蝶蛹金小蜂卵黃發(fā)生與卵子發(fā)生的生理與分子基礎(chǔ).pdf

1、本論文選擇了菜粉蝶Pieris rapae蛹期的優(yōu)勢內(nèi)寄生蜂——蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum作為研究對(duì)象，在制備該蜂V<,t>單克隆抗體和解析Vg cDNA序列的基礎(chǔ)上，分別從生理生化、細(xì)胞和分子水平對(duì)其卵黃發(fā)生、卵子發(fā)生和生殖調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。主要結(jié)果概括如下： 1．Vt的純化與生化特性 非變性PAGE電泳結(jié)果表明，在雌蜂的血淋巴中和成熟卵內(nèi)存在一條雌性特異蛋白條帶，而在雄蜂的血淋巴中未發(fā)現(xiàn)相

2、對(duì)應(yīng)的條帶，該蛋白條帶能被脂蛋白、糖蛋白和磷酸化蛋白特異性染色。因此推測此雌性特異條帶為該蜂的Vt，而雌蜂血淋巴中對(duì)應(yīng)的為Vg，其天然分子量約為370 kDa。SDS-PAGE分析表明，Vg/Vt是由分子量分別約為205和165kDa的兩個(gè)亞基組成。通過P-100凝膠過濾層析和Q-1陰離子交換層析的方法，從卵內(nèi)可溶性蛋白中純化出vt。雙向電泳分析表明，成熟卵內(nèi)可溶性蛋白約由118個(gè)點(diǎn)組成，等電點(diǎn)主要集中于5～8.5之間，分子量主要集中于

3、130～250 kDa和25～50 kDa兩個(gè)范圍，Vt約占到總蛋白的50～70％，Vt兩個(gè)亞基的等電點(diǎn)均約為8.2。 2．Vt單克隆抗體的制備與應(yīng)用方法的建立 采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，分別制備得4株能穩(wěn)定分泌抗蝶蛹金小蜂vt的單克隆抗體(mAb)，即PpVt mAb1、PpVt mAb2、PpVt mAb3和PpVt mAb4。4株單抗分別制取了腹水，其腹水上清的效價(jià)均達(dá)到10<'5>以上，且對(duì)PpVt mAbl的腹水進(jìn)行

4、了純化。4株單抗免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的亞類均為IgG1和κ類型。 不同組織的Western免疫印跡結(jié)果表明，mAb不僅特異性識(shí)別卵巢內(nèi)Vt，而且識(shí)別雌蜂血淋巴中Vg，但與雄蜂血淋巴無反應(yīng)，可以用于Vg/Vt的定性或定量檢測。通過對(duì)直接ELISA、間接ELISA、異種雙抗夾心ELISA和異源雙抗夾心ELISA方法的比較，確定了微量檢測蝶蛹金小蜂體內(nèi)Vg/Vt的最適ELISA方法，即異源雙夾心ELISA法。該方法可用于單頭雌蜂體內(nèi)

5、Vg/Vt的定量檢測，其檢測靈敏度約為20 ng/mL。 3．卵巢發(fā)育與卵黃發(fā)生 蝶蛹金小蜂的卵巢由3對(duì)卵巢管組成。在羽化后的48h內(nèi)，該蜂的卵巢管由透明、細(xì)絲狀變?yōu)槌錆M成熟卵的飽滿狀。該蜂血．淋巴中Vg的出現(xiàn)始于隱成蟲期，其含量在羽化后24 h內(nèi)快速增加，從剛羽化時(shí)的170 ng/female增加到24 h的580 ng/female，隨后便開始減浙江大學(xué)博士論文：蝶蛹金小蜂卵黃發(fā)生與卵子發(fā)生的生理與分子基礎(chǔ)少，但是，

6、48 h后又開始增加。雌蜂羽化時(shí)，卵母細(xì)胞即開始攝取Vg，卵巢內(nèi)Vt開始沉積。羽化后48 h內(nèi)其含量快速增長，且在48 h，達(dá)到最高，約為4.51μg/female，而后則開始減少，到72 h，僅有3.9μg/female。此外，卵巢內(nèi)Vt的含量與卵巢發(fā)育進(jìn)度存在顯著的相關(guān)性。 4．卵子發(fā)生及其細(xì)胞凋亡 根據(jù)卵子的形態(tài)變化可將蝶蛹金小蜂的卵子發(fā)生分為5個(gè)時(shí)期，即卵室(egg chamber)形成期(S1)、滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母

7、細(xì)胞分化期(S2)、滋養(yǎng)細(xì)胞快速增長期(S3)、卵母細(xì)胞快速增長期(S4)和卵子成熟期(S5)。該蜂的生殖細(xì)胞囊(cyst)由1個(gè)卵母細(xì)胞和15個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞，以及周圍的濾泡細(xì)胞構(gòu)成。細(xì)胞間主要通過F-actin為基礎(chǔ)的細(xì)胞骨架連接，滋養(yǎng)細(xì)胞與卵母細(xì)胞通過營養(yǎng)管(nutritive appendix)相互連接。采用激光共聚焦顯微技術(shù)、冷凍切片技術(shù)和細(xì)胞免疫定位技術(shù)研究表明，卵母細(xì)胞對(duì)Vg的攝取主要發(fā)生在S3時(shí)期，而滋養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到卵

8、母細(xì)胞主要是發(fā)生在S4時(shí)期。TUNEL，和PI雙染色的結(jié)果表明：滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡始于S4前期，至S4中期，其大多數(shù)處于凋亡狀態(tài)，到S4后期大部分滋養(yǎng)細(xì)胞已經(jīng)死亡，只有少數(shù)尚處在凋亡狀態(tài)。卵母細(xì)胞周圍濾泡細(xì)胞的凋亡，始于S4后期。對(duì)s5時(shí)期卵子的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其卵內(nèi)主要含有卵黃顆粒和脂滴，卵殼的結(jié)構(gòu)與其它昆蟲相似，主要有卵黃膜、卵殼的內(nèi)外層和基膜組成。 5．胚胎發(fā)育與卵黃蛋白的降解 蝶蛹金小蜂胚胎發(fā)育主要發(fā)生在寄生產(chǎn)卵后的3

9、6 h內(nèi)，而在42 h，則開始孵化。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期胚胎內(nèi)蛋白的SDS-PAGE和Western免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，在寄生產(chǎn)卵后18 h內(nèi)，Vt被降解成分子量較小的一些多肽，其中有9個(gè)多肽與Vt具有相似的抗原決定簇，能夠被抗Vt的單克隆抗體所識(shí)別，其它小肽則不被識(shí)別，而在寄生產(chǎn)卵后24 h，胚胎內(nèi)Vt完全被降解成不被抗體所識(shí)別的小肽。同時(shí)，胚胎內(nèi)Vt含量在寄生產(chǎn)卵后12 h內(nèi)，由剛產(chǎn)時(shí)的203 ng增加到12 h的359 ng，但12 h后

10、快速減少，至42 h僅有57 ng，隨后便檢測不到。 6．卵黃發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控 蝶蛹金小峰成蟲體內(nèi)主要含有JHⅢ，其滴度在羽化后2 d內(nèi)呈增長趨勢，從剛羽化時(shí)的1.6 pg/female增加到羽化后48 h的20 pg/female，此后，則開始減少，至羽化后第5 d，JH Ⅲ僅有6.4 pg/fernale。該蜂體內(nèi)蛻皮激素的滴度在成蟲羽化后急速減少，由剛羽化時(shí)的413 pg/female減少到12 h的175 pg/

11、female，隨后便開始增加，至羽化后24 h，體內(nèi)蛻皮激素的滴度上升到234 pg/female，此后又快速降低。采用不同濃度的JH Ⅲ(20 ng/♀、100 ng/♀和500 ng/♀)處理剛羽化雌蜂的結(jié)果表明，JHⅢ不能顯著促進(jìn)Vg的合成，但高濃度的JHⅢ(500 ng/♀)顯著提高卵巢對(duì)Vg的攝取。雌蜂體內(nèi)JHⅢ的滴度與卵巢內(nèi)Vt存在顯著的正相關(guān)，而與血淋巴中Vg和脂肪體中VgmRNA的含量相關(guān)性不顯著。采用不同濃度的蛻皮激素

12、(20-E)處理剛羽化雌蜂的結(jié)果表明，20-E能促進(jìn)Vg的合成，但高濃度的20-E(25 ng/♀和125 ng/♀)顯著抑制卵巢對(duì)Vg的攝取，而低濃度的20-E(5 ng/♀)對(duì)Vg的攝取無明顯影響。該蜂體內(nèi)20-E的滴度與脂肪體中Vg mRNA的含量存在顯著的正相關(guān)，而與血淋巴中Vg和卵巢內(nèi)Vt均無明顯的相關(guān)性。剛羽化的雌蜂去頭后，仍能完成卵黃發(fā)生與卵子成熟。 綜合以上結(jié)果可以推測，蝶蛹金小蜂的卵黃發(fā)生主要受蛻皮激素調(diào)控，而

13、保幼激素只是起到輔助作用。在蛹的后期和隱成蟲期，蛻皮激素滴度的下降啟動(dòng)了脂肪體Vg mRNA的合成。一旦Vg的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)被啟動(dòng)后，Vg mRNA的合成便受到蛻皮激素的正調(diào)控。 7．營養(yǎng)和交配對(duì)卵黃發(fā)生與卵成熟的影響 喂食蜂蜜水不僅能夠顯著促進(jìn)了蝶蛹金小蜂Vg的合成與攝取，而且顯著提高了卵巢內(nèi)卵子室數(shù)和成熟卵的比例。但是，取食蔗糖水和交配對(duì)卵黃發(fā)生的影響不明顯。 8．脂肪體cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建與分析 以羽化

14、后1 d雌蜂的脂肪體為材料，用ZAP Express Vector載體構(gòu)建了一個(gè)cDNA表達(dá)性文庫。該文庫的原始滴度約為1×10<'5>pfu/mL，擴(kuò)增后的滴度約為1×10<'8>pfu/mL，該文庫的重組率約為95.82％，外源插入cDNA片段大小在0.5～2.5 kb之間。對(duì)隨機(jī)挑取的重組克隆序列測定，初步獲得103條ESTs序列，序列平均長度為600.74 bp。獲得的ESTS序列主要包括細(xì)胞看家功能基因(65.5％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

15、相關(guān)的基因(12.5％)、基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控相關(guān)的蛋白(18.6％)。 9．Vg基因的克隆及其體內(nèi)表達(dá)的分析 用抗Vt的單克隆抗體對(duì)脂肪體cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行免疫篩選，從1×10<'5>個(gè)噬菌斑中獲得了24個(gè)陽性克隆。對(duì)陽性克隆的序列測定，獲得了該蜂Vg的3端序列，約含有2530bp。用5 RACE的方法克隆了該蜂Vg的5端序列，并與前面測定的3端序列進(jìn)行合并，獲得了Vg cDNA的全序列。該序列含有5634 bp，編碼18

16、03個(gè)氨基酸，推測的分子量為202.94 kDa，等點(diǎn)PI=8.22，在GenBank中的登錄號(hào)為EF468683。該序列含有4個(gè)推測的Vg酶切位點(diǎn)(RXXR)，保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域GLCG利DGXR，同時(shí)在C-末端存在9個(gè)保守的半胱氨酸。通過Edman降解測定Vtl的N末端20個(gè)氨基酸位于Vg序列的第18～37氨基酸之間，因此推測前面的17個(gè)氨基酸為Vg的信號(hào)肽序列。 根據(jù)克隆的基因序列和該蜂保守的18s rRNA序列設(shè)計(jì)引物，建立

17、了熒光定量PCR方法，并用來檢測其體內(nèi)Vg mRNA相對(duì)含量的變化。脂肪體中Vg mRNA從雌蜂的黑蛹期開始合成，但其相對(duì)含量較低，羽化時(shí)達(dá)到最高，且在羽化后12～24 h內(nèi)維持較高的水平，隨后則開始快速降低。雄蜂和雌蜂白蛹期的脂肪體中未檢測到Vg mRNA。雌蜂血淋巴中Vg與脂肪體中Vg mRNA，不論是在某個(gè)特定時(shí)期，還是在總體上，都存在著顯著的正相關(guān)，只是后者的出現(xiàn)約比前者提前了約24h。 蝶蛹金小蜂Vg氨基酸序列與其它膜