種公雞弱（無）精癥發(fā)生的生理與分子機(jī)制初步研究.pdf

1、弱（無）精種公雞因繁殖能力低下而被迫淘汰，據(jù)報(bào)道，在群體中無精癥種公雞約占10％～20％。而目前對(duì)于雞無精癥發(fā)生機(jī)制研究鮮有報(bào)道，致使此類問題未得到有效、根本的解決，這給我國(guó)正處在發(fā)展關(guān)鍵時(shí)刻的養(yǎng)禽業(yè)帶來一定損失。因此，對(duì)于影響種公雞弱（無）精癥的作用機(jī)制探究已是勢(shì)在必行。
　　本研究是以雪山雞為研究對(duì)象，分別從生理、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等3個(gè)方面對(duì)雞無精子癥的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行較為系統(tǒng)的探究過程。首先利用生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定、精液品質(zhì)測(cè)定及組織

2、學(xué)觀察等方法將雞群分為弱（無）精子雞群體和正常生精雞群體;Piwi基因作為睪丸特異性表達(dá)基因，在精子生成過程中具有重要作用，缺失導(dǎo)致不能形成成熟精子，因此通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time qPCR，RT-qPCR)法，檢測(cè)Piwi(P-element induced wimpytestis)基因在正常、弱（無）精癥雞中不同類型生精細(xì)胞中mRNA表達(dá)差異，探討Piwil1基因表達(dá)水平與產(chǎn)精性能的關(guān)系;同時(shí)本研究利用PCR-SSC

3、P的方法對(duì)Piwil1基因的核心啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)序列共531bp區(qū)域進(jìn)行遺變異位點(diǎn)檢測(cè)，并分析無精癥雞群體中變異位點(diǎn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平和產(chǎn)精性能的影響，以期尋找有價(jià)值的分子遺傳標(biāo)記。
　　最后采用BSP-克隆測(cè)序法對(duì)該區(qū)域CG二核苷酸位點(diǎn)分布情況進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定其甲基化位點(diǎn)，以期發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生過程中各級(jí)生精細(xì)胞中Piwil1基因的表達(dá)與甲基化調(diào)控間的關(guān)系，進(jìn)而闡明Piwil1基因在雞精子發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。
　　

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)雞群對(duì)按摩法的反應(yīng)、產(chǎn)精情況及精液品質(zhì)將雞群分為正常、反應(yīng)強(qiáng)烈且有精子、反應(yīng)強(qiáng)烈且無精子、無反應(yīng)且無精液等四個(gè)組別，分別標(biāo)記為組1、組2、組3和組4。相比之下，組1的精子活力、精子活率顯著高于組2、組3(P＜0.05);且組間精子畸形率差異顯著(P＜0.05)。在不同時(shí)間點(diǎn)不同組間的FSH、LH、To、TSHR血漿激素水平存在差異。
　　2.在組1中雞睪丸中的曲細(xì)精管上皮結(jié)構(gòu)完整，在組2中雞的曲細(xì)

5、精管結(jié)構(gòu)中，未見精子細(xì)胞;在組3中未見次級(jí)精母細(xì)胞及精子細(xì)胞;在組4中未見初級(jí)、次級(jí)精母細(xì)胞及精子細(xì)胞，僅在靠近基膜存在精原細(xì)胞，且深染的精原細(xì)胞極少。由此可見，曲細(xì)精管組織結(jié)構(gòu)損害較嚴(yán)重，僅有少量精原細(xì)胞，精子細(xì)胞和精母細(xì)胞缺失、稀少，致使睪丸組織生精功能喪失。
　　3.檢測(cè)Piwil1基因在正常、無精癥雞中不同類型生精細(xì)胞中mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)Piwil1在正常雞無精癥雞群中的表達(dá)存在顯著差異，且從胚胎中分離的干細(xì)胞的Piw

6、il1表達(dá)水平較精原細(xì)胞低，且在成熟精子中幾乎不表達(dá)，進(jìn)一步表明Piwil1很可能參與精子發(fā)生的減數(shù)分裂過程。
　　4.本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出雞群Piwil1基因5'調(diào)控區(qū)及第1外顯子部分序列總長(zhǎng)531bp區(qū)域，篩選出2個(gè)SNPs;同時(shí)檢測(cè)出雞Piwil1基因啟動(dòng)子區(qū)-233～+298bp區(qū)域存在一個(gè)CpG島，該島有56個(gè)CG二核苷酸位點(diǎn)。第1～10個(gè)CG二核苷酸位點(diǎn)（-233～-129bp區(qū)域），精子細(xì)胞、四倍體細(xì)胞、PGCs、SSCs中

7、處于未甲基化狀態(tài)，而精原細(xì)胞中甲基化比例高達(dá)0.600;第39～55個(gè)CG二核苷酸位點(diǎn)（+105～+252bp區(qū)域），PGCs和SSCs中甲基化比例高于精子細(xì)胞、精原細(xì)胞、四倍體細(xì)胞。PGCs、SSCs中DNA高甲基化在一定程度上抑制了Piwil1基因的表達(dá)。
　　綜上，本研究從生理、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等3個(gè)方面進(jìn)行弱（無）精癥公雞與正常雞差異研究，發(fā)現(xiàn)雞曲細(xì)精管上皮結(jié)構(gòu)受損程度與其精子發(fā)生呈負(fù)相關(guān);Piwil1基因在精子中表達(dá)量