三七集團(tuán)選擇后代群體的鑒定與評(píng)價(jià)(碩士論文)

1、<p>　　分類號(hào)： 密級(jí)： </p><p>　　UDC ： 編號(hào)： </p><p><b>　　碩士學(xué)位論文</b></p><p>　　三七集團(tuán)選擇后代群體的鑒定與評(píng)價(jià)</p><

2、;p>　　Identification and Evaluation on three populations of Panax notoginseng by mass selection</p><p><b>　　二O一三年五月</b></p><p><b>　　獨(dú)創(chuàng)性聲明</b></p><p>　　本人聲明

3、所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得云南農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。</p><p>　　研究生簽名： 時(shí)間： 年 月

4、 日</p><p>　　關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明</p><p>　　本人完全了解云南農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保存、使用學(xué)位論文的管理辦法及規(guī)定，即：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意云南農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。</p><p>　　(

5、保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)</p><p>　　研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日</p><p>　　導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日</p><p><b>　　課題來(lái)源</b></p><p&g

6、t;　　西南地區(qū)中藥材規(guī)范化種植及大宗中藥材綜合利用開(kāi)發(fā)技術(shù)研究項(xiàng)目下課題三七規(guī)范化種植基地優(yōu)化升級(jí)及系列產(chǎn)品綜合開(kāi)發(fā)研究（2011BAI13B01）。</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　摘 要iii</b></p><p>　　Abstractv</p><p&

7、gt;<b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 三七概況1</p><p>　　1.1.1 三七植物形態(tài)特征及生境分布1</p><p>　　1.1.2 三七表型變異類型研究1</p><p>　　1.1.3 三七分子生物學(xué)特性研究2</p><p>　　1.1.4 三

8、七化學(xué)成分研究進(jìn)展2</p><p>　　1.1.5 三七藥理學(xué)研究進(jìn)展2</p><p>　　1.2 集團(tuán)選擇2</p><p>　　1.3 DUS測(cè)試3</p><p>　　1.4 分子標(biāo)記及其應(yīng)用4</p><p>　　1.5 本研究的目的意義6</p><p>　　1.6 技

9、術(shù)路線7</p><p><b>　　2 材料與方法8</b></p><p>　　2.1 試驗(yàn)材料8</p><p>　　2.1.1 供試材料8</p><p>　　2.1.2 主要儀器8</p><p>　　2.1.3 主要試劑8</p><p>　　2.2

10、 試驗(yàn)方法9</p><p>　　2.2.1 主要農(nóng)藝性狀測(cè)定9</p><p>　　2.2.1.1 表型性狀調(diào)查9</p><p>　　2.2.1.2 三七改良群體產(chǎn)量測(cè)定10</p><p>　　2.2.1.3 三七改良群體有效成分的含量測(cè)定10</p><p>　　2.2.1.4 數(shù)據(jù)分析13<

11、/p><p>　　2.2.2 三七改良群體的ISSR和SRAP研究13</p><p>　　2.2.2.1 三七基因組DNA的制備及檢測(cè)13</p><p>　　2.2.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增體系14</p><p>　　2.2.2.3 ISSR引物篩選14</p><p>　　2.2.2.4 SRAP-PC

12、R擴(kuò)增程序15</p><p>　　2.2.2.5 SRAP引物篩選17</p><p>　　2.2.2.6數(shù)據(jù)分析18</p><p>　　3 結(jié)果與分析18</p><p>　　3.1 三七改良群體主要農(nóng)藝性狀表型一致性分析18</p><p>　　3.2 三七改良群體產(chǎn)量分析21</p>

13、<p>　　3.3 三七改良群體品質(zhì)分析22</p><p>　　3.4 ISSR和SRAP標(biāo)記對(duì)3個(gè)改良群體的特異性、一致性和穩(wěn)定性分析25</p><p>　　3.4.1 DNA電泳結(jié)果25</p><p>　　3.4.2 特異性分析26</p><p>　　3.4.3 一致性分析33</p><

14、p>　　3.4.4 穩(wěn)定性分析34</p><p>　　3.4.5 ISSR和SRAP相關(guān)性分析35</p><p><b>　　4 討論36</b></p><p>　　4.1 三七集團(tuán)選擇群體的主要農(nóng)藝性狀36</p><p>　　4.2 三七集團(tuán)選擇群體的產(chǎn)量和品質(zhì)36</p><

15、;p>　　4.3 三七集團(tuán)選擇群體的一致性和穩(wěn)定性36</p><p>　　4.4 三七集團(tuán)選擇群體的綜合評(píng)價(jià)37</p><p>　　4.5 三七DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)優(yōu)化37</p><p>　　4.6 三七DUS測(cè)試的分子標(biāo)記方法比較37</p><p>　　4.7 三七集團(tuán)選擇的改良效應(yīng)38</p><

16、;p><b>　　5結(jié)論38</b></p><p><b>　　6創(chuàng)新點(diǎn)39</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)40</b></p><p><b>　　附錄46</b></p><p>　　在讀期間的學(xué)術(shù)研究49</p&

17、gt;<p><b>　　致謝50</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　三七（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）為五加科（Araliaceae）人參屬多年生草本植物，以根及根莖入藥，具有散瘀止血、消腫定痛等功效。三七已有400多年的栽培歷史，但仍無(wú)選育的品

18、種。本研究以2002年應(yīng)用集團(tuán)選擇方法建立，并經(jīng)過(guò)四代連續(xù)選擇的三七紫莖群體（purple stem population, PSP）、綠莖群體（green stem population, GSP）和緊湊型群體（compact type population, CTP）為材料，以自然群體（natural population, NP）為對(duì)照，比較了集團(tuán)選擇后代群體的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、皂苷組分，并利用ISSR和SRAP分子標(biāo)記對(duì)特異性、一

19、致性、穩(wěn)定性等進(jìn)行了鑒定和評(píng)價(jià)，以期為三七育種提供種質(zhì)材料，探討集團(tuán)選擇對(duì)三七的遺傳改良效應(yīng)。研究結(jié)果如下：</p><p>　　1. 經(jīng)四代的連續(xù)選擇，第五代三七集團(tuán)選擇后代群體的目標(biāo)性狀純度顯著高于未經(jīng)選擇的自然群體。紫莖群體、綠莖群體和緊湊型群體的莖高均小于自然群體約7 cm。紫莖群體的紫莖植株比例達(dá)到100.0%，較對(duì)照提高75.0%；綠莖群體的綠莖植株比例為100.0%，較對(duì)照提高70.0%；緊湊型群體

20、的植株復(fù)葉柄與花莖夾角≤60°的比例為76.6%，較自然群體提高41.4%。</p><p>　　2. 集團(tuán)選擇后代群體的存苗率、單根干重和產(chǎn)量均顯著高于自然群體。三個(gè)集團(tuán)選擇后代群體紫莖群體、綠莖群體和緊湊型群體的存苗率分別較自然群體提高11.6%、6.6%和13.5%；單根干重分別較自然群體提高13.4%、19.2%和34.6%；產(chǎn)量分別較自然群體提高2.7%、13.4%和55.2%。</p&

21、gt;<p>　　3. 綠莖群體的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1總皂苷含量分別為3.8%、4.9%，均顯著高于自然群體，紫莖群體和緊湊型群體與自然群體無(wú)差異。</p><p>　　4. 基于ISSR和SRAP分子標(biāo)記，第四代和第五代的3個(gè)改良群體和自然群體的特異性、一致性均顯著大于自然群體，3個(gè)改良群體的特異性和一致性關(guān)系是紫莖群體＞緊湊型群體＞綠莖群體。第四代與第五代的3個(gè)改良群體的Nei基因多樣

22、性指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)變化趨勢(shì)差異不顯著，3個(gè)改良群體的穩(wěn)定性較好。</p><p>　　5. 將ISSR和SRAP的遺傳相似性系數(shù)矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析，第四代和第五代的3個(gè)改良群體的相關(guān)系數(shù)為0.5437，達(dá)到顯著性水平。ISSR擴(kuò)增結(jié)果的遺傳相似性系數(shù)分別為0.5585~0.9231和0.6579~0.9000；SRAP擴(kuò)增結(jié)果的遺傳相似性系數(shù)分別在0.5132~0.8441和0.6258~0.853

23、7。ISSR標(biāo)記揭示的遺傳相似性系數(shù)范圍比SRAP標(biāo)記廣，說(shuō)明ISSR標(biāo)記更適用于三七集團(tuán)選擇后代的DUS測(cè)試分析。</p><p>　　綜上所述，3個(gè)集團(tuán)選擇群體均表現(xiàn)出矮桿、高存苗率的特點(diǎn)，一致性、穩(wěn)定性顯著提高，綠莖群體優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)特性突出，緊湊型群體產(chǎn)量較高，可經(jīng)進(jìn)一步鑒定評(píng)價(jià)后作為三七新品種推廣應(yīng)用。集團(tuán)選擇能夠顯著提高三七后代群體的目標(biāo)性狀純度、存苗率、單根干重、產(chǎn)量和遺傳一致性，具有良好的選擇效應(yīng)。&l

24、t;/p><p>　　關(guān)鍵詞：三七；DUS測(cè)試；集團(tuán)選擇；農(nóng)藝性狀；ISSR；SRAP；皂苷含量</p><p>　　Identification and Evaluation on three populations of Panax notoginseng by mass selection</p><p>　　Yang Yun (Botany)</p>

25、<p>　　Directed by Professor Shengchao Yang</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen belongs to Panax L. genus of Araliaceae, is a perennial herbs

26、. Its root and rootstock was used as medical herbs for its hemostatic and restorative properties. According to historical records, P. notoginseng has been cultivated for more than 400 years, still has not strains now. we

27、 used purple stem population(PSP), green stem population(GSP), compact type population( CTP) as material which was build by mass selection in 2002, and selected over four generation,</p><p>　　1. The purity o

28、f aim traits are significant higher than natural population by four generation selection. The height of purple stem population, green stem population, compact type population are lower than natural population about 7 cm.

29、 The ratio of purple stem and transition in purple stem population reaching 100.0%, increased 75.0% more than natural population. The ratio of green stem in green stem population reaching 100.0%, increased 70.0% more tha

30、n natural population. The ratio of compound l</p><p>　　2. The deposit rate, dry root and yield of offspring are significant higher than natural population. The deposit rate of purple stem population, green s

31、tem population, compact type population increased 11.6%,6.6%,13.5% more than natural population, the dry root increased 13.4%,19.2%,34.6% more than natural population, the yield increased 2.7%,13.4%,55.2% more than natur

32、al population respectively.</p><p>　　3. The content of ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 in green stem population are 3.8%, 4.9%, significant higher than natural population, show no significant among purple s

33、tem population, compact type population, natural population. </p><p>　　4. The distinctness, uniformity and stability of the four generation and five generation are significant higher than natural population

34、studied by ISSR and SRAP. The distinctness and uniformity relationship of three groups are purple stem population＞compact type population＞green stem population. The varation of Nei gene diversity index and Shannon divers

35、ity index are no significant difference, the stability of three populations are better. </p><p>　　5. The correlative coefficient is 0.5437 means of analyzing the value of GS of ISSR and SRAP, and the result

36、came out outstanding. The value of GS was estimated from 0.5585 to 0.9231 and 0.6579 to 0.9000 based on the ISSR analysis, 0.5132 to 0.8441 and 0.6258 to 0.8537 based on the SRAP analysis. The GS range of ISSR is wider t

37、han SRAP, so ISSR maker is more suitable for distinctness and uniformity study of three populations by mass selection. </p><p>　　In conclusion, the three population show short rod and high deposit rate, unif

38、ormity and stability are significant improving. The green stem population shows good quality and high output, the yield of compact type population is higher, that can be identify and evaluate as the new species used. Mas

39、s selection can improve the purity of aim trait, deposit rate, dry root, yield and genetic uniformity, has well effect of selection.</p><p>　　Key words: Panax notoginseng F H Chen; DUS testing; Mass selectio

40、n; Agronomic traits; ISSR; SRAP; Saponin contents </p><p><b>　　1 前言</b></p><p><b>　　1.1 三七概況</b></p><p>　　三七（Panax notoginseng(Burk.) F. H. Chen）為五加科（Araliac

41、eae）人參屬多年生草本植物，以根及根莖入藥，具有散瘀止血、消腫定痛等功效[1]，是我國(guó)特有的名貴中藥材之一。三七作為第三紀(jì)古熱帶的殘余植物存在于滇桂交界處，該區(qū)域被認(rèn)為是三七的發(fā)源地，三七的人工馴化栽培至今已有400多年的歷史[2]。三七以其獨(dú)特的功效，與分布于北方的人參一起共享“北參南七”的美譽(yù)?，F(xiàn)已開(kāi)發(fā)的以三七為主要原料的藥品、保健品、化妝品達(dá)300余種，如云南白藥、復(fù)方丹參滴丸等。云南省文山州等地為三七的主產(chǎn)區(qū)，2012年云南三

42、七產(chǎn)區(qū)種植面積達(dá)30萬(wàn)畝左右，到了有史以來(lái)的最高水平，其中2012年三七的采收面積約8萬(wàn)畝，成為云南省最具特色的中藥資源品種之一。</p><p>　　1.1.1 三七植物形態(tài)特征及生境分布</p><p>　　三七為多年生宿根性草本植物，株高30~60 cm，根莖粗短，主根粗壯肉質(zhì)，倒圓錐形或紡錘肉質(zhì)根一條，塊根有圓錐形（俗稱團(tuán)七、疙瘩七）和蘿卜形（俗稱蘿卜七），表明棕色或暗褐色，直徑1

43、~3 cm，有分枝多數(shù)支根。莖直立，綠色、紫色和過(guò)渡色，光滑無(wú)毛。葉為掌狀復(fù)葉，對(duì)生或者輪生于莖頂，每個(gè)掌狀復(fù)葉5~7片小葉，小葉邊緣有細(xì)鋸齒，葉片正反面及葉脈上有細(xì)小剛毛，掌狀復(fù)葉的葉柄著生處有托葉。傘形花序，頂生，花兩性，花多數(shù)，兩年即可開(kāi)花結(jié)果?；ㄆ?~9月，果實(shí)成熟10~12月，漿果，果實(shí)顏色有紅色和黃色，腎形和扁球形，種子1-2粒，近球形，塊根采收期12~1月。</p><p>　　三七起源于2500萬(wàn)

44、年前的第三古世紀(jì)熱帶的中國(guó)西南山區(qū)，主要分布局限于23°30′附近的中海拔地區(qū)，分布范圍狹小[3]。三七適宜于分布在氣溫（月平均）：最低不低于0℃，最高不高于33℃；降雨量（年）：1000~1500 mm；海拔不高于1000~1600 m，濕度75%~85%；土壤：紅壤和棕紅壤[4]。崔秀明等[5,6]對(duì)云南的文山、硯山、馬關(guān)和廣西靖西等地的三七進(jìn)行研究，從而確定了云南文山為三七的道地產(chǎn)區(qū)。</p><p&

45、gt;　　1.1.2 三七表型變異類型研究</p><p>　　目前，三七的栽培群體依舊是長(zhǎng)期栽培馴化中形成的異質(zhì)雜合體，無(wú)嚴(yán)格意義上的現(xiàn)代栽培品種[7]，是一個(gè)混雜的栽培群體，存在著多種植株上的變異。三七植株存在典型的性狀差異，如：莖稈顏色（紫桿、綠桿、過(guò)渡型）、塊根斷面顏色（綠根、紫根）、果實(shí)（紅果、黃果）、葉柄彎曲程度（直立型、平展型）、復(fù)葉數(shù)（3、4、5、6）、根的性狀（長(zhǎng)、圓）、小葉形狀（狹長(zhǎng)、普通、寬

46、葉）、莖數(shù)（1、2、3）等變異類型等[8]。三七居群間和居群內(nèi)表型變異明顯，其中地下莖變異較明顯，變異系數(shù)達(dá)0.433~0.617，生物量性狀的變異也相對(duì)較大[9]。三七栽培群體個(gè)體間主要皂苷組分含量相差3.6~10.2倍，總皂苷含量則相差2.0倍[10]。</p><p>　　1.1.3 三七分子生物學(xué)特性研究</p><p>　　三七為二倍體植物，染色體組X=12，全部為中著絲點(diǎn)染色體

47、，臂比的范圍在1.68~1.17間，全部染色體的臂比值小于2。三七經(jīng)過(guò)多年的人工馴化栽培，其栽培群體從遺傳背景來(lái)看還是一個(gè)雜合體，具有豐富的遺傳多樣性[11,12]。張金渝等[7]選取了4個(gè)不同區(qū)域的17份三七選育品系，通過(guò)EST-SSR標(biāo)記研究了集團(tuán)選擇的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三七具有豐富的遺傳多樣性，彼此間具有較高的基因交流，居群間遺傳分化水平低，居群內(nèi)遺傳差異較大。肖慧等[13]通過(guò)同工酶標(biāo)記研究了三七種內(nèi)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)遺傳變異主要存在居

48、群間，居群內(nèi)分化較小。然而，三七卻是長(zhǎng)期未經(jīng)遺傳改良和沒(méi)有其他基因資源引入的混雜群體，至今尚無(wú)三七栽培群體內(nèi)的類型篩選和品種選育方面的研究工作。引入野生種質(zhì)和篩選栽培群體內(nèi)優(yōu)良類型，并通過(guò)鑒定和篩選這些種內(nèi)變異類型，建立栽培群體種質(zhì)庫(kù)，成了三七栽培物種遺傳改良的主要途徑。</p><p>　　1.1.4 三七化學(xué)成分研究進(jìn)展</p><p>　　三七作為傳統(tǒng)中藥已有悠久的應(yīng)用歷史，國(guó)內(nèi)外研

49、究結(jié)果表明，三七的主要化學(xué)成分是皂苷類，此外還有糖類、氨基酸、黃酮類、甾醇類、聚炔甾醇類、有機(jī)酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分[14-21]。</p><p>　　1.1.5 三七藥理學(xué)研究進(jìn)展</p><p>　　研究結(jié)果表明，三七具有止血、抗血栓形成、保護(hù)心肌、抗冠心病、保護(hù)腦組織、擴(kuò)血管和降壓、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、增智、抗炎、保肝、滋補(bǔ)、強(qiáng)壯、抗衰老等作用[22-26]。</p><

50、p><b>　　1.2 集團(tuán)選擇</b></p><p>　　集團(tuán)選擇就是在比較復(fù)雜的原始群體中（種性來(lái)源不一），選擇各種類型的個(gè)體，在將入選個(gè)體歸類組成幾個(gè)集團(tuán)，如高桿類、矮桿類、早熟類、晚熟類等。將同一類型的入選個(gè)體混合脫粒，播種在一個(gè)小區(qū)內(nèi)，將各集團(tuán)與原始群體進(jìn)行比較鑒定，從而選出優(yōu)良集團(tuán)[27]。集團(tuán)選擇法簡(jiǎn)單易行，易為群眾掌握，且后代生活力不易衰退，集團(tuán)內(nèi)性狀一致性提高比混合

51、選擇快，比單株選擇慢。</p><p>　　楊生超等[28]應(yīng)用集團(tuán)選擇的方法，成功選育出燈盞花（Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.）優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)新品種“千山1號(hào)”和“千山2號(hào)”。近年來(lái)人參育種取得了很大成效，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所趙亞會(huì)等人1986~1996年根據(jù)人參育種現(xiàn)狀和特點(diǎn)，在人參混合群體中，以單根重、根形等經(jīng)濟(jì)性狀選擇了4個(gè)集團(tuán)，現(xiàn)已成功育成2個(gè)人參新品種—“

52、吉參1號(hào)”和“吉林黃果參”，表現(xiàn)出產(chǎn)量高、單根重、根形美觀、植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、種子千粒重和皂苷含量高等優(yōu)點(diǎn)[29,30]?！暗嶂貥?號(hào)”采用了集團(tuán)混合選擇法，經(jīng)6年而育成。莖桿為淡紫色、多莖、莖數(shù)為“滇重樓1號(hào)”的5倍多；根莖有效成分重樓皂苷Ⅰ和Ⅱ總量為(1.43± 0.23)%，高于藥典，多達(dá)78.8%；產(chǎn)量是“滇重樓1號(hào)”的2倍[31]。油菜的雜交選擇育種通常采用的是集團(tuán)選擇和系譜有機(jī)結(jié)合的選擇方法，形成了油菜系譜集團(tuán)選擇法，并

53、應(yīng)用于油菜品系的選育中[32,33]?！皩廂?號(hào)”就是采用集團(tuán)選擇法育成的品種之一，品種顯示出推廣面積大、高產(chǎn)、穩(wěn)定等特點(diǎn)[34]。</p><p><b>　　1.3 DUS測(cè)試</b></p><p>　?。?）DUS測(cè)試的概念和意義</p><p>　　DUS測(cè)試是對(duì)植物新品種的特異性（Distinctness）、一致性（Uniformi

54、ty）和穩(wěn)定性（Stability）進(jìn)行測(cè)試的過(guò)程[35]，是一個(gè)農(nóng)作物新品種應(yīng)具備的三個(gè)基本條件，是植物新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和授予品種權(quán)的科學(xué)依據(jù)[36]。</p><p>　　（2）DUS測(cè)試的應(yīng)用</p><p>　　目前國(guó)外DUS測(cè)試主要有3鐘形式：官方測(cè)試、育種者測(cè)試和二者結(jié)合的測(cè)試。中國(guó)于1997年3月，公布了《中華人民共和國(guó)植物新品種保護(hù)條列》，并于1999年加入了國(guó)際植物新

55、品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV），同年受理公布了18個(gè)植物屬或種的新品種[37]。目前，菊花[38]、唐菖蒲[39]、百合[40]、紅花[41]、柴胡[42]等藥用植物已經(jīng)制定了新品種DUS測(cè)試指南且進(jìn)行了DUS測(cè)試。以農(nóng)藝性狀為基礎(chǔ)的DUS測(cè)試易受周期長(zhǎng)、測(cè)試指標(biāo)多、操作復(fù)雜、季節(jié)限制和外界環(huán)境干擾等影響，尋找可靠的方法來(lái)完善現(xiàn)有的DUS測(cè)試技術(shù)已經(jīng)成為植物新品種DUS測(cè)試的關(guān)鍵。綜合各方面考慮，DNA指紋技術(shù)就能夠補(bǔ)充形態(tài)學(xué)上的缺點(diǎn)[43]

56、。</p><p>　　1.4 分子標(biāo)記及其應(yīng)用</p><p>　　近年來(lái)，遺傳標(biāo)記在植物品種（品系）鑒定上被越來(lái)越多地應(yīng)用。常用的遺傳標(biāo)記有以下幾大類：形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記、分子標(biāo)記。</p><p><b>　?。?）形態(tài)學(xué)標(biāo)記</b></p><p>　　形態(tài)學(xué)標(biāo)記是指在植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，用肉眼能觀察

57、到的外部形態(tài)特征或特性，如：葉形、花型、枝態(tài)、株高、粒重、穗長(zhǎng)、果形等。張忠義等[44]在對(duì)9個(gè)主要性狀建立專家打分系統(tǒng)及種質(zhì)資源定量評(píng)估的基礎(chǔ)上，根據(jù)方差分析結(jié)果將洛陽(yáng)牡丹品種劃分為優(yōu)、良、一般和差4個(gè)等級(jí)。舒世珍等[45]對(duì)國(guó)外紅花優(yōu)異資源進(jìn)行了評(píng)價(jià)、鑒定與聚類分析，初步認(rèn)為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、油花兼用資源是優(yōu)中之優(yōu)。</p><p>　　李靜等[46]對(duì)40份石斛蘭種質(zhì)的植物學(xué)性狀、農(nóng)藝性狀進(jìn)行觀察，以觀賞

58、性為指標(biāo)劃分出了迷你小花型、蝴蝶石斛型、羚羊角石斛型等三種類型。形態(tài)標(biāo)記雖然簡(jiǎn)單直觀，但是其標(biāo)記數(shù)有限、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件影。如需在短期內(nèi)了解變異性而其他方法又無(wú)法開(kāi)展之時(shí)，形態(tài)學(xué)手段是一種有價(jià)值的選擇。</p><p><b>　　（2）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記</b></p><p>　　此方法是將染色體細(xì)胞學(xué)形態(tài)作為遺傳標(biāo)記，表現(xiàn)在染色體數(shù)目變異（整倍性或非整倍性）和染色

59、體結(jié)構(gòu)變異（缺失、倒位、易位、重位）等。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記主要包括核型、染色體帶型、原位雜交及染色體的非整倍性和結(jié)構(gòu)變異等。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記不受環(huán)境的影響，但其所需材料較多、人力投入大和花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且鑒定分析繁瑣。</p><p><b>　?。?）生化標(biāo)記</b></p><p>　　指生物的生化特征與特性，主要包括貯藏蛋白、次生代謝物和同工酶[47]。與形態(tài)性狀、細(xì)胞學(xué)特征相比

60、，生化標(biāo)記表現(xiàn)中性，對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀沒(méi)有顯著的不良影響；可以直接反映基因產(chǎn)物的差異，具有數(shù)量更豐富、受環(huán)境影響較小等優(yōu)點(diǎn)。</p><p><b>　?。?）分子標(biāo)記</b></p><p>　　分子標(biāo)記是用一定的方法在DNA水平上反映物種個(gè)體間或種群間DNA片段上的差異，是遺傳多樣性在DNA水平上的直接反映。依據(jù)對(duì)DNA多態(tài)性的檢測(cè)手段的不同，DNA標(biāo)記可以分為三大類：第

61、一類是以PCR為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)（RAPD、AFLP、SSR、ISSR、STS、EST、SRAP、RP-PCR、RD-PCR）；第二類是以基因組序列為核心的分子標(biāo)記技術(shù)（SNP、InDel、cSSR、ITS)；第三類是以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)（RFLP、SSCP-RFLP、DGGE-RFLP）。目前最常用的有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、SRAP等，并且已經(jīng)在一些植物上開(kāi)展了與DUS相關(guān)的研究。這些研

62、究為利用分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展DUS測(cè)試奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)[48,49]。</p><p>　?、傧拗菩悦盖衅伍L(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP）</p><p>　　RFLP（Restriction Fragment length polymorphic DNA marker，限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性），是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定的DNA片段的大小，由Grodzicker創(chuàng)立于197

63、4年[50]，也是最早發(fā)展起來(lái)和應(yīng)用最廣的分子標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于解釋種群間關(guān)系或推斷種上的系統(tǒng)發(fā)育，測(cè)量種內(nèi)、居群間和居群間的變化，研究系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化學(xué)，以及構(gòu)建連鎖群的遺傳圖譜等方面[51]。</p><p>　　RFLP標(biāo)記特點(diǎn)是共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型，而且穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)。但是RFLP也存在著一些缺點(diǎn)：費(fèi)用昂貴、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、周期長(zhǎng)、所需的DNA樣品量較大。</p><p&g

64、t;　?、陔S機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）</p><p>　　RAPD（Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA），由Williams和Welsh 1990年領(lǐng)導(dǎo)的2個(gè)研究小組幾乎同時(shí)發(fā)展起來(lái)的，建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[52,53]。RAPD的優(yōu)點(diǎn)是：不需要DNA探針、使用隨機(jī)引物、技術(shù)操作簡(jiǎn)單和快捷、分析所需DNA量少。局限性：為顯

65、性標(biāo)記，不能在F2代區(qū)分純合體和雜合體，須進(jìn)行F3代分析；退火溫度較常規(guī)PCR反應(yīng)低，擴(kuò)增結(jié)果易受外界因素的影響，重復(fù)性較差。目前，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在檢測(cè)遺傳多樣性、基因定位，品系鑒定、醫(yī)學(xué)診斷、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)學(xué)研究等領(lǐng)域中[54-59]。</p><p>　?、蹟U(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（AFLP）</p><p>　　AFLP（Amplified fragment length poly

66、morphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性），是1993年由荷蘭keygene公司科學(xué)家Zabeau等人發(fā)明的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)[60]。AFLP技術(shù)是將RFLP與PCR結(jié)合的一種方法，即繼承了RFLP技術(shù)的穩(wěn)定性，又具有PCR反應(yīng)快速、靈敏的特點(diǎn)，同時(shí)克服了RFLP和RAPD的缺點(diǎn)，且擴(kuò)增的條紋多，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高[61]，其缺點(diǎn)是對(duì)模板反應(yīng)遲鈍、成本高、對(duì)技術(shù)要求嚴(yán)格[62]。AFLP標(biāo)記已應(yīng)用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、品種純度鑒定、檢測(cè)遺傳多

67、樣性、種質(zhì)資源鑒別、定位克隆基因等方面[63-67]。</p><p>　　④簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）</p><p>　　SSR（Simple Sequence Repeat，微衛(wèi)星DNA），是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（1~6個(gè)）為重復(fù)單位的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)DNA序列，通常為2~3個(gè)核苷酸[68]。優(yōu)點(diǎn)：共顯性標(biāo)記、結(jié)果重復(fù)性高、比RFLP的多態(tài)性豐富和操作簡(jiǎn)單快速。缺點(diǎn)：需建立篩選基因組文庫(kù)和

68、克隆測(cè)序、工作量大、費(fèi)時(shí)、費(fèi)用高等。目前，該方法已應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、構(gòu)建品種指紋圖譜、遺傳多樣性研究等方面[69-71]。</p><p>　?、莺?jiǎn)單重復(fù)間序列標(biāo)記（ISSR）</p><p>　　ISSR(Inter-simple sequence repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)間序列)，是Zietkeiwitcz等[72]于1994年提出來(lái)的一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記。它應(yīng)用錨定的微衛(wèi)星D

69、NA為引物，即在SSR序列的3ˊ端或5ˊ端加上2~4個(gè)隨機(jī)核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ISSR結(jié)合了簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記技術(shù)和隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)[73]，其引物不但能在種間通用，而且更能揭示物種間的多態(tài)性，其檢測(cè)手段非常方便快捷?，F(xiàn)已被應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定和指紋圖譜構(gòu)建[74,75]、遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究[76,

70、77]、基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇[78]等方面的研究。</p><p>　　⑥相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(SRAP)</p><p>　　SRAP（Sequence related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）分子標(biāo)記是一種結(jié)合了RAPD、AFLP、RFLP等分子標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)并克服其缺點(diǎn)的PCR標(biāo)記系統(tǒng)的顯性新型標(biāo)記，是通過(guò)獨(dú)特的雙引物（17 bp上游引物和

71、18 bp下游引物）設(shè)計(jì)對(duì)啟動(dòng)子或內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，其引物具有通用性，由美國(guó)加州大學(xué)作物系Li和Quiros博士提出的[79]。SRAP分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、易操作、快捷方便、成本低、在基因組中分布均勻、易對(duì)特定序列進(jìn)行測(cè)序與相關(guān)基因的克隆等諸多優(yōu)點(diǎn)。SRAP標(biāo)記基礎(chǔ)自建立起來(lái)，已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建遺傳圖譜、遺傳多樣性研究、比較基因組學(xué)、標(biāo)定基因等方面[80-83]。</p><p>　　1.5 本

72、研究的目的意義</p><p>　　本研究以2002年應(yīng)用集團(tuán)選擇方法建立，并經(jīng)過(guò)四代連續(xù)選擇的三七紫莖群體、綠莖群體和緊湊型群體為材料，以自然群體為對(duì)照，比較了集團(tuán)選擇后代群體的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量、皂苷組分，并利用ISSR和SRAP分子標(biāo)記對(duì)特異性、一致性、穩(wěn)定性等進(jìn)行了鑒定和評(píng)價(jià)，以期為三七育種提供種質(zhì)材料，探討集團(tuán)選擇對(duì)三七的遺傳改良效應(yīng)。</p><p><b>　　1.6

73、技術(shù)路線</b></p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 試驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 供試材料</p><p>　　云南省文山州文山三七科技示范園于2002年以矮桿、莖色和復(fù)葉柄與花莖夾角這三個(gè)性狀為指標(biāo)，利用集團(tuán)選擇

74、法成功構(gòu)建了紫莖群體（purple stem population, PSP）、綠莖群體（green stem population, GSP）和緊湊型群體（compact type population, CTP）三份材料，其中紫莖群體和綠莖群體經(jīng)過(guò)了四代多的純化，其純度已經(jīng)達(dá)到90%。2012年3個(gè)改良群體已經(jīng)繁殖到了第五代。本研究的試驗(yàn)材料種植于云南省文山州文山三七科技示范園基地試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，取面積相等的4個(gè)小區(qū)

75、用于試驗(yàn)，小區(qū)面積為6.4 m2，種子種植密度、田間管理措施等一致。試驗(yàn)材料主要為第四代的3個(gè)改良群和自然群體的三年生植株幼嫩葉片及塊根，第五代的一年生植株幼嫩葉片。</p><p>　　2.1.2 主要儀器</p><p>　　試驗(yàn)所用主要儀器為游標(biāo)卡尺、直尺、量角器、電子天平和卷尺、水浴鍋、冰箱、滅菌鍋、DYCZ-30型電泳儀及配套電泳槽(北京六一廠)、Sigma 3-16PK 型冷凍

76、離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、BIO-RAD thermal cycle PCR 儀、Agilent 1260 Infinity 液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、SB-5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）、美國(guó)丹佛電子分析天平TP-214、Mettler-Toledo AE240型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、奧利邦1000A型粉碎機(jī)（上海賽耐機(jī)械有限公司）。</p><p>　　

77、2.1.3 主要試劑</p><p>　　Taq DNA酶、dNTPs、Buffer等均購(gòu)于昆明云科生物技術(shù)有限公司，ISSR引物、SRAP引物、Maker、無(wú)水乙醇、EDTA-Na2·2H2O、Tris、瓊脂糖等產(chǎn)品購(gòu)自昆明碩陽(yáng)科技有限公司；對(duì)照品人參皂苷Rg1（020101S，純度＞98%）、人參皂苷Re(020103S，純度＞98%)、人參皂苷Rb1(020105S，純度＞98%)、人參皂苷Rd(

78、020102S，純度＞98%)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，三七皂苷R1（11074S-200617，供含量測(cè)定用）購(gòu)自中國(guó)食品生物制品檢定所。甲醇、乙腈為色譜純（天津市西華特種試劑廠），水為娃哈哈純凈水，0.45µm微孔膜，其余試劑和試藥均為分析純。</p><p><b>　　2.2 試驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 主要農(nóng)藝性狀測(cè)定<

79、;/p><p>　　2.2.1.1 表型性狀調(diào)查</p><p>　　三七植株的性狀觀測(cè)參照植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南（三七）的要求，選擇田間觀測(cè)性狀28個(gè)。將所觀測(cè)性狀分為質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀，質(zhì)量性狀進(jìn)一步劃分為二元性狀和多態(tài)性狀。上述28個(gè)性狀分為4個(gè)二元性狀、8個(gè)多態(tài)性狀及16個(gè)數(shù)量性狀（見(jiàn)表2-1）。每個(gè)改良群體按小區(qū)3、6、9行順序依次取樣20株進(jìn)行觀測(cè)，重復(fù)測(cè)量3次，

80、最后取平均值。二元和多態(tài)性狀參照模式圖用肉眼進(jìn)行觀測(cè)；數(shù)量性狀采用游標(biāo)卡尺、直尺、量角器、電子天平和卷尺等測(cè)定[84]。對(duì)于質(zhì)量性狀，以各性狀的眾數(shù)頻數(shù)的算術(shù)平均值表示；數(shù)量性狀用算術(shù)平均值和變異系數(shù)來(lái)表示。</p><p>　　表2-1 三七表型一致性分析所選的28個(gè)觀測(cè)性狀編碼</p><p>　　Table 2-1 Twenty-eight characters and codes

81、of P. notoginseng for the analysis of morphological uniformity </p><p>　　2.2.1.2 三七改良群體產(chǎn)量測(cè)定</p><p>　　2012年12月中旬對(duì)第四代集團(tuán)選擇的3個(gè)改良群體和自然群體的塊根進(jìn)行采挖，洗凈泥土，隨機(jī)選取60株新鮮塊根用于稱重，自然晾干后稱取單株干重。并依據(jù)試驗(yàn)小區(qū)三七塊根實(shí)際采挖量計(jì)算各個(gè)群體

82、的存苗率和產(chǎn)量等。</p><p>　　2.2.1.3 三七改良群體有效成分的含量測(cè)定</p><p>　?。?）供試樣品的制備</p><p>　　參考《中國(guó)藥典》2010年版（一部）中三七含量測(cè)定項(xiàng)下供試溶液制備的方法，精密稱取自然晾干并打粉的的三七塊根樣品（過(guò)40目篩）0.6 g置于50 mL容量瓶中，加入30 mL 100%甲醇溶液浸泡30 min，超聲提取

83、1 h，再用甲醇定容至刻度，搖勻，靜置30 min。用0.45 µm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，即得供試液。</p><p>　?。?）對(duì)照品溶液的制備</p><p>　　精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，制得上述對(duì)照品溶液，濃度分別為0.454，0.355，0.462，0.466，

84、0.449 mg·mL-1，4℃保存，備用。</p><p><b>　　（3）色譜條件</b></p><p>　　色譜柱為Agilent Zorbar SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 µm),流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），流速1.5 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30℃，流動(dòng)相洗脫方法見(jiàn)表2-2。

85、</p><p>　　表2-2 流動(dòng)相梯度洗脫方法</p><p>　　Table 2-2 Method of Mobile phase gradient elute</p><p><b>　?。?）方法學(xué)考察</b></p><p><b>　　①精密度試驗(yàn)</b></p><

86、;p>　　選取3個(gè)改良群體中的紫莖群體，按“（1）”項(xiàng)下制備供試溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積RSD分別為三七皂苷R1:0.78%，人參皂苷Rg1:1.25%，人參皂苷Re:0.85%，人參皂苷Rb1:1.06%，人參皂苷Rd:0.73%。</p><p><b>　?、谥貜?fù)性試驗(yàn)</b></p><p>　　精密稱取紫莖群體塊根粉末（過(guò)40目篩）0.6 g，平

87、均6份，按“（1）”項(xiàng)下制備6份供試溶液，每次進(jìn)樣10 µL。按“（3）”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的平均含量分別為1.06%，6.62%，0.75%，2.40%，0.45%；RSD分別為1.5%，1.2%，1.5%，1.4%，1.6%。</p><p><b>　?、鄯€(wěn)定性試驗(yàn)</b></p>&l

88、t;p>　　按“(1)”下制備供試溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“（3）”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 µL測(cè)定，記錄峰面積值，對(duì)樣品進(jìn)行分析。結(jié)果表明，三七中各皂苷峰面積積分值變化不大，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的峰面積RSD分別為0.44%、0.31%、0.35%、0.28%、0.59％，表明樣品在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。</p>

89、<p><b>　　④加樣回收率試驗(yàn)</b></p><p>　　精密稱取6份已知含量的紫莖群體塊根粉末（過(guò)40目篩），每份0.3 g。分別準(zhǔn)確加入與樣品含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品溶液，按“（1）”項(xiàng)下制備供試溶液，依次測(cè)定五種主要皂苷成分的峰面積并計(jì)算回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的平均回收率分別為98.92%、98.97%、98.73%、

90、99.01%、98.86%；RSD分別為1.09%、1.36%、1.34%、1.21%、1.37%。</p><p>　　（5）線性關(guān)系考察 </p><p>　　設(shè)置進(jìn)樣程序，分別進(jìn)樣三七皂苷R1 3 µL、人參皂苷Rg1 16 µL、人參皂苷Re 7 µL、人參皂苷Rb1 13 µL、人參皂苷Rd 4 µL得到對(duì)照品混合溶液，重復(fù)3次，

91、記錄色譜圖，得到三七總皂苷對(duì)照品HPLC色譜圖（圖1）。分別精密吸取三七總皂苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15 µL，用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5種對(duì)照品的峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表2-3。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。</p><p>　　表2-3 5種對(duì)照品的線性方程</p><p>　　Table 2-3 Linea

92、r equation of five Reference substance</p><p>　　圖1 三七總皂苷HPLC指紋圖譜</p><p>　　Fig.1 Total saponin of HPLC Fingerprinting of P. notoginseng</p><p>　　圖2 三七總皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　F

93、ig.2 The standard curve of total saponins of P. notoginseng</p><p><b>　　（6）樣品含量測(cè)定</b></p><p>　　精密稱取3個(gè)改良群體的塊根粉末（過(guò)40目篩）0.6 g，按“（1）”項(xiàng)下制備供試溶液，按“（3）”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 µL測(cè)定，記錄峰面積值，采用外標(biāo)法，分別計(jì)

94、算樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd等5種主要皂苷的含量。</p><p>　　2.2.1.4 數(shù)據(jù)分析</p><p>　　利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。</p><p>　　2.2.2 三七改良群體的ISSR和SRAP研究</p><p>　　2.2.2.1 三

95、七基因組DNA的制備及檢測(cè)</p><p>　　以三七幼葉為材料，利用改良CTAB法提取基因組DNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA質(zhì)量，計(jì)算DNA的濃度，并稀釋至30 ng·µL-1，檢測(cè)合格的樣品DNA保存于-20℃冰箱備用。</p><p>　　2.2.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增體系</p><p>　　試驗(yàn)所用引

96、物參照加拿大溫哥華哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的第九套ISSR引物序列，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。</p><p>　　ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為（15 µL）：</p><p>　　10×PCR Buffer(Mg2+) 1.5 μL</p><p>　　dNTPs

97、 1.2 μL</p><p>　　引物 1 μL</p><p>　　Taq酶（5 U·μL-1） 0.15 μL</p><p>　　DNA模板（30 ng·μL-1） 1 μL</p><p>　　ddH2O

98、 10.15 μL</p><p>　　擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min→94℃變性30 s→各ISSR引物的退火溫度60 s→72℃延伸90 s→38個(gè)循環(huán)，完成最后一個(gè)循環(huán)后→72℃延伸7 min→4℃保存。</p><p>　　所有的PCR擴(kuò)增反應(yīng)都在BIO-RAD thermal cycle PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增結(jié)束后，采用l

99、×TAE電泳緩沖液，在2%瓊脂糖(含EB)凝膠中電泳，電泳條件為90 V，1.5 h，同時(shí)在瓊脂糖凝膠的左邊第一孔位置加上一個(gè)已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品(2000bp DNA LadderMarker)，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)下拍照，用于數(shù)據(jù)的分析。</p><p>　　2.2.2.3 ISSR引物篩選</p><p>　　從加拿大溫哥華哥倫比亞大學(xué)開(kāi)發(fā)的100個(gè)ISSR引物中

100、隨機(jī)選取60個(gè)引物，在北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行合成，根據(jù)其Tm值，分別用Tm±5℃來(lái)確定每條引物合適的退火溫度，共篩選出了16個(gè)特異性強(qiáng)和條帶多的引物用于試驗(yàn)，見(jiàn)表2-4。</p><p>　　表2-4 16個(gè)ISSR引物序列表</p><p>　　Table 2-4 Sixteen ISSR primers</p><p>　　Y = (C

101、, T)；R = (A , G)</p><p>　　2.2.2.4 SRAP-PCR擴(kuò)增程序</p><p>　　SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為（20 µL）：</p><p>　　10×PCR Buffer(Mg2+) 2 μL</p><p>　　dNTPs

102、 1.6 μL</p><p>　　正反向引物各 1 μL</p><p>　　Taq 酶（5 U·μL-1） 0.2 μL</p><p>　　DNA模板（30 ng·μL-1） 1 μL</p><p>　　dd H2O

103、 13.2 μL</p><p>　　擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，共5個(gè)循環(huán)；隨后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。所有的PCR擴(kuò)增反應(yīng)均在BIO-RAD thermal cycle PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)

104、增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。</p><p>　　SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)步驟：</p><p>　?。?）聚丙烯酰胺凝膠的制備</p><p><b>　?、偾逑床ＡО澹?lt;/b></p><p>　　將短板、長(zhǎng)板、梳子、邊條等用洗滌劑清洗干凈，然后用蒸餾水擦拭，再用酒精橫向和豎向擦

105、拭，晾干。</p><p>　?、谕堪澹簩㈤L(zhǎng)短板水平放置，分別在長(zhǎng)板及短板上涂上親和硅烷和剝離硅烷，涂完板后將板放置20 min以上，充分晾干備用。</p><p>　?、劬郾┠z的配制（6%）</p><p>　　30%母液 28 mL</p><p>　　5×TBE 14 mL</p&g

106、t;<p>　　10%AP 467 µL</p><p>　　TEMED 35 µL</p><p><b>　　④灌膠</b></p><p>　　將封好的膠板傾斜30°放置，從邊緣輕緩灌入凝膠，邊灌邊輕輕敲打玻璃板，使膠擴(kuò)散均勻，并于室溫下放置2 h左右，待凝膠

107、完全后進(jìn)行電泳。</p><p>　?。?）擴(kuò)增產(chǎn)物的變性及凝膠電泳分析</p><p>　　在SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(20 µL)中加入6 µL Loading Buffer，振蕩混勻，在4℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p><b>　?、倌z電泳</b></p><p><b>　　a）預(yù)電

108、泳</b></p><p>　　將凝膠板組裝到電泳儀上，在電泳槽中加入1×TBE緩沖液，接通電源準(zhǔn)備預(yù)電泳，預(yù)電泳30 min左右。吹洗膠面上的殘膠，關(guān)閉電泳儀準(zhǔn)備點(diǎn)樣。</p><p><b>　　b）加樣及電泳</b></p><p>　　吸取產(chǎn)物6 µL，加入到鋸齒空出，中間位置加入4 µL 20

109、00bpDNAMarker，1500 V，60 W，60 mA電泳2 h左右，待Buffer跑至距離膠板底部1/5處時(shí)即停止電泳。</p><p><b>　　（3）凝膠的銀染</b></p><p><b>　?、俟潭?脫色</b></p><p>　　放去緩沖液，將膠板從電泳槽取下，將兩板小心分開(kāi)，取下短板，將長(zhǎng)膠板放