小麥轉錄因子基因TaNF-YB21耐逆功能及TaZFP1～TaZFP4遺傳轉化.pdf

1、轉錄因子（transcription factors，TFs）在調控植物應答和抵御生物和非生物逆境，生長發(fā)育及信號轉導過程中發(fā)揮著重要作用。核因子Y(Nuclear Factor Y，NF-Y)是一類典型的通過與真核生物啟動子區(qū)的CCAAT-box相結合從而對下游基因表達進行調控的轉錄因子。本項研究以在實驗室前期構建的富集干旱脅迫的小麥根系cDNA差減文庫中獲得的NF-Y型轉錄因子TaNF-YB2;1的表達序列標簽(EST)為基礎，系統(tǒng)

2、研究了該基因的分子特征、干旱鹽分逆境下的表達特性及其介導植株抵御干旱及鹽分等非生物逆境的生物學功能。近年來許多研究表明，C2H2型鋅指蛋白轉錄因子在植物應答和抵御非生物逆境的過程中也發(fā)揮了重要作用。本研究構建了C2H2型轉錄因子基因TaZFP1～TaZFP4的正、反義雙元表達載體，采用農桿菌介導的遺傳轉化技術建立了正、反義序列轉基因煙草植株。為進一步深入研究-C2H2型轉錄因子家族成員的作用機制和生物學功能打下基礎。主要研究結果如下:<

3、br>　　1.在富集干旱逆境的小麥根系cDNA差減文庫中，經測序獲得1個與短柄草核轉錄因子NF-YB2-like高度同源的表達序列標簽(EST)，進一步在NCBI網站進行BLAST序列同源查找獲得與該EST序列對應的cDNA序列，將其命名為TaNF-YB2;1。該基因的cDNA全長為958 bp，編碼長度為163個氨基酸的多肽鏈，編碼蛋白的分子量為17.74 kD，等電點(pI)為6.13。此外，該基因編碼蛋白含有植物種屬NF-YB2家

4、族成員具有的4個保守α螺旋基序，分別為α1(DRFLPIANISR)、α2(KETLQECVSEFIS)、α3(DDLLWAMATLG)和αC(PLKIYL)。
　　2.在NCBI網站進行BLAST同源查找獲得23個其它不同植物種屬的TaNF-YB2;1同源基因。利用DNAStar軟件建立上述同源基因與TaNF--YB2;1的系統(tǒng)進化樹。結果表明，TaNF-YB2;1在核酸水平上與小麥NFYB-B2、短柄草NF-YB2-like和

5、水稻OsHAP3A基因的一致性較高，分別為97.1％、80.7％和70.7％，說明TaNF-YB2;1可能與上述基因具有相似的進化關系或相似祖先。
　　3.對TaNF-YB2;1在正常生長及干旱和鹽分處理下小麥根系中的表達特征進行研究。結果表明，干旱和鹽分逆境能使該基因的表達量明顯上升，TaNF-YB2;1在介導植株抵御上述逆境的過程中可能發(fā)揮著重要生物學功能。
　　4.采用農桿菌介導葉盤遺傳轉化法轉化煙草(cv.Wisco

6、nsin38)，獲得超表達TaNF-YB2;1的轉基因煙草植株。選用典型TaNF-YB2;1轉基因煙草系和野生型煙草為材料，研究了干旱、鹽分滲透脅迫下植株的生長特征和干物質積累量。結果表明，在干旱和鹽分條件下，TaNF-YB2;1轉基因植株生長得到明顯改善，植株形態(tài)明顯增大，干物質累積量顯著增加。表明，遺傳轉化TaNF-YB2;1具有明顯改善植株抵御干旱和鹽分滲透脅迫的能力。
　　5.以遺傳轉化TaNF-YB2;1的正義第二系(S

7、en-2)和反義第一系(Ant-1)及野生型(WT)植株為材料，對干旱、鹽分條件下植株體內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)3種細胞保護酶、磷酸鹽轉運蛋白(NTPT)及硝酸鹽轉運蛋白（NTNRT）相關基因的表達特征及相關生理活動參數的變化特點進行研究。結果表明，與野生型(WT)植株相比，干旱和鹽分脅迫后，TaNF-YB2;1轉基因煙草植株的Sen-2系SOD和CAT相關基因轉錄本的表達量部分明顯上升，P

8、OD相關基因的表達量大多呈下降趨勢;其SOD活性、CAT活性和可溶性蛋白含量均明顯增高，但POD活性和MDA含量明顯低于野生型植株，而Ant-1系變化趨勢大多與Sen-2系相反或與野生型(WT)植株相比無明顯變化。NTPT和NTNRT相關基因中僅個別基因在Sen-2系和Ant-1系中的表達量發(fā)生明顯改變。表明TaNF-YB2;1在介導植株抵御干旱和鹽分逆境的過程中，對植株體內上述3種細胞保護酶、磷酸鹽和硝酸鹽轉運蛋白相關基因表達進行調控

9、，導致部分生理生化參數也發(fā)生明顯變化，在植物體內彼此之間相互影響形成一個極其復雜的調控網絡使轉基因植株在上述逆境下能更好的生長。
　　6.干旱和鹽分處理后，用DAB和NBT分別定位Sen-2系和Ant-1系及野生型植株葉片中的H2O2和O2-·。結果表明，Sen-2系植株在上述逆境下葉片著色均比WT淺，清除活性氧H2O2和O2-·的能力增強;而Ant-1系植株葉片除在鹽分處理下NBT染色略淺于WT外其余均比WT著色深，清除活性氧H

10、2O2和O2-·的能力較弱。
　　7.通過對實驗室前期構建的富集低磷脅迫不同時間點根系特異表達的cDNA差減文庫的部分克隆測序，獲得了4個C2H2型轉錄因子的ESTs。進一步同源查找，得到與上述ESTs在核苷酸序列一致的小麥cDNA序列(GenBank登錄號分別為AK331121、AK333490、AK334138和AK333024)，本文將其命名為TaZFP1～TaZFP4。其cDNA全長分別為708 bp、1507 bp、16

11、12 bp和940 bp，編碼的氨基酸數目分別為124個、400個、383個和119個。TaZFP1～TaZFP4的分子量分別為13.96 kD、45.01kD、44.09kD、12.42 kD，等電點(pI)分別為9.3、5.27、7.54、9.97。
　　8.對TaZFP1～TaZFP4進行BLAST同源查找，獲得來自不同植物種屬的同源基因并利用DNAStar建立系統(tǒng)進化樹。結果分析表明，TaZFP1～TaZFP在核苷酸水平上

12、與源于大麥、短柄草和玉米的同源基因序列高度一致，可能具有較近的親緣關系。
　　9.對TaZFP1～TaZFP4在低磷、低氮、干旱、鹽分逆境下的表達特征進行研究，結果表明上述基因均對個別或全部逆境產生應答。采用RT-PCR和DNA重組技術，構建了融合TaZFP1～TaZFP4正、反義序列的雙元表達載體。利用農桿菌介導法建立了遺傳轉化正、反義表達TaZFP1～TaZFP4的轉基因煙草株系。為進一步鑒定TaZFP1～ TaZFP4介導植