黃綠蜜環(huán)菌生物催化白樺脂醇合成白樺脂酸的研究.pdf

1、白樺脂酸是一種具有高藥理價值和保健功能的五環(huán)三萜類化合物,對艾滋病和多種腫瘤具有極大治療功效,且對正常細(xì)胞毒性低。微生物細(xì)胞催化是解決白樺脂酸合成的有效途徑,但目前相關(guān)研究甚少。本文以白樺脂醇為前體,對黃綠蜜環(huán)菌生物催化合成白樺脂酸進(jìn)行了深入研究。
　　 通過N+離子注入技術(shù)對前期研究篩選出的白樺脂酸合成菌--黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH進(jìn)行了選育改造,分離出一株高產(chǎn)白樺脂酸菌株(編號ZJUOH100-6),催化轉(zhuǎn)化白樺脂醇底物合成白樺

2、脂酸得率達(dá)5.34％,與出發(fā)菌株在孢子形態(tài)、菌絲體表觀結(jié)構(gòu)等微觀形態(tài)方面存在顯著差異。進(jìn)一步對該突變菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化方式篩選和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化,確定白樺脂酸催化合成方式為種子預(yù)培養(yǎng)3d后加入底物,運用直接生長細(xì)胞體系對底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化;同時通過響應(yīng)面試驗設(shè)計獲得了最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為不添加葡萄糖,初始pH5.0,吐溫80濃度0.57％,底物濃度15mg/L,種子培養(yǎng)時間3d。在此優(yōu)化條件下,黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH100-6催化合成白樺脂酸得率穩(wěn)定達(dá)到9.3

3、2％。
　　 除傳統(tǒng)水相體系外,本文探討了離子對體系在白樺脂酸生物催化合成中的應(yīng)用,建立了黃綠蜜環(huán)菌催化合成白樺脂酸的[EMIM][BF4]/正己烷兩相離子對體系:5mL[EMIM][BF4]/正己烷兩相體系(v:v=1:1)中,加入0.1M正丁醇共基質(zhì),白樺脂醇底物75mg/L,靜息細(xì)胞濃度300g/L(濕重),于28℃、200r/min轉(zhuǎn)化18h。在此離子對體系下,黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH100-6合成白樺脂酸產(chǎn)率達(dá)12.14％

4、,不僅有效提高了轉(zhuǎn)化能力,還大大縮短了轉(zhuǎn)化時間并簡化了產(chǎn)物分離制備步驟。
　　 為深入了解白樺脂酸的生物催化合成機(jī)理,本文對黃綠蜜環(huán)菌ZJUQH100-6催化合成白樺脂酸的關(guān)鍵酶系進(jìn)行了初步研究,建立了菌體細(xì)胞色素P450酶系的正己烷體外誘導(dǎo)和還原態(tài)CO結(jié)合差光譜檢測方法。在每小時投加2μL/mL正己烷,誘導(dǎo)9h條件下,微粒體中P420和P450濃度最高,兩者之和達(dá)到6.48mmol/L。
　　 本文還構(gòu)建了生物轉(zhuǎn)化體系