油桐NF-YB轉(zhuǎn)錄因子基因家族的分離及VfLEC1對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、油桐（Vernicia fordii）是世界上重要的工業(yè)油料樹種，生產(chǎn)的桐油廣泛用于制漆、塑料、人造橡膠、油墨等行業(yè)，同時(shí)由其安全、可再生、環(huán)保等特點(diǎn)而被視為重要的生物柴油原料。油桐在常規(guī)育種方面如豐產(chǎn)造林及栽培選優(yōu)取得了重要的研究進(jìn)展，但桐油合成有關(guān)的分子生物學(xué)研究較淺。利用分子技術(shù)挖掘油脂合成相關(guān)功能基因有助于闡明桐油生物合成分子機(jī)制，輔助油桐育種。NF-YB基因家族是一類廣泛存在于真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，功能涉及胚胎發(fā)育、花期調(diào)控、

2、種子成熟、脂肪酸合成、抗旱性、根的延長(zhǎng)、光和色素的合成等方面。轉(zhuǎn)錄因子LEC1是NF-YB家族成員之一，在油脂合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本論文從木本油料植物油桐中克隆了油桐NF-YB家族7個(gè)基因，進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、同源性及進(jìn)化樹分析，并分析了組織表達(dá)特異性。此后，選取其中VfNF-YB14（VfLEC1）基因，構(gòu)建含有種子特異表達(dá)啟動(dòng)子的重組載體，成功獲得了轉(zhuǎn)VfLEC1基因的擬南芥植株，對(duì)其進(jìn)行初步的功能鑒定。獲得的主要結(jié)果如

3、下:
　　(1)油桐中VfNF-YB基因家族7個(gè)成員的分離與結(jié)構(gòu)分析。以油桐葉片DNA為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，擴(kuò)增獲得VfNF-YB基因家族7個(gè)成員的DNA序列。結(jié)果顯示，VfNF-YB1，7，9，11，13，14沒(méi)有內(nèi)含子，VfNF-YB5有3個(gè)內(nèi)含子。用DNAman軟件分析VfNF-YB基因家族氨基酸的相似度，發(fā)現(xiàn)用保守B區(qū)域進(jìn)行比對(duì)，和用全長(zhǎng)氨基酸進(jìn)行比對(duì)相比較，顯示更高的相似度，說(shuō)明VfNF-Y

4、B基因家族在B區(qū)域外的相似度低。此外，VfNF-YB1屬于LEC1-類，剩余的屬于非LEC1類。對(duì)多物種的NF-YB家族進(jìn)行氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們具有共同的保守B區(qū)域，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，VfNF-YB1/VfNF-YB5和VfNF-YB7/VfNF-YB13相似度接近，VfNF-YB11和VfNF-YB7/VfNF-YB13相似度接近，然而VfNF-YB9則和他們相似度較低。對(duì)VfNF-YB基因家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，提示

5、并7條系列可能組成復(fù)合物發(fā)揮作用。
　　(2)油桐中VfNF-YB基因家族的表達(dá)分析。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，VfNF-YB1，5，11在種仁中的相對(duì)表達(dá)量高于在其他組織，VfNF-YB7，9在根中表達(dá)量最高且在其他組織中表達(dá)量較低。VfNF-YB13在各個(gè)組織中表達(dá)量差異不大。VfNF-YB14主要在根，莖，葉維管組織，以及成熟早期種子中高表達(dá)。
　　(3)轉(zhuǎn)錄因子VfLEC1基因的表達(dá)分析。基因在不同的組織中均有表達(dá)，在不

6、同的組織中的表達(dá)表現(xiàn)為:葉＞莖＞根＞種子＞花＞子房＞幼果＞雄蕊。VfLEC1基因的表達(dá)具有時(shí)間特異性，在桐油的合成初期表達(dá)量最高。基因結(jié)構(gòu)顯示其無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，共編碼242個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為6.91，分子量為27.03kD。氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示油桐也具有保守B區(qū)域，并且具有保守的16個(gè)氨基酸殘基(M，I，R，H，D，I，Y，N，D，R，Q，T，A，E，K，T)，保守區(qū)域有3個(gè)α-螺旋(α1-3)以及2個(gè)連接區(qū)域(L1，L2)。進(jìn)化樹分

7、析顯示油桐VfLEC1與蓖麻L(zhǎng)EC1進(jìn)化關(guān)系距離最近。
　　(4)轉(zhuǎn)錄因子VfLEC1基因?qū)M南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。成功構(gòu)建含有特異性種子表達(dá)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pB110-VfLEC1，并根據(jù)生長(zhǎng)情況及AtLEC1的表達(dá)量選取合適的突變體，將VfLEC1基因成功轉(zhuǎn)入突變體擬南芥lec，獲得了8株陽(yáng)性表達(dá)轉(zhuǎn)化子，表達(dá)量在轉(zhuǎn)化子間差異明顯，表達(dá)量最高的株系LEC1-7是表達(dá)量最低株系LEC1-4的十倍左右。突變體、野生型及轉(zhuǎn)VfLEC1基