腐胺誘導白樺懸浮細胞中白樺酯醇積累的生理與分子機制的初步研究.pdf

1、本文以產(chǎn)白樺脂醇穩(wěn)定的白樺懸浮細胞為研究材料，將不同濃度的腐胺(Put)處理白樺懸浮細胞3h～48h后，分析外源腐胺對白樺懸浮細胞生長和白樺脂醇積累的影響，明確腐胺促進白樺脂醇積累的最佳濃度和時間。在此基礎(chǔ)上，分析腐胺處理下白樺懸浮細胞中一氧化氮合成、防御生理、氮代謝與白樺脂醇積累的關(guān)系;同時，采用蛋白組學技術(shù)分析腐胺誘導的一氧化氮(NO)參與白樺脂醇積累的分子機制，主要研究結(jié)果如下：
　　1.為分析不同度腐胺對白樺懸浮細胞干重和

2、白樺脂醇積累的影響，用0.1 mmol/L～10mmol/L濃度腐胺處理3～48h，分析細胞干重、白樺脂醇積累量及其合成關(guān)鍵酶基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L腐胺處理48h對白樺懸浮細胞生長的促進作用最強;1mmol/L腐胺處理12h對白樺脂醇積累的促進作用最強。
　　2.為了明確腐胺處理下防御生理與白樺酯醇積累的關(guān)系，用0.1mmol/L～5mmol/L腐胺處理3～48h，分析防御酶和PAL活性及其基因表達水平，發(fā)現(xiàn)低濃

3、度腐胺在一定程度上促進防御酶和PAL活性，1mmol/L腐胺對防御酶和PAL活性誘導作用最強，而5mmol/L腐胺抑制了防御酶和PAL活性。不同濃度的外源腐胺可以通過調(diào)節(jié)基因的表達水平、影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾，或是直接調(diào)控酶的活性等途徑對白樺懸浮細胞的防御酶和PAL活性進行調(diào)控，引起細胞的防御反應(yīng)，表明氧迸發(fā)和苯丙烷類代謝途徑可能參與了腐胺誘導白樺脂醇的積累。
　　3.為了明確腐胺處理下NO合成及氮代謝與白樺脂醇積累的關(guān)系，用0.1

4、mmol/L～5mmol/L腐胺處理0.5～48h，分析NO含量及其合成酶活性、氮代謝相關(guān)指標，發(fā)現(xiàn)中低濃度腐胺主要通過NR、NOS途徑調(diào)節(jié)細胞內(nèi)NO的積累，在處理9h時NO含量最高，高濃度腐胺促進了NO含量增加，卻抑制了白樺脂醇積累，推測高濃度腐胺誘導后期產(chǎn)生高濃度的NO抑制了植物次生代謝產(chǎn)物合成或是外源腐胺通過NR/NOS途徑產(chǎn)生的NO介導白樺脂醇的積累;此外1mmol/L腐胺提高了氮代謝與白樺脂醇積累的相關(guān)性，說明氮代謝可能參與了

5、腐胺對白樺脂醇的誘導作用。
　　4.為研究NO是否介導腐胺對白樺脂醇的誘導作用，用1mmol/L腐胺、1mmol/LSNP、150μmol/L cPITO處理12h，通過測定NO含量、NR及NOS活性及白樺脂醇含量及其合成關(guān)鍵酶的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)腐胺和硝普鈉引起細胞中NO迸發(fā)、白樺脂醇積累，cPITO處理抑制了腐胺引起的NO迸發(fā)和白樺脂醇積累，但白樺脂醇含量仍顯著高于對照水平，說明NO參與了腐胺誘導白樺脂醇的過程，同時外源腐胺也

6、可以通過調(diào)節(jié)其他信號途徑影響白樺脂醇的生物代謝過程。通過檢測β-AS、LUS和CAS基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)其與對白樺脂醇含量較為一致，說明腐胺通過調(diào)控這三個基因表達影響白樺脂醇的積累，而加入cPITO后，這幾個關(guān)鍵合成酶基因的表達水平上調(diào)受到抑制，進一步說明NO介導了外源腐胺誘導白樺脂醇積累的過程。
　　5.為了明確腐胺誘導白樺脂醇積累的信號轉(zhuǎn)導機制，用1mmol/L腐胺、1mmoFLSNP、150μ mol/L cPITO處理12

7、h，利用iTRAQ技術(shù)進行蛋白質(zhì)組鑒定，共鑒定出4718個蛋白質(zhì)，其中對比到其中4360個蛋白與GO數(shù)據(jù)庫匹配，4466個蛋白與COG數(shù)據(jù)庫匹配，有3691個蛋白被注釋到126個代謝途徑中，兩兩比較后差異蛋白共有677個，對差異蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，腐胺和硝普鈉可以促進與萜類合成、轉(zhuǎn)錄、運輸相關(guān)蛋白的積累，而cPITO則一定以程度上抑制了腐胺的促進作用。這些結(jié)果表明腐胺誘導白樺酯醇積累的作用機制一部分依賴于通過NR途徑產(chǎn)生的細胞內(nèi)源NO以及