分離，收集含銀杏內(nèi)酯C和雜質(zhì)的餾分濃縮后作為樣品，以正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(2:6∶3∶5)為溶劑體