蝶蛹金小蜂熱激蛋白及其體內(nèi)共生菌Wolbachia分子分型的研究.pdf

1、熱激蛋白(HeatShockProteins，Hsps)又稱熱休克蛋白或應(yīng)激蛋白(HeatStressProteins，Hsps)，是普遍存在于原核和真核生物中的一類遺傳上高度保守的蛋白。Hsps的表達(dá)和調(diào)控系統(tǒng)是生物有機(jī)體對多種環(huán)境脅迫因子產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)達(dá)到自我保護(hù)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。Wolbachia是廣泛分布于節(jié)肢動物體內(nèi)的一類細(xì)胞質(zhì)遺傳共生菌，它參與了多種調(diào)控其宿主生殖活動的機(jī)制，包括誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)不親和(CI)、誘導(dǎo)孤雌生殖(PI)、雄

2、性致死和雌性化。本研究克隆了蝶蛹金小蜂體內(nèi)6個hsps基因，并對其誘導(dǎo)表達(dá)模式及功能進(jìn)行了深入研究。另外，本研究還通過克隆和分析采自中國13個地理蝶蛹金小蜂體內(nèi)Wolbachia的wsp、ftsZ和16SRNA基因?qū)ζ涓腥镜腤olbachia進(jìn)行了分子分型研究。現(xiàn)將主要結(jié)果概括如下： 1、蝶蛹金小蜂hsps基因的克隆及其序列分析通過數(shù)據(jù)庫檢索、PCR/RT-PCR、RACE和文庫篩選等分子手段，共克隆了蝶蛹金小蜂6個熱激蛋白成員

3、，涉及了5個熱激蛋白家族。 Pphsp90基因ORF長為2148bp，推測編碼716個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為82.2kDa，編碼區(qū)內(nèi)不含內(nèi)含子。Pphsc70-1基因ORF長為1968bp，推測編碼656個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為71.3kDa，該基因含有3個內(nèi)含子。Pphsc70-2基因ORF長為1923bp，推測編碼641個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為70.9kDa，編碼區(qū)內(nèi)含有1個內(nèi)含子。Pphsp60基因ORF長為1719

4、bp，推測編碼573個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為60.6kDa，編碼區(qū)內(nèi)含有3個內(nèi)含子。Pphsp40基因ORF長為1095bp，推測編碼365個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為39.6kDa。Pphsp20基因ORF長為573bp，推測編碼191個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為21.7kDa。 2、不同逆境脅迫對蝶蛹金小蜂體內(nèi)hsps基因表達(dá)的影響采用TaqMan-MGB探針和特異性引物構(gòu)建了6個Pphsps基因?qū)崟r(shí)熒光定量RT-PCR檢測體

5、系。利用熒光定量RT-PCR方法，檢測了蝶蛹金小蜂成蟲6個Pphsps基因在高溫(30～42℃處理th)、低溫(3～-15℃處理1h)、饑餓(0～24h)及重金屬(0.5～5mMCd2+/Cu2+處理24h或60h)等4種逆境脅迫下mRNA的表達(dá)情況。 在高溫脅迫下，6個Pphsps基因均能被誘導(dǎo)；其中，Pphsp20、Pphsp60、Pphsc70-2和Pphsp90表達(dá)量在36℃達(dá)到頂峰，而Pphsp40和Pphsc70-1

6、表達(dá)量在39℃才達(dá)到最高峰。 在低溫脅迫下，除Pphsp60基因外，其它5個基因均能被低溫脅迫所誘導(dǎo)，并且其表達(dá)量均在-3℃時(shí)達(dá)到最高峰。 在饑餓脅迫下，Pphsp40和Pphsc70-2誘導(dǎo)前后無顯著變化；Pphsp20表達(dá)量在饑餓6h時(shí)就顯著上升，其后隨饑餓時(shí)間延長，表達(dá)量逐漸下降，甚至降至正常水平以下；Pphsp60、Pphsc70-1和Pphsp90表達(dá)量均在24h顯著升高。 在重金屬Cd2+脅迫下，處理

7、24h后，Pphsp40表達(dá)量隨Cd2+濃度的升高而持續(xù)升高，而其它5個基因呈先顯著上升，其后，隨Cd2+濃度的升高，表達(dá)量呈下降趨勢；處理60h后，Pphsp40表達(dá)量隨處理濃度的升高而升高；Pphsp60表達(dá)量在Cd2+濃度為0.5mM時(shí)顯著上升，而后隨Cd2+濃度升高其表達(dá)量恢復(fù)至對照水平；Pphsc70-1表達(dá)量在Cd2+濃度為50mM時(shí)顯著上升；其它Pphsps表達(dá)量與對照相比無明顯差異或顯著低于對照水平。 在重金屬C

8、u2+脅迫下，處理24h后，Pphsp40和Pphsc70-2表達(dá)量隨處理Cu2+濃度的升高而升高，其它4個基因表達(dá)量隨處理Cu2+濃度的升高呈先上升后下降趨勢；處理60h后，與對照相比，僅0.5mM的Cu2+能夠誘導(dǎo)Pphsp20和Pphsp90表達(dá)量分別上升1.32倍和1.30倍，而大多Pphsps表達(dá)量接近于或低于對照水平。 此外，還采用實(shí)時(shí)定量PCR方法(SYRBGreen染料法)檢測了蝶蛹金小蜂蛹期Pphsc70-1在

9、40℃熱激脅迫0～8h及恢復(fù)1h或2h后的表達(dá)情況。結(jié)果表明，熱處理1h后Pphsc70-1表達(dá)量顯著上升，然而持續(xù)的熱激或熱激恢復(fù)使其誘導(dǎo)的mRNA表達(dá)量逐漸降低，甚至顯著低于對照水平。 3、蝶蛹金小蜂hsps基因在昆蟲細(xì)胞和原核細(xì)胞中表達(dá)采用的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功地將6個Pphsps基因在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。亞細(xì)胞定位分析表明6個基因的表達(dá)產(chǎn)物均位于細(xì)胞核外的細(xì)胞質(zhì)中。 采用pET28a表達(dá)載體

10、將6個Pphsps基因在表達(dá)菌株BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)，其中，Pphsp90、Pphsc70-1、Pphsc70-2、Pphsp60和Pphsp20等5個基因在該系統(tǒng)中都得到了不同程度的表達(dá)，且它們產(chǎn)生的融合表達(dá)蛋白基本上以可溶的形式存在。而Pphsp40基因在該系統(tǒng)中沒有表達(dá)成功。 4、蝶蛹金小蜂Hsps表達(dá)產(chǎn)物的純化及其功能初探為了研究PpHsps的分子伴侶功能，本實(shí)驗(yàn)研究了過表達(dá)PpHsps對E.coli細(xì)胞在高

11、溫下的存活率及E.coli細(xì)胞內(nèi)蛋白熱穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，雖然PpHsp90、PpHsc70-1.PpHsc70-2、PpHsp60和PpHsp20融合蛋白對高溫下E.coli細(xì)胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定性具有一定的保護(hù)作用，但僅PpHsp20和PpHsp90對E.coli細(xì)胞在高溫下的存活有保護(hù)作用。因此，我們采用Ni-NTA樹脂分別對PpHsp20和PpHsp90融合蛋白進(jìn)行分離純化，研究了PpHsp20和PpHsp90對熒光素酶的高溫保護(hù)

12、能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PpHsp20可以在一定程度上抑制高溫引起的熒光素酶的聚集現(xiàn)象。 5、蝶蛹金小蜂體內(nèi)Wolbachiawsp.ftsZ和16SRNA基因的克隆及其在不同地理種群中的差異13地理種群的蝶蛹金小蜂均感染B-Wolbachia。分析從13個地理種群中獲得序列，共發(fā)現(xiàn)4條wsp基因差異序列(wPup1、wPup2、wPup3和wPup4)、2條ftsZ基因差異序列(fPup1和fPup2)和2條16SrRNA差異序列(16