小麥耐逆因子MIR444a、NF-YB23、TaRRM、TaRACK1和TaARR分子特征和功能研究.pdf

1、非生物逆境如營(yíng)養(yǎng)匱乏、干旱和鹽分是全球范圍內(nèi)限制作物植株生長(zhǎng)及產(chǎn)量形成的重要因素。揭示植物抗逆分子機(jī)制對(duì)于改善作物耐逆能力具有重要實(shí)踐意義。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期工作積累為基礎(chǔ)，對(duì)應(yīng)答低氮脅迫的小麥miRNA家族成員TaMIR444a、鹽分、干旱逆境脅迫下表達(dá)基因Ta NF-YB2;3、應(yīng)答低磷脅迫的RNA識(shí)別基序TaRR、蛋白激酶c受體(RACK1)基因TaRACK1和細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子基因TaARR的分子特征及其耐逆功能進(jìn)行了研究。主要

2、研究結(jié)果如下:
　　1、低氮脅迫下，TaMIR444a及其煙草同源基因NtMIR444a在植株根、葉中均呈上調(diào)表達(dá)特征，其靶基因應(yīng)答低氮脅迫的特征與此相反。表明miR444a為單、雙子葉植物中均存在的miRNA家族成員，與作用靶基因構(gòu)建miRNA/靶基因模塊。與野生型(wild type，WT)相比，超表達(dá)TaMIR444a的煙草株系表現(xiàn)出抵御低氮脅迫的能力增強(qiáng)，植株生長(zhǎng)特性、生物量、氮含量、光合參數(shù)和抗氧化酶活性明顯改善?；蛐?/p>

3、片轉(zhuǎn)錄譜分析表明，超表達(dá)TaMIR444a株系對(duì)大量歸屬于不同功能類別的基因在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控，包括信號(hào)感知及轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、主要和次要代謝、植物激素響應(yīng)、細(xì)胞保護(hù)及防御反應(yīng)等類別。介導(dǎo)植株硝酸鹽吸收的硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT)基因NtNRT1.1-s、NtNR T1.1-t和NtNR T2.1以及調(diào)控逆境下植株體內(nèi)細(xì)胞活性氧(ROS)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的抗氧化酶基因NtCAT1;1、NtPOD1;3和NtPOD4在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)明顯上調(diào)，表明上

4、述基因通過增強(qiáng)表達(dá)，改善轉(zhuǎn)基因株系在低氮脅迫下的植株氮吸收能力及活性氧清除功能。研究證實(shí)，miR444a通過調(diào)控氮素吸收、活性氧內(nèi)穩(wěn)態(tài)和碳同化相關(guān)網(wǎng)絡(luò)參與植株對(duì)低氮逆境脅迫的抵御。
　　2、在富集干旱特異表達(dá)基因的小麥根系cDNA文庫(kù)中，獲得了Ta NF-YB2;3的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，進(jìn)一步獲得了對(duì)應(yīng)上述EST的cDNA全長(zhǎng)序列。TaNF-YB2;3的cDNA全長(zhǎng)為780 bp，編碼209個(gè)氨基酸，蛋白分子量為22.05 k

5、D，蛋白等電點(diǎn)(pI)為5.85。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，TaNF-YB2;3位于胞外。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TaNF-YB2;3與大麥種屬中同源基因高度同源。遺傳轉(zhuǎn)化TaNF-YB2;3研究及基因功能鑒定結(jié)果表明，與對(duì)照WT相比，超表達(dá)TaNF-YB2;3的轉(zhuǎn)基因植株在干旱和鹽分脅迫下的生長(zhǎng)特征得到明顯改善，表現(xiàn)為植株地上、地下部干鮮重均明顯增加，葉面積顯著增大。表明TaNF-YB2;3具有增強(qiáng)植株抵御干旱和高鹽脅迫的能力。表達(dá)分析結(jié)果表

6、明，在鹽分、干旱、脫落酸(ABA)處理后，遺傳轉(zhuǎn)化Ta NF-YB2;3株系葉片中的特定ABA受體基因PYL/P YR、ABA信號(hào)途徑關(guān)鍵基因SnRK和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧內(nèi)穩(wěn)態(tài)的抗氧化酶基因AEE呈上調(diào)表達(dá)。說明TaNF-YB2;3通過調(diào)控上述類別的特定基因參與滲透脅迫逆境下植株體內(nèi)ROS內(nèi)穩(wěn)態(tài)和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力。對(duì)干旱、鹽分及ABA處理后轉(zhuǎn)基因系氣孔關(guān)閉結(jié)果顯示，遺傳轉(zhuǎn)化Ta NF-YB2;3對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)

7、產(chǎn)生調(diào)節(jié)，逆境下其氣孔關(guān)閉速度加快，由此增強(qiáng)植株在脫水逆境下的細(xì)胞和組織保水能力。暗示TaNF-YB2;3可能通過ABA依賴途徑參與植株對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。
　　3、在富集豐、缺磷特異表達(dá)基因的小麥根系cDNA文庫(kù)中，獲得了TaRRM、TaRA CK1和TaARR的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，進(jìn)一步獲得了對(duì)應(yīng)上述EST的cDNA全長(zhǎng)序列。TaRRM、TaRACK1和TaARR的cDNA全長(zhǎng)分別為881、1064和1647 bp，編碼18

8、9、335和520個(gè)氨基酸，蛋白分子量分別為21.0、36.2、57.95 kD，蛋白等電點(diǎn)(pI)為9.47、6.32和6.34。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，TaRRM和TaARR定位于胞外，TaRACK1定位于胞質(zhì)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TaRRM與玉米、黃瓜、可可和葡萄種屬中同源基因高度同源;TaRACK1與大麥和短柄草同源基因高度同源;TaARR與亞麻芥、馬鈴薯、番茄、芝麻、大麥和苜蓿等植物種屬中同源基因高度同源。對(duì)TaRRM、TaRA

9、CK1和TaARR在低氮、低磷、鹽分和干旱等逆境下的表達(dá)模式研究表明，上述基因在根中的表達(dá)受到低氮與低磷脅迫誘導(dǎo)，表現(xiàn)為表達(dá)水平隨處理時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，對(duì)鹽分和干旱逆境不產(chǎn)生應(yīng)答。在構(gòu)建上述基因上、下調(diào)雙元表達(dá)載體基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了小麥和煙草遺傳轉(zhuǎn)化，獲得TaRA CK1和TaARR轉(zhuǎn)基因煙草T2種子。為進(jìn)一步闡明上述基因介導(dǎo)植株抵御磷、氮脅迫的能力及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，小麥小分子RNA miR444a通

10、過調(diào)節(jié)氮吸收、活性氧解毒作用和碳同化相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)植株抵御低氮逆境脅迫;Ta NF-YB2;3通過調(diào)控AEE、PYL\PYR、SnRK基因表達(dá)增強(qiáng)植株的保護(hù)酶活性、調(diào)控根系生長(zhǎng)和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗逆能力。TaRRM在氮磷脅迫條件下呈下調(diào)表達(dá)，TaRA CK1和TaARR在氮磷脅迫下表達(dá)上調(diào)。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法建立了TaRRM、TaRA CK1和TaARR煙草及小麥轉(zhuǎn)基因株系。上述基因的功能有待于進(jìn)一