陸地棉再生體系優(yōu)化及體胚發(fā)育分子機(jī)理的研究.pdf

1、棉花組織培養(yǎng)周期長、植株再生受基因型限制，嚴(yán)重制約著棉花生物技術(shù)的應(yīng)用。目前國內(nèi)外關(guān)于棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的報道大多局限于少數(shù)培養(yǎng)成功的模式品種，如珂字201、珂字312、冀合321、晉棉7號、晉棉12號等，而主栽品種體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的報道極少，且僅限于生理生化指標(biāo)的研究。本研究以當(dāng)前生產(chǎn)上主推棉花優(yōu)良品種為材料，從棉花愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎的發(fā)生等幾個方面進(jìn)行了條件優(yōu)化；系統(tǒng)研究了棉花離體培養(yǎng)過程中不同內(nèi)源

2、激素含量及比例的變化規(guī)律，分析了激素變化與胚性愈傷組織發(fā)生過程的可能關(guān)系；在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上利用單向和雙向電泳技術(shù)分析棉花胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.使用10％～15％過氧化氫對棉花種子消毒，出苗率100％，種子利用率高，無菌苗長勢健壯，無傷害，較傳統(tǒng)的升汞消毒法更利于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基采用在115℃下滅菌20min，與經(jīng)典的植物組織培養(yǎng)滅菌方法121℃滅菌20min相比，對培養(yǎng)基的

3、有效成分破壞小，愈傷組織增殖量大。 2.單獨(dú)使用0.1 mg/L TDZ可以使下胚軸在短時間誘導(dǎo)出顏色鮮黃，質(zhì)地疏松的愈傷組織。2，4-D在愈傷組織誘導(dǎo)中是必需的，最適宜濃度為0.05～0.07mg/L，后期繼代時逐漸減少2，4-D濃度，經(jīng)過3次繼代培養(yǎng)后，不再添加2，4-D。2，4-D與較高濃度的NAA結(jié)合可以誘導(dǎo)出顏色質(zhì)地良好的愈傷組織。 3.不添加2，4-D，適當(dāng)調(diào)節(jié)KT和NAA的濃度和比例可以誘導(dǎo)出大量不定根，低

4、濃度的2，4-D即可抑制不定根的形成。 4.細(xì)胞分裂素ZT和KT與生長素NAA或IBA比例為1：1時胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高。三種不同抗氧化劑抑制胚性愈傷組織褐變的效果如下：VC>Ac>PVP，Ac在3g/L時能夠最大程度地抑制組織褐化，培養(yǎng)出的愈傷組織顏色黃綠、質(zhì)地疏松，促進(jìn)胚性愈傷組織的分化。 5.應(yīng)用梯度洗脫反相高效液相色譜法(HPLC)，摸索出一套分離和測定棉花組培材料中4種不同內(nèi)源激素含量的方案，以甲醇-乙腈-0

5、.6％的冰乙酸水溶液為流動相，流速為0.5 ml/min，洗脫程序如下：在最初6min內(nèi)，流動相中各溶劑的體積比為40：5：55，ZT和GA3被檢測出來，在隨后的2min內(nèi)將各溶劑的體積比變?yōu)?0：5：45，保持7min，LAA和ABA相繼被檢測出來，從而在15min內(nèi)4種激素完全分離。 6。GA3在0.02～0.9μg/g的變化范圍內(nèi)呈明顯的先上升后下降再上升的趨勢；ZT在0.1～0.7μg/g的變化范圍內(nèi)呈先上升后下降的趨勢

6、；ABA含量在愈傷組織中含量較低，基本上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；ABA/GA3、ABA/IAA均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢：ZT/IAA在胚性愈傷組織發(fā)育階段呈現(xiàn)明顯的上升-下降-上升-下降的趨勢。不同的外源激素組合對內(nèi)源激素的影響各不相同，對LAA、ZT、GA3的影響都較大，可見各種激素協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化。 7.外植體、非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織階段各有其特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并且不同品種之間外植體所表達(dá)的蛋白質(zhì)也有所不同