抗真菌活性水稻內(nèi)生菌的篩選及美達(dá)霉素生物合成中糖基化機(jī)制研究.pdf

1、微生物資源(無論是菌體本身還是其活性代謝產(chǎn)物)在農(nóng)、林、醫(yī)、藥等各行業(yè)都有重要的利用價(jià)值，篩選更有應(yīng)用價(jià)值的微生物資源或研究其天然代謝產(chǎn)物的生物合成途徑是當(dāng)今微生物資源開發(fā)利用的兩大重要研究領(lǐng)域。在農(nóng)業(yè)生防方面，選擇更多、更好、性能穩(wěn)定的、對(duì)寄主安全的、能作為外源基因載體的內(nèi)生菌一直是生防工作者奮斗的目標(biāo)；而作為有應(yīng)用價(jià)值的抗生素類化合物，研究其合成代謝機(jī)制則是進(jìn)行抗生素結(jié)構(gòu)和活性優(yōu)化的基礎(chǔ)，展開這兩方面的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2、>　　 該文從兩個(gè)方面展開了研究工作：(一)以開發(fā)生防內(nèi)生菌為目的，分離到一株對(duì)多種農(nóng)業(yè)病原真菌有抑制作用的水稻內(nèi)生細(xì)菌CHM-1(Bacillus licheniformis CHM-1)，對(duì)其分類地位、抑菌活性、內(nèi)生定殖、防病效果與寄主的關(guān)系進(jìn)行了研究；(二)對(duì)鏈霉菌AM-7161(Streptomycessp.AM-7161)產(chǎn)生的芳香聚酮類抗生素美達(dá)霉素(Medermycin)生物合成途徑的糖基化現(xiàn)象從分子水平上進(jìn)行研究。具體

3、工作內(nèi)容如下：
　　 (一)具有抑制植物病原真菌活性的水稻內(nèi)生細(xì)菌分離及相關(guān)性質(zhì)研究：
　　 (1)在多年水稻和油菜輪作的田塊取樣，分離多株內(nèi)生細(xì)菌，篩選出對(duì)幾種重要的植物病原真菌抑制活性最強(qiáng)的CHM-1菌株；
　　 (2)通過離體、活體的植物病原真菌抑制作用的測(cè)定，初步探討了該菌株對(duì)幾種植物病原真菌的抑制作用及作用機(jī)理，并進(jìn)行了對(duì)玉米小斑病(Bipolaris.maydis)、水稻紋枯病(Rhizoctonia

4、solani)活體防效測(cè)定，發(fā)現(xiàn)CHM-1菌株對(duì)玉米小斑病和水稻紋枯病的防治效果分別為70.22％、62.79％；
　　 (3)從形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)、代謝類型、分子生物學(xué)等各個(gè)水平對(duì)CHM-1進(jìn)行了分類鑒定，初步鑒定為一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus licheniformis CHM-1)；
　　 (4)為了將其作為候選的生防菌株開發(fā)利用，本文利用雙抗標(biāo)記法研究CHM-1在水稻和油菜內(nèi)的定殖作用，發(fā)現(xiàn)其在水稻

5、和油菜內(nèi)的定殖不僅不會(huì)給兩種作物帶來危害，反而對(duì)其具有明顯的促生作用。
　　 (二)聚酮抗生素美達(dá)霉素生物合成途徑中糖基化修飾的研究：
　　 (1)通過同源性分析確定：鏈霉菌AM-7161的美達(dá)霉素生物合成基因簇中存在6個(gè)與脫氧六碳糖合成相關(guān)的糖基合成酶基因(med-ORF14、15、16、17、19、20)以及一個(gè)與C-糖基轉(zhuǎn)移酶基因同源的基因med-ORF8。推測(cè)這7個(gè)基因完成美達(dá)霉素結(jié)構(gòu)中安哥拉糖胺的合成以及C-糖

6、苷鍵的形成；
　　 (2)通過構(gòu)建這7個(gè)基因的共表達(dá)系統(tǒng)，在宿主天藍(lán)色鏈霉菌B135(Streptomyces coelicolorB135)提供糖基受體的情況下，進(jìn)行共表達(dá)系統(tǒng)的異源表達(dá)，或在一個(gè)通用天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞((Streptomyces coelicolor CH999)中進(jìn)行異源表達(dá)，同時(shí)與產(chǎn)生糖基供體的菌株B135進(jìn)行共培養(yǎng)(即單菌株培養(yǎng)或雙菌株共培養(yǎng))，并通過LC/MS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)這7個(gè)基因的共表達(dá)可以導(dǎo)致

7、聚酮糖基受體(由宿主體內(nèi)積累的或共培養(yǎng)體系中另一個(gè)菌株提供)轉(zhuǎn)化成帶有糖基的結(jié)構(gòu)，說明這7個(gè)基因共同參與脫氧糖胺的合成和轉(zhuǎn)移過程；
　　 (3)利用PCR-Targeting介導(dǎo)的鏈霉菌基因突變操作系統(tǒng)(RedirectTM)將med-ORF8從美達(dá)霉素完整的生物合成基因簇中敲掉，獲得了突變基因簇，進(jìn)行異源表達(dá)，獲得突變菌株；然后再克隆med-ORF8連接到鏈霉菌表達(dá)型載體上，經(jīng)過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入突變基因簇異源表達(dá)細(xì)胞，獲得回補(bǔ)

8、菌株。通過LC/MS產(chǎn)物分析野生型菌株、突變菌株及互補(bǔ)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在med-ORF8敲掉的突變株中確實(shí)沒有美達(dá)霉素的產(chǎn)生，而在回補(bǔ)菌株中，又檢測(cè)出了美達(dá)霉素的存在，這說明med-ORF8在美達(dá)霉素的C-糖基化過程中是必不可少的基因；
　　 (4)本文構(gòu)建了五個(gè)有關(guān)med-ORF8基因的原核表達(dá)體系，從中篩選出了最優(yōu)化的表達(dá)體系，并進(jìn)行了誘導(dǎo)條件的探索，確定了med-ORF8高效可溶性表達(dá)的體系和誘導(dǎo)條件，這為下一步弄清楚