白樺Bpl4CLs基因家族的分離及轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析.pdf

1、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是苯丙烷途徑中的關(guān)鍵酶,為植物體提供大量的次生代謝物質(zhì),如木質(zhì)素、類黃酮等。在木質(zhì)素合成過(guò)程中,4CL是聯(lián)系木質(zhì)素前體和各個(gè)分支反應(yīng)的紐帶,分別催化咖啡酸、p-香豆酸、芥子酸和阿魏酸生成相應(yīng)的CoA酯。
　　 本研究利用RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白樺的Bpl4CL2和Bpl4CL3基因,cDNA全長(zhǎng)分別為2069bp和1974bp,ORF

2、分別為1629bp和1656bp,分別編碼543個(gè)和552個(gè)氨基酸。
　　 利用生物信息學(xué)手段對(duì)Bpl4CLs基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)的結(jié)果證實(shí),Bpl4CL3蛋白在Bpl4CL1、Bpl4CL2和其他物種都保守的基序位置出現(xiàn)了差異,可能代表其具有控制木質(zhì)素合成之外的其他生物學(xué)功能。
　　 克隆得到了三個(gè)Bpl4CLs基因的DNA全長(zhǎng):Bpl4CL1的DNA全長(zhǎng)為1755bp,在cDNA序列的1194與1

3、195之間插入了一個(gè)126bp的內(nèi)含子；Bpl4CL2的DNA全長(zhǎng)3185bp,在cDNA序列的1553與1554之間、1658與1659之間插入了318bp和798bp的內(nèi)含子；Bpl4CL3的DNA全長(zhǎng)為3280bp,分別在cDNA序列的1333與1334之間、1480與1481之間、1546與1547之間插入758bp、173bp、283bp的內(nèi)含子。
　　 為確定白樺4CLs基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參基因,采用半定量RT-

4、PCR技術(shù)分析白樺持家基因18S rRNA、肌動(dòng)蛋白基因Actin、泛素基因Ubiquitin和微管蛋白基因Tubulin在白樺中的表達(dá)。結(jié)果表明,18S rRNA,Actin及Ubiquitin基因在各樣本間的表達(dá)無(wú)顯著差異,說(shuō)明這3個(gè)基因可作為校正白樺目標(biāo)基因表達(dá)量的參照基因。
　　 選取Actin作為內(nèi)參基因,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)Bpl4CLs在白樺不同時(shí)期及不同部位的表達(dá)進(jìn)行了分析,證明Bpl4CL3在成熟部位中