轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因GmGT-2A轉(zhuǎn)化大豆與體系優(yōu)化研究.pdf

1、農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育同外界環(huán)境密切相關(guān),環(huán)境中物理和化學(xué)因素的變化例如干旱、鹽堿、凍害、低溫等脅迫因素會(huì)影響大豆的生長(zhǎng)發(fā)育,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致大豆大幅度的減產(chǎn)。增加大豆的抗逆性是大豆改良的重要目標(biāo),同時(shí)對(duì)緩解我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)危機(jī)具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為植物耐逆育種的主要方法之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)以浙江省杭州國(guó)家大豆分中心保存的‘浙春3號(hào)’和‘中黃13’為研究材料,將轉(zhuǎn)錄因子GmGT-2A基因構(gòu)建到不同

2、的載體導(dǎo)入大豆基因組中,從而調(diào)控耐逆相關(guān)功能基因的表達(dá),以期獲得具有抵抗鹽害、干旱等非生物脅迫能力的大豆新種質(zhì)。建立和優(yōu)化適合兩種實(shí)驗(yàn)材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系是成功獲得轉(zhuǎn)基因大豆的首要前提,本實(shí)驗(yàn)主要采用大豆子葉節(jié)和大豆胚芽尖作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的外植體,并研究影響兩種遺傳轉(zhuǎn)化的重要影響因子。取得如下主要研究成果:
　　 1、對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中消毒方法、消毒時(shí)間、外植體的大小、外植體的放置方式、6-BA在萌發(fā)階段和誘導(dǎo)階

3、段的最適濃度、影響芽伸長(zhǎng)的培養(yǎng)基激素等幾個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。以大豆的組培苗的污染率和萌發(fā)率為指標(biāo),氯氣消毒法平均污染率1.67％,萌發(fā)率高達(dá)98.33％,而NaClO結(jié)合70％乙醇的消毒方法平均污染率達(dá)到35.33％,萌發(fā)率也只有64.67％,結(jié)果顯示氯氣消毒法是最優(yōu)的消毒方法；以大豆種子的再生率為指標(biāo),研究氯氣消毒時(shí)間對(duì)種子活力的影響,當(dāng)消毒時(shí)間為4-6小時(shí)達(dá)到零污染率,再生率也取得最大值88-89％,所以確定最佳氯氣的消毒時(shí)間為4-6

4、小時(shí)；以子葉節(jié)的再生率和誘導(dǎo)芽的質(zhì)量為指標(biāo),確定了大豆以2／3子葉,以45°斜插于培養(yǎng)基中的形式獲得最好的誘導(dǎo)效果;以子葉節(jié)的再生率和帶有明顯主莖的芽數(shù)為指標(biāo),確定了在萌發(fā)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別添加6-BA的含量為0.5mg／L、2mg／L誘導(dǎo)效果最好,大豆叢生芽率達(dá)到最大值92％,并得出6-BA在大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)中萌發(fā)階段和誘導(dǎo)階段都起著重要的作用:本研究還探討了影響叢生芽伸長(zhǎng)的幾個(gè)植物生長(zhǎng)激素及其各自濃度,并確定了當(dāng)ZT為0.15

5、mg／L,GA3為0.6mg／L,,6-BA為1mg／L的時(shí)候芽最高伸長(zhǎng)頻率為78.33％TDZ對(duì)叢生芽的伸長(zhǎng)有抑制作用。利用優(yōu)化后大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),將構(gòu)建于pBin438載體上的GmGT-2A成功導(dǎo)入到‘中黃13’中,獲得19個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)PCR檢測(cè)、構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)、抗逆性的初步鑒定,已將目的基因?qū)氪蠖够蚪M中。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)部分以大豆品種‘浙春3號(hào)’的胚芽尖為受體材料,將大豆轉(zhuǎn)錄因子GmGT-2A構(gòu)建

6、于pCambia3300雙元載體上,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入大豆基因組中,為探討過(guò)量表達(dá)該基因以提高大豆對(duì)非生物脅迫的抗逆性準(zhǔn)備材料。通過(guò)研究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的6-BA濃度、侵染時(shí)間等因子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響,系統(tǒng)優(yōu)化了大豆的成熟胚芽尖轉(zhuǎn)化體系。單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、6-BA濃度和侵染時(shí)間均對(duì)大豆遺傳轉(zhuǎn)化有顯著的影響,三者各自最優(yōu)條件分別為胚芽尖預(yù)培養(yǎng)時(shí)間1.5d,共培養(yǎng)基6-BA濃度8 mg／L和侵染時(shí)間10h。根據(jù)以

7、上結(jié)果設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化,結(jié)果表明:以上因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響程度從大到小依次為:侵染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和6-BA濃度；最佳轉(zhuǎn)化體系中各因素水平與單因素優(yōu)化結(jié)果一致。本研究獲得的最高平均轉(zhuǎn)化效率為5.67％。實(shí)驗(yàn)還初步探討了IBA濃度對(duì)再生苗生根的影響,結(jié)果表明在生根培養(yǎng)基中不加入IBA比加入IBA時(shí)生根時(shí)間短,且生根數(shù)量多,移栽易成活。利用上述方法得到的抗性苗,經(jīng)目的基因、標(biāo)記基因和構(gòu)建特異性的PCR檢測(cè),表明