白樺BpTCP7基因的功能研究.pdf

1、TCP轉(zhuǎn)錄因子是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，TCP家族成員屬于螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(bHLH)超家族成員，參與葉片和花器官的發(fā)育、維管束后生木質(zhì)部導(dǎo)管分子的分化和形成、下胚軸形成、頂端優(yōu)勢(shì)等生物過程，且參與細(xì)胞分裂素、茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素及油菜素內(nèi)酯等激素的合成途徑及應(yīng)答，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。本研究通過分析BpTCP7基因的時(shí)空表達(dá)、啟動(dòng)子組織表達(dá)特性及轉(zhuǎn)基因白樺的表型觀測(cè)，探索BpTCP7基因的功能，研究結(jié)果如下:

2、>　　(1)根據(jù)白樺45個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得了15條白樺Bp TCP基因，分別命名為Bp TCP1-Bp TCP15，其中BpTCP5為部分序列，其余14條為全長(zhǎng)序列。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)15條白樺BpTCP基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，這15條基因在白樺的頂芽、嫩葉、嫩莖、雌花及雄花中均有表達(dá)，各基因之間的表達(dá)模式存在差異，也有相似之處，在頂芽、葉片和雄花中表達(dá)量相對(duì)較高，在8月中旬的葉片中相對(duì)表達(dá)量最高。
　　(2)根據(jù)白樺

3、基因組信息，克隆了BpTCP7基因上游1791 bp的啟動(dòng)子序列，并對(duì)其順式作用元件進(jìn)行了分析，構(gòu)建proBpTCP7∷GUS的植物表達(dá)載體，將其遺傳轉(zhuǎn)化入擬南芥，通過組織化學(xué)染色檢測(cè)該啟動(dòng)子的組織表達(dá)特性，結(jié)果表明:該啟動(dòng)子序列中含有與組織部位表達(dá)、激素、脅迫應(yīng)答等相關(guān)的順式作用元件;通過GUS染色發(fā)現(xiàn)，該基因在擬南芥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段均有表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中出現(xiàn)劍形不規(guī)則葉片，且在不規(guī)則葉片中的表達(dá)很明顯。
　　(3

4、)應(yīng)用Gateway技術(shù)構(gòu)建白樺Bp TCP7基因的植物過表達(dá)及抑制表達(dá)載體，分別采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法和合子胚法進(jìn)行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得了4個(gè)過表達(dá)轉(zhuǎn)化子和3個(gè)抑制表達(dá)轉(zhuǎn)化子。通過PCR和qPCR鑒定過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果表明，白樺BpTCP7基因已經(jīng)成功整合到了過表達(dá)植株基因組上，并且轉(zhuǎn)基因植株的BpTCP7基因表達(dá)水平遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍?br>　　(4)對(duì)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行0.8％NaC1和20％PEG的脅迫處理，測(cè)

5、定不同脅迫處理?xiàng)l件下不同株系的受害指數(shù)及SOD活性、MDA和H2O2含量的變化。結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因株系相比，轉(zhuǎn)基因株系在逆境脅迫條件下，表現(xiàn)出更高的抗逆能力。
　　(5)將Bp TCP7基因亞克隆至pGBKT7載體，形成BD-TCP7重組質(zhì)粒，并以之為誘餌蛋白表達(dá)載體篩選白樺酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)過酵母雙雜交篩選以及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，選出了1種與BpTCP7相互作用的蛋白質(zhì)。對(duì)所篩選出的蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn):該蛋白(TC