大豆轉(zhuǎn)錄因子GmC2H2基因轉(zhuǎn)化擬南芥效果分析.pdf

1、鋅指蛋白(zinc finger protein)是一類具有“指狀”結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是調(diào)控基因的表達(dá)，鋅指蛋白種類較多，但以C2H2型最多。C2H2型鋅指蛋白基因最早在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)，植物中發(fā)現(xiàn)的第一個C2H2型鋅指蛋白基因是在矮牽牛中分離得到的ZPT2-1，之后陸續(xù)在矮牽牛、擬南芥、棉花、大豆、水稻等植物中相繼分離到了該類型的鋅指蛋白基因，并發(fā)現(xiàn)在植物中都含有QALGGH高度保守序列，而動物鋅指蛋白中不存在。已有的研究發(fā)現(xiàn)C

2、2H2型鋅指蛋白主要參與植物的生長發(fā)育以及調(diào)控植物的抗逆性。
　　 本研究的GmC2H2轉(zhuǎn)錄因子基因是依據(jù)GenBank中大豆EST數(shù)據(jù)庫的保守序列，設(shè)計特異性的引物，利用PCR、RT-PCR等技術(shù)獲得的一個cDNA開放閱讀框序列，它是大豆中一個編碼經(jīng)典C2H2型鋅指蛋白的基因，并在Genbank中注冊，其登陸號為：DQ055134。該基因全長765bp，開放閱讀框長度為516 bp，其編碼172個氨基酸的鋅指蛋白，分子量約為1

3、9KD。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，將GmC2H2基因的全長編碼序列分別構(gòu)建到16318hGFP亞細(xì)胞定位載體上，將16318hGFP-GmC2H2轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析得知，GmC2H2鋅指蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)。將GmC2H2基因的全長編碼序列構(gòu)建到pCAMBIAl304植物表達(dá)載體上，借助優(yōu)化的floral-dip法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，利用潮霉素Hygromycine(45-50mg·L-1)抗性篩選，經(jīng)PCR

4、擴(kuò)增檢測，獲得19株轉(zhuǎn)基因陽性苗。通過孟德爾定律篩選分離比接近3:1的株系，外源基因可能為單拷貝插入的株系，已得到3個純合株系，分別為株系1、株系4、株系7。經(jīng)GUS組織染色分析，在攜帶目的基因的pCAMBIAl304空載體的擬南芥幼苗中，GUS基因在整個植株體內(nèi)表達(dá)，而在攜帶目的基因GmC2H2的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，表達(dá)部位集中在根部。將GmC2H2基因的突變體MZF1、MZF2、MZF4、MZF8、MZF10序列分別構(gòu)建到pCAMBIA

5、l304植物表達(dá)載體上，利用同樣方法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得純合系轉(zhuǎn)基因擬南芥，用作后續(xù)該GmC2H2轉(zhuǎn)錄因子各元件的功能研究。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證GmC2H2的功能，對野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥植株進(jìn)行脫落酸(ABA，200μmol·L-1)處理和低溫(1℃)、高鹽(NaCl，250mmol·L-1)脅迫處理。研究表明，在ABA處理和低溫、鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株的長勢明顯好于野生型植株；ABA處理和低溫、鹽脅迫導(dǎo)致野生型和轉(zhuǎn)基因型擬南芥植

6、株丙二醛含量都升高，但野生型植株中丙二醛含量增加量更為顯著；轉(zhuǎn)基因擬南芥中可溶性糖和脯氨酸的含量顯著高于野生型；轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞損傷率要低于野生型擬南芥。推測可能是目的基因GmC2H2的插入導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗逆性明顯高于野生型擬南芥。
　　 經(jīng)ABA處理和低溫、鹽脅迫后，對轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株進(jìn)行real-time qPCR分析，結(jié)果表明，脅迫處理后的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的目的基因GmC2H2的表達(dá)量，無論在根還是葉中，都