五種紅色葉植物色素分析碩士論文

1、<p>　　分類號： S687 學(xué)校代碼：10712</p><p>　　UDC： 635.9 研究生學(xué)號：2010051546</p><p>　　密級： 公 開 &

2、lt;/p><p>　　2013屆攻讀碩士學(xué)位研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文</p><p>　　五種紅色葉植物葉片色素分析</p><p>　　學(xué) 科 專 業(yè) 園林植物與觀賞園藝</p><p>　　研 究 方 向 園林植物育種 </p><p>　　研究生 李 玲 </p>

3、;<p>　　指 導(dǎo) 教 師 李厚華 副教授 </p><p>　　完 成 時(shí) 間 2013年5月 </p><p>　　中國 陜西 楊凌</p><p>　　Classification code: S687 University code: 10712</p><p&

4、gt;　　UDC: 635.9 Postgraduate number:2010051546</p><p>　　Confidentiality level: Public </p><p>　　Thesis for Master’s Degree</p><p>　　Northwest A＆F University i

5、n 2013 </p><p>　　THE RESEARCH ON THE CHROMOGENIC</p><p>　　PIGMENTS OF LEAVES IN FIVE RED PLANTS</p><p>　　Major:Garden plant and ornamental horticulture</p><p>　　Resear

6、ch field:Garden plant genetics and breeding</p><p>　　Name of Postgraduate:Li Ling</p><p>　　Adviser:Associate Prof. Li Houhua</p><p>　　Date of submission:May, 2013</p><p&g

7、t;　　Yangling Shanxi China</p><p>　　研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文的獨(dú)創(chuàng)性聲明</p><p>　　本人聲明：所呈交的碩士學(xué)位（畢業(yè)）論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行的研究工作及取得的研究結(jié)果；論文中的研究數(shù)據(jù)及結(jié)果的獲得完全符合學(xué)?！蛾P(guān)于規(guī)范西北農(nóng)林科技大學(xué)研究生學(xué)術(shù)道德的暫行規(guī)定》,如果違反此規(guī)定，一切后果與法律責(zé)任均由本人承擔(dān)。</p>

8、<p>　　盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究結(jié)果，也不包含其他人和自己本人已獲得西北農(nóng)林科技大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同事對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文的致謝中作了明確的說明并表示了謝意。</p><p>　　研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日</p&g

9、t;<p>　　導(dǎo)師指導(dǎo)研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文的承諾</p><p>　　本人承諾：我的碩士研究生 所呈交的碩士學(xué)位（畢業(yè)）論文是在我指導(dǎo)下獨(dú)立開展研究工作及取得的研究結(jié)果，屬于我現(xiàn)崗職務(wù)工作的結(jié)果，并嚴(yán)格按照學(xué)?！蛾P(guān)于規(guī)范西北農(nóng)林科技大學(xué)研究生學(xué)術(shù)道德的暫行規(guī)定》而獲得的研究結(jié)果。如果違反學(xué)?！蛾P(guān)于規(guī)范西北農(nóng)林科技大學(xué)研究生學(xué)術(shù)道德的暫行規(guī)定》，我愿接受按學(xué)校有關(guān)規(guī)定的處罰

10、處理并承擔(dān)相應(yīng)導(dǎo)師連帶責(zé)任。</p><p>　　導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日</p><p>　　關(guān)于研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文使用授權(quán)的說明</p><p>　　本學(xué)位（畢業(yè)）論文的知識產(chǎn)權(quán)歸屬西北農(nóng)林科技大學(xué)。本人同意西北農(nóng)林科技大學(xué)保存或向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和電子版，允許論文被查閱和借

11、閱；同意西北農(nóng)林科技大學(xué)將本學(xué)位（畢業(yè)）論文的全部或部分內(nèi)容授權(quán)匯編錄入《中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》進(jìn)行出版，并享受相關(guān)權(quán)益。</p><p>　　本人保證，在畢業(yè)離開（或者工作調(diào)離）西北農(nóng)林科技大學(xué)后，發(fā)表或者使用本學(xué)位（畢業(yè)）論文及其相關(guān)的工作成果時(shí)，將以西北農(nóng)林科技大學(xué)為第一署名單位，否則，愿意按《中華人民共和國著作權(quán)法》等有關(guān)規(guī)定接受處理并承擔(dān)法律責(zé)任。</p><p>　　

12、任何收存和保管本論文各種版本的其他單位和個(gè)人(包括研究生本人)未經(jīng)本論文作者的導(dǎo)師同意，不得有對本論文進(jìn)行復(fù)制、修改、發(fā)行、出租、改編等侵犯著作權(quán)的行為，否則，按違背《中華人民共和國著作權(quán)法》等有關(guān)規(guī)定處理并追究法律責(zé)任。</p><p>　　（保密的學(xué)位論文在保密期限內(nèi)，不得以任何方式發(fā)表、借閱、復(fù)印、縮印或掃描復(fù)制手段保存、匯編論文）</p><p>　　研究生簽名：　　　　　　

13、 時(shí)間：　　　年　　　月　　　日</p><p>　　導(dǎo) 師 簽名：　　 　　 　 時(shí)間：　　　年　　　月　　　日</p><p>　　五種紅色葉植物葉片色素分析</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　以五種紅色葉植物紫葉小檗（Berberis thunbergii‘a(chǎn)tropurp

14、urea’）、王族海棠(Malus ‘Royalty’)、紫葉桃（Prunus persica ‘Atropurpurea’）、紫葉李（Prunus ceraifera cv. Pissardii）、紅楓（Acer palmatum cv. Atropuceum）葉片為試材，用薄層層析色譜法(TLC)、顏色特征反應(yīng)、紫外—可見分光光度計(jì)(UV)和高效液相色譜儀—二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)對五種植物葉片內(nèi)色素進(jìn)行定性分析；用HP

15、LC-DAD法對葉片內(nèi)單體酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量分析，初步明確了該五種植物紅色葉片的決定色素及輔助色素（co-pigment），闡明了五種紅色葉植物葉片呈色機(jī)理，研究結(jié)果表明：</p><p>　　矢車菊素及其衍生物是五種紅色葉植物葉片呈色的共同決定色素，葉綠素、類胡蘿卜素及其它類黃酮作為輔色素對紅色葉片的形成起著輔助的作用。不同植物色素的構(gòu)成有差別，紫葉小檗中紫紅色葉片形成的決定色素是矢車菊素（Cy）、矢車菊素半乳

16、糖苷（Cy-gal）及微量的矮牽牛素（Pt）；王族海棠葉片中的花青素及其苷類有矢車菊素（Cy）、矢車菊素半乳糖苷（Cy-gal）；紫葉桃中紅色葉形成的主導(dǎo)色素為矢車菊素（Cy）、矢車菊素半乳糖苷（Cy-gal）、天竺葵素（Pg）、飛燕草素（Dp）；紫葉李葉片中含有的花青素及其苷類有矢車菊素（Cy）、矢車菊素半乳糖苷（Cy-gal）、矢車菊素蕓香苷（Cy-ru）、阿拉伯糖苷（Arab）、天竺葵素（Pg）和矮牽牛素（Pt）；紅楓階段性紅葉的

17、決定色素為矢車菊素（Cy）、矢車菊素半乳糖苷（Cy-gal）、矢車菊素蕓香苷（Cy-ru）、矮牽牛素（Pt）。</p><p>　　葉綠素與花青苷/素的含量對比明顯的影響葉片的呈色，花青苷在光照充足條件下合成較多，其機(jī)理導(dǎo)致光照充足的地方因?yàn)榛ㄇ嘬蛰^葉綠素占優(yōu)勢而葉片呈現(xiàn)紅色，在光照較弱的地方因?yàn)槿~綠素較花青苷占優(yōu)勢而使綠色為主導(dǎo)色。而當(dāng)花青苷與葉綠素的比例相當(dāng)時(shí)，綠色與紅色作為互補(bǔ)色，相互疊加，使葉片向深紫色方

18、向發(fā)展。五種植物紅色葉片均于5月中旬采自西北農(nóng)林科技大學(xué)校園內(nèi)，采集時(shí)王族海棠和紫葉小檗葉片呈現(xiàn)紅色，而紫葉李、紫葉桃、紅楓葉片呈現(xiàn)深紫紅色，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了花青苷/素的成分差別外，花青苷/素和葉綠素的含量比值明顯的影響葉色的呈現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)花青苷/素與葉綠素的含量比值小于2倍時(shí)，花青苷/素的紅色主導(dǎo)作用減弱，綠色互補(bǔ)作用明顯，葉片呈現(xiàn)紫紅色；而當(dāng)花青苷/素與葉綠素的含量比值大于2倍時(shí)，葉綠素的互補(bǔ)效應(yīng)弱，以花青苷/素的紅色為主導(dǎo)色

19、，葉片呈現(xiàn)紅色。</p><p>　　關(guān)鍵詞：彩葉植物；類黃酮；葉綠素；類胡蘿卜素；花青素；花青苷；矢車菊素；高效液相色譜</p><p>　　THE RESEARCH ON THE CHROMOGENIC PIGMENTS</p><p>　　OF LEAVES IN FIVE RED PLANTS</p><p><b>　　A

20、BSTRACT</b></p><p>　　Pigments of five red plant leaves were qualitative identified using of thin layer chromatography, color characteristic reaction, UV photo-spectrometer and high performance liquid c

21、hromatography; and quantitative analysized using of HPLC-DAD. Preliminary illustrates the five red coloring mechanism of the plant leaf. Results were as follows：</p><p>　　Cyanidin and its derivatives is main

22、 reason for the red leaves of five red plants. Flavones, flavonols and carotenoids as co-pigments contributed to the red leaves, Berberis thunbergii cv. atropurpurea leaves contains cyanidin(Cy), cyanidin-galactoside(Cy-

23、gal) and traces of petunidin(Pt);the amount of cyanidin(Cy), cyanidin-galactoside(Cy-gal) affected the red leaves of Malus 'Royalty'; cyanidin(Cy), cyanidin-galactoside(Cy-gal), pelargonidin(Pg) and dephinidin(Dp

24、) contributed to the Prunus pers</p><p>　　The content of chlorophyll and anthocyanins contrast obvious effects of leaf color. Anthocyanins were synthesized under the condition of sufficient sunlight. The me

25、chanism leading to the place with enough light for anthocyanins present red predominate rather than chlorophyll. Where the light is weak, cause more chlorophyll content than anthocyanins and green as the dominant color.

26、And when the proportion is quite, green and red as the complementary color, overlapping, make blade to develop in t</p><p>　　KEY WORDS:color-leafed plants, chlorophylls, carotenoids, flavonoid, anthocyanins,

27、 anthocyanidin, cyanidin, HPLC</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　第一章 前言1</b></p><p>　　1.1 彩葉植物研究進(jìn)展1</p><p>　　1.1.1 植物色素與葉片呈色的關(guān)系1</p>

28、<p>　　1.1.2 外界環(huán)境因子對彩葉形成的影響2</p><p>　　1.2 類黃酮分析研究進(jìn)展4</p><p>　　1.2.1 類黃酮提取方法6</p><p>　　1.2.2 類黃酮檢測方法6</p><p>　　1.2.3 類黃酮的結(jié)構(gòu)解析6</p><p>　　1.2.4 類黃酮的

29、定量分析7</p><p>　　1.3 五種紅色葉植物葉片色素成分鑒定研究進(jìn)展7</p><p>　　1.4 本研究的目的意義和研究路線8</p><p>　　1.4.1 目的和意義8</p><p>　　1.4.2 技術(shù)路線8</p><p>　　第二章 材料與方法10</p><p

30、>　　2.1 材料與試劑10</p><p>　　2.1.1 材料10</p><p>　　2.1.2 試劑及標(biāo)樣10</p><p>　　2.1.3 儀器10</p><p>　　2.2 試驗(yàn)方法11</p><p>　　2.2.1 色素的浸提11</p><p>　　2.2

31、.2 紫外可見分光光度計(jì)分析（UV）11</p><p>　　2.2.3 薄層層析12</p><p>　　2.2.4 高效液相-二極管陣列檢測色譜分析（HPLC-DAD）12</p><p>　　2.2.5 pH值測定13</p><p>　　2.2.6 統(tǒng)計(jì)分析13</p><p>　　第三章 結(jié)果與分

32、析14</p><p>　　3.1 紫葉小檗葉片色素的定性分析14</p><p>　　3.1.1 紫外-可見分光光度計(jì)法初步鑒定色素類別14</p><p>　　3.1.2 薄層層析色譜分析16</p><p>　　3.1.3 高效液相色譜檢測18</p><p>　　3.2 王族海棠葉片色素的定性分析2

33、0</p><p>　　3.2.1 紫外-可見分光光度計(jì)檢測20</p><p>　　3.2.2 薄層層析色譜檢測21</p><p>　　3.2.3 高效液相色譜—二極管陣列（HPLC-DAD）檢測22</p><p>　　3.3 紫葉桃葉片色素的定性分析24</p><p>　　3.3.1 紫外光譜法鑒定

34、24</p><p>　　3.3.2 高效液相色譜分析26</p><p>　　3.4 紫葉李葉片色素的定性分析28</p><p>　　3.4.1 紫外-可見光譜檢測28</p><p>　　3.4.2 高效液相色譜分析29</p><p>　　3.5 紅楓葉片色素的定性分析31</p>&l

35、t;p>　　3.5.1 紅楓葉片紫外-可見光譜檢測31</p><p>　　3.5.2 紅楓葉片高效液相色譜分析結(jié)果32</p><p>　　3.6 五種紅色葉植物葉片色素的定量分析34</p><p>　　第四章 總結(jié)與討論38</p><p><b>　　4.1 結(jié)論38</b></p>

36、<p><b>　　4.2 討論39</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)40</b></p><p><b>　　附 錄44</b></p><p><b>　　縮 略 詞51</b></p><p><b>

37、;　　致 謝52</b></p><p><b>　　作者簡介54</b></p><p><b>　　第一章 前言</b></p><p>　　1.1 彩葉植物研究進(jìn)展</p><p>　　隨著社會的發(fā)展，人們對生活質(zhì)量的需求在逐步提高，不再局限于欣賞自然界天然的綠色之美，

38、而更加追求萬綠叢中一點(diǎn)紅的變化之美、色彩的多樣之美。五彩繽紛的花朵綻放時(shí)間短，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對新奇之物的長久欣賞、留戀之意，而植物葉片的生長周期長，觀賞期長，逐步伴隨著彩葉植物的出現(xiàn)成為了人們欣賞的新奇之物（王慧娟等 2004）。彩葉植物正是以其毫不遜色于花朵的多彩之美，在豐富城市植物景觀、營建美好家園的大背景下成為了園林綠化的新寵，極大的豐富了北方早春景觀的荒涼感，給蕭瑟的早春帶來些許的暖意。</p><p>

39、;　　彩葉植物是一類在自然界中存在或經(jīng)過人工培育的在其整個(gè)生長季節(jié)或生長季節(jié)的某一階段全部或部分的葉片較穩(wěn)定的表現(xiàn)出非綠色的植物的總稱。彩葉植物根據(jù)葉片色彩呈現(xiàn)的不同時(shí)間分為春色葉、秋色葉、常色葉（張啟翔和吳靜1998）。春、秋色葉植物是階段性彩葉，如春季彩色葉片的石楠、五角楓、紫葉桃；秋季色彩鮮紅的紅瑞木。而常色葉類包括紫葉李、紅楓等全年性彩葉樹種。根據(jù)葉色可分為紫（紅）色類、黃色類、斑色類，而紫紅色系又占據(jù)了相當(dāng)大的比例（許鑫科20

40、10）。彩葉樹種的呈色在園林應(yīng)用大力發(fā)展的今天成為了各個(gè)領(lǐng)域?qū)＜已芯康臒衢T課題。</p><p>　　1.1.1 植物色素與葉片呈色的關(guān)系</p><p>　　物體的呈相原理表明：人之所以會對物體形成視覺感知，是因?yàn)楣馔ㄟ^物體表面反射到人眼，視覺細(xì)胞再傳遞給大腦所致，植物材料的呈色也是如此。程金水對花色形成原理的研究表明，光線照射到花瓣上部分被吸收、部分被海綿層反射并折回，再通過色素層進(jìn)入

41、我們眼簾所產(chǎn)生色彩的過程即花色形成（程金水 2000；謝紅英 2011）。對于彩葉植物而言，葉片色素層投射過來的光與葉片表面結(jié)構(gòu)共同作用形成了彩葉。因此，決定葉片呈色的原因有：葉片細(xì)胞內(nèi)色素種類及相對含量、葉片表面結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素等（何亦昆等 1995；謝紅英 2011）。</p><p>　　植物葉片細(xì)胞中的色素主要包括4類：（1）葉綠素（chlorophylls），主要為葉綠素a和葉綠素b，其中葉綠素a呈藍(lán)綠色

42、，葉綠素b呈黃綠色，是植物進(jìn)行光合作用不可或缺的色素，為絕大多數(shù)綠色葉植物的成色色素，在植物葉片中廣泛存在。（2）類胡蘿卜素（carotenoids），主要有胡蘿卜素和葉黃素，胡蘿卜素為橙黃色，葉黃素為黃色，自然界中胡蘿卜、番茄的橙紅色、金葉女貞葉片的金黃色主要就是類胡蘿卜素起著主導(dǎo)作用。（3）類黃酮（flavonoids），分為黃酮醇（flavonol）、黃酮（flavone）、黃烷酮（flavanone）、黃烷醇（flavanols

43、）、花青苷（anthocyanidins）、異黃酮（isoflavone）、查爾酮（chalcone）、二氫查耳酮（dihydrochalcone）等，色彩豐富，可以呈現(xiàn)從紅色到藍(lán)色一系列的顏色，紫葉李、紅花繼木的紅色葉形成是類黃酮中花青苷大量積累的結(jié)果。（4）甜菜色素（betalains），是一類顏色類似花青苷的水溶性色素，是甜菜醛氨酸(betalamic acid)與氨基酸(His、Met、Trp、Tyr或Phe等)結(jié)合的衍生物，&

44、lt;/p><p>　　在自然界中，甜菜色素和花青苷(anthocyanins)排斥分布（Wyler and Dreiding 1962；徐夙俠等 2008），絕大多數(shù)的花色、葉色和果實(shí)顏色是由類黃酮的花青苷引起的（李國選 1987），而少數(shù)不能合成花青苷的植物顏色則是由甜菜色素決定的。類黃酮是彩葉植物形成的決定色素，而花青苷又在其中起著主導(dǎo)作用（Jayaram and Peter 1990），成為彩葉植物開發(fā)和研究

45、的重點(diǎn)。</p><p>　　1.1.2 外界環(huán)境因子對彩葉形成的影響</p><p>　　外界環(huán)境因子對彩葉植物的葉片呈色起著舉足輕重的作用，其中，光照、溫度、土壤、季節(jié)等因素又起著顯著的作用。</p><p>　　1.1.2.1 光照</p><p>　　光照是影響植物葉片色彩變化的重要因素，光強(qiáng)與光質(zhì)均會對色彩變化產(chǎn)生影響。研究一般認(rèn)為

46、，光能促進(jìn)花青苷的生成，光照越強(qiáng)則促進(jìn)作用越大(崔曉靜 2008)。如彩葉秋海棠、紫葉小檗、紫葉矮櫻必須在全光照下才能呈現(xiàn)出較深的紫色，其在背陰下栽植，弱光照導(dǎo)致花青苷合成少，而葉綠素的量大于花青苷的量，使得葉片綠色系占主導(dǎo)地位，不能很好的發(fā)揮出彩葉植物最佳的觀賞價(jià)值，萬壽菊葉片中花青苷的合成與低溫、高輻射、高光強(qiáng)有關(guān)（王慶菊 2007）；紫葉李、金葉接骨木的日照時(shí)間超過12h時(shí)，葉片更加鮮艷（崔培強(qiáng)等 2010）。但也有研究表明，一些

47、植物的彩色度隨著光強(qiáng)的降低而增加，這些彩葉植物只有在弱光的環(huán)境下才能呈現(xiàn)色彩的五彩斑斕，如豆瓣綠、龍血樹，花葉一葉蘭等。</p><p>　　有研究表明，光強(qiáng)還會影響花青苷的類型，朱書香利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-DAD/ESI-MS）分析了紫葉李葉片花青素及其糖苷的成分，發(fā)現(xiàn)5月份主要有5種，7月份主要有3種，10月份主要有6種且各個(gè)階段色素含量均有差異（朱書香 2010）。不同光質(zhì)的單色光對植物

48、的呈色有不同的影響：Withrow等首次報(bào)道了紅光能促進(jìn)菜豆葉中葉綠素的合成；崔慧茹等對彩色甜椒色素含量的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，紅藍(lán)混合光在促進(jìn)葉綠素降解，類胡蘿卜素和花青素合成上優(yōu)勢明顯，但白光有利于類黃酮的合成，紅光、藍(lán)光和紅藍(lán)混合光相對于白光都不同程度的抑制了類黃酮的合成（崔慧茹等 2009）；張琰等研究表明‘血紅’雞爪槭葉片在紅光下總?cè)~綠素、葉綠素b和類胡蘿卜素含量最高，藍(lán)光下葉綠素a、花青素含量最高（張琰等 2008）。遠(yuǎn)紅光能抵消紅光

49、對花青苷生成的促進(jìn)效果，如 Siegehuan對紅卷心菜發(fā)芽種子的實(shí)驗(yàn)即證明了這一點(diǎn)（安田齊 1989）。藍(lán)光和綠光對紫葉小檗、美人梅、紫葉矮櫻、紫葉李、‘金山’繡線菊、‘金艷’繡線菊的色彩表現(xiàn)均有較嚴(yán)重的影響,使紫紅色或黃色葉色向綠色或綠褐色方向轉(zhuǎn)化，紅光有利于彩葉植物向紫色方向發(fā)（</p><p>　　1.1.2.2 溫度 </p><p>　　通過對色素合成途徑中關(guān)鍵酶活性大小的影響

50、，溫度可以直接對色素的組成和比例進(jìn)行有效的調(diào)控。它對花青素及其糖苷類、葉綠素b及總?cè)~綠素有明顯的影響，對葉綠素a的影響不大，研究表明積溫與花青苷的含量呈負(fù)相關(guān)。Deal研究了紅葉雞爪械從美國北部移至南部時(shí)發(fā)生的葉色褪失的問題，指出限制南方紅葉表達(dá)的主要原因是當(dāng)?shù)剌^高的夜溫，因?yàn)榛ㄇ嗨氐暮铣膳c碳水化合物的代謝有關(guān)，在較高的夜溫下，呼吸作用加強(qiáng)，致使糖分不能積累，花青素也被消耗，造成葉色褪失。晝夜溫差大有利于多糖的積累，從而促進(jìn)花青素的形成

51、和積累。</p><p>　　1.1.2.3 土壤</p><p>　　Steven對5年生的紅花槭進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，秋色葉的色澤與夏末時(shí)葉片中P的含量有關(guān)，減少土壤中P的含量有利于花青苷的表達(dá)，使秋葉呈現(xiàn)鮮艷的色彩。盡管土壤的酸堿性對葉色變化的影響還存在一些爭議，但大多數(shù)實(shí)例已證明，微酸性和中性的濕潤壤土可加重彩葉的顏色，而石灰質(zhì)土壤使葉色減淡。同時(shí)，落葉在土壤中的積累又可以適度地減輕石灰

52、化程度。對許多彩葉樹種，微酸性土或中性的濕潤土壤促進(jìn)彩葉呈色，堿性土壤則抑制呈色。</p><p>　　1.1.2.4 季節(jié) </p><p>　　春夏季節(jié)，植物內(nèi)富含葉綠素而類胡蘿卜素含量較少，葉片大多呈綠色。由于葉綠素對溫度的適應(yīng)性較差，一進(jìn)入寒冷季節(jié)，它先被破壞。寒冷和干旱不僅會促進(jìn)葉綠素的分解，而且限制了新葉綠素合成。這時(shí)，葉片內(nèi)原有的類胡蘿卜素就表現(xiàn)出來，使葉片變成了黃色或紅色的

53、。另一方面，進(jìn)入秋天以后，早晚溫差比較大，植物葉片中糖分的積累就會增加，進(jìn)而促進(jìn)花青素合成，加上這時(shí)氣候比較干燥，植物體內(nèi)水分減少，這樣花青素的份量就升高了，原來綠色的葉片就會變成紅色或者橙紅色的。比如北京的香山紅葉，秋季之前它是綠色的，天氣變冷以后，葉子就變紅了，這就是葉片為了適應(yīng)環(huán)境而發(fā)生的生理變化。秋季日照變短時(shí)，雁來紅同一葉片顏色由基部向頂端紫色變成鮮紅色，這是由于葉片基部葉綠素消失，細(xì)胞衰老，葉綠體內(nèi)片層結(jié)構(gòu)解體，花青素顏色顯

54、現(xiàn)出來的結(jié)果(何奕昆等 1995)。金波認(rèn)為；短日條件下，一品紅的苞片逐漸變紅，是由于花青素含量增高葉綠素含量降低所致。另外Kramerand指出，秋天葉片中花青素的合成與衰老期間糖分的積累有關(guān)。秋季由于日照縮短，溫度降低，葉綠素停止合成而分解成黃色的小顆粒；而作為補(bǔ)充糖類的色素(花青素)仍存在于葉片中，最明顯的是</p><p>　　1.1.2.5 其它因子 </p><p>　　人對于

55、病毒總是驅(qū)之不及，而對于植物而言，病毒卻在不危害植物生長的情況下，給植物帶來煥然一新之感，花葉現(xiàn)象、多彩的葉色總能增加吸引人的籌碼。而這種由病毒引起的彩斑、彩葉在很多植物中都可以看到：如筒麻鑲嵌病毒、寄生在花椰菜上的花葉病毒、煙草花葉病毒等，這些病毒使植物出現(xiàn)不規(guī)則的彩斑、彩葉，有些植物的葉片雖然保持了綠色，但是其葉脈卻嵌合成了黃色、白色或者紅色花紋。更多的園藝學(xué)家開始關(guān)注這一現(xiàn)象，目前就有采用病毒育種的辦法，使植物的色彩更加豐富。&l

56、t;/p><p>　　一些化合物和特殊的元素會對葉片的著色產(chǎn)生影響，氟化物對香龍血樹白色斑點(diǎn)的呈現(xiàn)功不可沒；有研究發(fā)現(xiàn)，硫化物對花青苷的生成有抑制作用，而銅離子等金屬離子則能促進(jìn)花青苷的生成（崔曉靜 2008；Petri et al. 1997；Neela et al. 2002）。影響花色素苷表現(xiàn)還和細(xì)胞的pH值（Stewart et al. 1975；Vlaming et al. 1983；Mol et al.

57、1999）以及花瓣或葉片的細(xì)胞形狀有關(guān)（Bridle and Timberlake 1997）。</p><p>　　1.2 類黃酮分析研究進(jìn)展</p><p>　　類黃酮為植物次級代謝產(chǎn)物，是從維管植物中分離的一大類多酚物質(zhì)的總稱，現(xiàn)已知包括8000多種化合物，在植物中含量相當(dāng)豐富(古勇和李安明 2006)。類黃酮泛指兩個(gè)苯環(huán) ( A與 B-環(huán)) 通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列 C6

58、- C3-C6化合物，主要是指以2苯基色原酮為母核的化合物（Davies 1965；Harborne 1967）， 其基本結(jié)構(gòu)為：</p><p>　　圖1-1 類黃酮基本結(jié)構(gòu)</p><p>　　Fig. 1-1 Structures of flavonoid</p><p>　　根據(jù)B環(huán)的連接位置、中央三碳鏈的氧化程度以及中央三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀、取代基的相對

59、定位等，即兩個(gè)芳香環(huán)和一個(gè)含氧雜環(huán)，并根據(jù)中間吡喃環(huán)的氧化程度不同，可將類黃酮分為 12 類，即查爾酮 (chalcones)、橙酮 (aurones)、黃酮 (flavones)、黃酮醇 (flavonols)、黃烷酮 (flavanones)、二氫查爾酮 (dihydrochalcones)、兒茶精類(catechins)、黃烷-3-4醇 (flavan-3-4dilos)、雙類黃酮 (biflavonoids)、異構(gòu)類黃酮(iso

60、flavonoids)、原花色素 (proanthcyanidins)和花色素苷(anthcyanins) (王慶菊 2007)。取代基種類、位置、數(shù)量等因素的影響使每一大類下面又有許多的分支，如黃酮醇主要有槲皮素、楊梅素、蘆丁、山奈酚等。其中，黃酮、黃酮醇和花青苷屬于常見類黃酮。</p><p>　　花青苷具有類黃酮特有的C6-C3-C6碳骨架結(jié)構(gòu)，由花青素(anthocyanidins)和糖（sacchari

61、des）經(jīng)糖苷鍵(glycosidic bond)縮合而成。花青素成苷后，取代糖基進(jìn)一步被有機(jī)酸(organic acids) ?；苫ㄇ嘬眨╝cylated anthocyanins）。糖基化(glycosylation)、?；?(acylation)、甲基化(methylation) 和羥基化(hydroxylation)是花青素常見的4種取代反應(yīng)。花青素因不穩(wěn)定而幾乎在植物組織中檢測不到，自然界廣泛分布的花青素以天竺葵素(Pg)

62、、矢車菊素(Cy)及飛燕草素(Dp)為主，由此再衍生出其它3 種花青素，如芍藥素(Pn)是由矢車菊素甲基化形成的；矮牽牛素(Pt)及錦葵素(Mv)則由飛燕草素不同程度的甲基化而來的(Martin and Gerats 1993；Kondo et al. 1992)。天竺葵素呈現(xiàn)磚紅色；矢車菊素及芍藥花色素表現(xiàn)為紫紅色；而飛燕草素、矮牽牛色素及錦葵色素表現(xiàn)藍(lán)紫色系(Mazza and Miniati 1993)。花青素苷元的羥基與糖結(jié)合形

63、成糖苷，</p><p>　　R1=OH，R2=H：矢車菊素（Cy）</p><p>　　R1=OH，R2=OH：飛燕草素（Dp）</p><p>　　R1=OCH3，R2=OH：矮牽牛色素（Pt）</p><p>　　R1=H，R2=H：天竺葵色素（Pg）</p><p>　　R1=OCH3，R2=H：芍藥色素（Pn

64、）</p><p>　　R1=OCH3，R2=OCH3：錦葵色素（Mv）</p><p>　　圖1-2 天然花色素結(jié)構(gòu)</p><p>　　Fig. 1-2 Structures of natural anthocyanidins</p><p>　　類黃酮物質(zhì)在自然界中廣泛存在，如在水果、蔬菜、中草藥中常能窺見其芳蹤。有大量的文獻(xiàn)報(bào)道了

65、其具有抗氧化(Youdim et al. 2000)、抗衰老（Youdim et al. 2002）、抗腫瘤（Atalaya et al. 2008）、改善血液循環(huán)并預(yù)防心血管疾病(Hou et al. 2003)以及改善視力方面的功效(Cook and Samman 1996；Perossini 2000)。自從有研究報(bào)道類黃酮的攝食與心肌梗死以及冠心病引起的死亡率之間呈負(fù)相關(guān)之后，從各類植物中提取、分離、純化類黃酮逐漸成為該領(lǐng)域?qū)＜?/p>

66、爭相研究的熱點(diǎn)，合適的定性和定量檢測技術(shù)是類黃酮開發(fā)利用的關(guān)鍵。</p><p>　　1.2.1 類黃酮提取方法</p><p>　　因?yàn)轭慄S酮廣泛的應(yīng)用價(jià)值，使得從各類植物中提取、分離、純化類黃酮逐步成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，合適的定性、定量技術(shù)就顯得至關(guān)重要了。提取類黃酮的方法有溶劑提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法以及酶提取法（李慧2008）。溶劑提取法因方法較柔和，對化合物的結(jié)構(gòu)破

67、壞小，操作相對簡單，對儀器設(shè)備要求較低而成為廣泛使用的一種提取類黃酮的簡便方法。常使用的提取溶劑以有機(jī)溶劑為主，包括甲醇、乙醇等，配合使用水及酸堿溶液。因?yàn)榛ㄇ嘬赵谥行曰驂A性溶液及高溫下不穩(wěn)定，所以一般提取花青苷時(shí)都會加入一定量的酸類物質(zhì)，常加入鹽酸來維持花青苷的穩(wěn)定性，考慮到五種紅色葉植物紅色素的食用功能，可考慮用檸檬酸來替代?；ㄇ嘬沼龈邷夭环€(wěn)定的特性決定了不能使用烘箱來達(dá)到干燥的目的，真空冷凍干燥法的低溫保護(hù)成為了現(xiàn)在材料干燥的常用

68、方法，干燥后再研磨就不再擔(dān)心材料的氧化與物質(zhì)的降解。還有研究者對新鮮材料加液氮迅速研磨并加入抽提溶劑，這種急速低溫研磨不僅有利于材料破碎，也能保護(hù)其不被氧化。</p><p>　　1.2.2 類黃酮檢測方法</p><p>　　類黃酮的分離方法主要有薄層層析色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、逆流色譜技術(shù)(CCC)和毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)。薄層色譜分離法相對簡單，所需樣品量少，但

69、分離受到溫度、溶劑的影響較大，重復(fù)性差。對類黃酮的分離近年來使用范圍最廣的是高效液相色譜技術(shù)，儀器精密，通過調(diào)節(jié)流動相組成、洗脫參數(shù)，能夠有效分離結(jié)構(gòu)相似、種類繁多的復(fù)雜化合物，二極管陣列檢測器的應(yīng)用，使得一次檢測可以得到設(shè)定波長范圍內(nèi)的所有譜圖，極大的彌補(bǔ)了紫外檢測器只能檢測單波長的不足。C18反相柱是分離類黃酮的常用分析柱，典型流動相體系是水相和有機(jī)相的組合，有機(jī)相以色譜級甲醇、乙腈為主，水相為高純度的水，有時(shí)為了提高分離度加入微量

70、甲酸和乙酸調(diào)節(jié)酸度，但加入酸的量要適度，大量的酸容易對色譜分析柱造成傷害并大量析出沉淀損害泵的正常運(yùn)行。彩葉植物的類黃酮分離大多采用HPLC法，并且結(jié)果理想。</p><p>　　1.2.3 類黃酮的結(jié)構(gòu)解析</p><p>　　紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、核磁共振等成為了類黃酮結(jié)構(gòu)解析的常用方法。各種類黃酮均有自己獨(dú)特的特征吸收波長，通過觀察樣品紫外-可見分光光度計(jì)檢測

71、圖譜，可以初步判斷類黃酮的類別。比如本研究的附錄1中所附的標(biāo)準(zhǔn)品的紫外檢測圖譜中，黃酮醇及其苷類在紫外區(qū)有兩個(gè)吸收帶，峰I位于350 nm和380nm之間，峰II位于250nm和275 nm之間，楊梅素的紫外吸收帶在376nm和254nm，山奈酚在364nm和266nm，可見就算是同一大類的類黃酮也會有輕微的差別，而這些差別就可以用來解析每種類黃酮單體。</p><p>　　質(zhì)譜是目前分析未知化合物結(jié)構(gòu)較為常用的

72、手段，其使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷的離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量（黃澤建等 2008）。近年來又與高效液相色譜聯(lián)用，靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)未知樣品的快速分離與結(jié)構(gòu)鑒定（Glassgen and Wray 1992）。劉本國等人從亮葉楊桐葉的甲醇萃取液中鑒定出三種類黃酮：山茶苷A、山茶苷B、芹菜

73、素（劉本國等 2007）；朱書香利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MS)鑒定出紫葉李葉片中含有五種矢車菊素糖苷，分別為矢車菊素半乳糖苷、矢車菊素葡萄糖苷、矢車菊素鼠李糖苷、矢車菊素蕓香苷以及矢車菊素戊糖苷（朱書香 2010；魯儀增等 2007）。</p><p>　　核磁共振分析能夠得到未知物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確信息，尤其是在區(qū)分同分異構(gòu)體和糖苷連接位置時(shí)，具有不可替代的作用，但其和液質(zhì)聯(lián)用儀成本高，

74、使用率有限。</p><p>　　1.2.4 類黃酮的定量分析</p><p>　　紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法(CE)、超臨界流體色譜法（SFC）以及薄層色譜法(TLC)均能用來檢測類黃酮的含量(李崇暉等 2008)。Moyer等（2002）利用紫外-可見分光光度法測定了越橘等屬的107種植物的含量；朱書香（2010）對四種李屬彩葉植物的色素含量利用高效液相色譜法進(jìn)

75、行了鑒定；魏勝華等（2011）建立了測定柚皮中柚皮苷含量的毛細(xì)管電泳法；周芳等（2009）利用薄層層析掃描法同時(shí)測定了不同產(chǎn)地廣陳皮中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素的含量。目前，高效液相色譜-二極管陣列檢測器聯(lián)用技術(shù)（HPLC-DAD）因其高分離度、快速等特點(diǎn)，成為了廣泛使用的定量技術(shù)（Guo et al. 1997）。</p><p>　　1.3 五種紅色葉植物葉片色素成分鑒定研究進(jìn)展</p><

76、p>　　目前對紫葉李葉片色素的鑒定已有了一定的進(jìn)展：呂福梅（2005）利用紙層析色譜和光譜檢測得到紫葉李葉片中的主要花青素是矢車菊素（Cy），并具有季節(jié)特征；朱書香（2010）通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在紫葉李葉片中檢測到矢車菊素-半乳糖苷（Cy-gal）、矢車菊素-蕓香糖苷（Cy-ru）、矢車菊素丙二酰-鼠李糖苷（Cy malonyl-rhamnoside）、矢車菊素戊糖苷（Cy pentoside）、天竺葵素鼠李糖苷（Pg

77、 rhamnoside）。</p><p>　　而對于紫葉小檗、紫葉桃、王族海棠、紅楓葉片內(nèi)色素的定性、定量目前研究較少，研究主要集中在對提取方法的探索和影響色素變化的因子方面：其中，張斌斌（2010）、劉弘（2004）、李雪飛（2010）及肖和忠（2007）等研究得到遮陰能夠減輕紫葉桃光抑制，但不利于光合積累和彩色的呈現(xiàn)，其更適合栽植在全光照條件下并且二氫黃酮醇還原酶對花青苷合成有啟動作用；田立娟等（2010）

78、通過紫外-可見分光光度計(jì)對佳木斯市引進(jìn)的王族海棠葉片內(nèi)色素進(jìn)行了分析，初步判斷其葉片中含有葉綠素、類胡蘿卜素和花青素三大類色素；黃可等（2012）對紅楓葉片的理化性質(zhì)研究表明，葉片中尚未鑒定出的紅色素較穩(wěn)定，是一種值得開發(fā)的色素。這些研究均未鑒定出紫葉桃、紫葉小檗、王族海棠、紅楓葉片內(nèi)成色色素，對紅色葉片的呈色機(jī)理研究略顯單薄。</p><p>　　1.4 本研究的目的意義和研究路線</p><

79、;p>　　1.4.1 目的和意義</p><p>　　對于西北地區(qū)而言，冬季大部分植物落葉、無花，紅色葉植物更是鮮見，冬季景觀越發(fā)顯蕭條之色，而紅色作為暖色系顏色，大力的推廣必然在冬天的蕭瑟之下帶來些許的暖意。并且紅色葉植物與其它植物的搭配，將相得益彰，體現(xiàn)出于自然，高于自然之意。在一片綠色植物的海洋中，為追求新奇的人們帶來一場更具觀賞價(jià)值的視覺盛宴。</p><p>　　彩葉植物具

80、有色彩鮮艷、觀賞期長、易于形成大色塊景觀的特點(diǎn)，可以彌補(bǔ)城市淡花季節(jié)色彩單調(diào)的缺憾，是一類值得大力推廣、應(yīng)用前景廣闊的園林植物（田立娟等 2010）。然而有關(guān)彩葉植物色素結(jié)構(gòu)鑒定等方面的理論研究，目前文獻(xiàn)報(bào)道不多，這就使得彩葉植物在新品種開發(fā)、轉(zhuǎn)基因等方面存在一定的盲目性。對于紅色葉植物而言，花青素是其研究的重點(diǎn)，作為類黃酮化合物中的一類，花青素同樣具備典型的理化作用，并且其作為天然色素的開發(fā)具有舉足輕重的作用。目前，食品工業(yè)中因合成色

81、素價(jià)格低廉、色彩鮮艷、穩(wěn)定性好而大量的得以使用。但是，科技的發(fā)展以及人們對自身健康的關(guān)注，伴隨著合成色素越來越多的弊端暴露，其不僅對人體有害，甚至?xí)?dǎo)致癌癥的發(fā)生，因此合成色素的使用量正逐步的減少，有些已經(jīng)禁止使用（胡迎芬 2001）。而天然色素?zé)o毒無害，又如前面所說還有很好的生理活性及可人的藥用價(jià)值，其未來的前景將褶褶生輝（Monica 2007）。而本研究之所以選用這五種紅色葉植物，除體現(xiàn)在營造景觀方面的喬灌結(jié)合外，更多的考慮是對

82、天然紅色素的提取方面，紅色給人一種味濃成熟、好吃的感覺，而且其比較鮮艷，比較引人注目，是人們所喜愛的一種色彩，</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)主要是以紫葉李、紫葉桃、紫葉小檗、王族海棠、紅楓五種紅葉樹種為試材，對紅葉樹種葉片中的色素進(jìn)行定性、定量分析，以確定其中的色素種類及含量，分析其葉片呈現(xiàn)紅色的原因，并比較分析5種紅色葉植物葉片內(nèi)色素差異，為通過雜交育種及基因工程培育紅色葉新品種提供研究基礎(chǔ)并為植物色素開發(fā)與利用

83、提供契機(jī)（繆少霞等 2012；Timberlake and Henry 1988）。</p><p>　　1.4.2 技術(shù)路線</p><p>　　第二章 材料與方法</p><p><b>　　2.1 材料與試劑</b></p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p>

84、<p>　　供試材料為5種紅色葉植物葉片，分別為小檗科（Berberidaceae）小檗屬（Berberis Linn.）的紫葉小檗（Berberis thunbergii‘a(chǎn)tropurpurea’）、薔薇科(Rosaceae)蘋果屬（Malus Mill.）的王族海棠(Malus ‘Royalty’）、薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)的紫葉桃（Prunus persica ‘Atropurpurea’）和紫

85、葉李（Prunus ceraifera cv. Pissardii）以及槭樹科（Aceraceae）槭樹屬（Acer L.）的紅楓（Acer palmatum cv. Atropuceum）。五種植物葉片均在2011年5月中旬采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)，種植土壤呈堿性，pH值為7.80。</p><p>　　均勻采集植物葉片，流水沖洗后用蒸餾水洗滌，用吸水紙將葉表面水珠吸干后置于-20℃冰箱中低溫保存1.00

86、d，轉(zhuǎn)移材料置-86 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍，待材料呈結(jié)晶狀（真空冷凍干燥前材料必須達(dá)到-40 ℃的低溫，以利于材料由固態(tài)到氣態(tài)的升華）后，進(jìn)行真空冷凍干燥48 h，得到干燥徹底的植物葉片，研缽中研磨成粉末，于常溫下保存在黑暗的柜子中待用。</p><p>　　2.1.2 試劑及標(biāo)樣</p><p>　　試驗(yàn)試劑包括分析純的甲酸、鹽酸、異戊醇、丙酮、乙醇、石油醚、正丁醇、冰乙酸、氨水、異丙醇等

87、，均購自西安化學(xué)試劑廠。用于HPLC-DAD檢測的色譜級試劑有甲醇和乙腈，購自美國Spectrum公司。標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素、兒茶素、表兒茶素、木犀草素購自天津金測分析技術(shù)有限公司，二氫槲皮素、蘆丁、對香豆酸、綠原酸等購自天津一方科技有限公司，矢車菊素、矢車菊素半乳糖苷購自美國Sigma公司。</p><p><b>　　2.1.3 儀器</b></p><p>　　高效液相

88、色譜-二極管陣列檢測器分析系統(tǒng)（HPLC-DAD）:日立L-2000高效液相色譜儀包括：（1）L-2100二元梯度泵 （2）L-2000自動進(jìn)樣器 （3）L-2300色譜柱控溫箱 （4）L-2490光電二極管陣列檢測器以及類黃酮分析方法色譜工作站。色譜柱為Lachrom-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm，Hitachi，Japan），購于天美（中國）科學(xué)儀器有限公司。</p><p&

89、gt;　　島津-2450紫外可見分光光度計(jì)，購自陜西捷森科技發(fā)展有限公司。</p><p><b>　　2.2 試驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 色素的浸提</p><p>　　2.2.1.1 制備四種色素萃取液：</p><p>　　A.甲醇鹽酸萃取液（花青苷檢測）：稱取1.00 g冷凍干燥后的粉末，用

90、25.00 mL1 %的甲醇鹽酸（97.00 mL的甲醇+3.00 mL 36 %的鹽酸）萃取，超聲提取三次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至25.00 mL（辛轉(zhuǎn)霞等 2011）。</p><p>　　B.水解萃取液：將500 µL的甲醇鹽酸萃取液加入2.00 mL的離心管里面，添加750 µL的2.00 mol·L-1鹽酸，金屬浴上在95 ℃條件下加熱45.00 min。取出后在冰上

91、冷卻，待冷卻后加入375 µL的異戊醇萃?。▌×一蝿樱?，4 ℃條件下6000ｒ·min -1離心5.00 min，得到相性分離后，吸取上相到新的離心管中，上相中含有濃縮狀態(tài)的花青素和其他類黃酮（Li H 2007,2008）。</p><p>　　C.甲醇萃取液（其它類黃酮和甜菜色素檢測）：稱取1.00 g冷凍干燥后的粉末，用25.00 mL甲醇萃取，超聲提取三次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至

92、25 mL。</p><p>　　D.乙醇萃取液（葉綠素、類胡蘿卜素檢測）：取0.25 g粉末，用96%乙醇提取，定容至20.00 mL，在4 ℃條件下萃取30.00 h，得到黃綠色萃取液。</p><p>　　2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制</p><p>　　精密稱取花青苷/素標(biāo)準(zhǔn)品0.30 mg，置于10.00 mL棕色容量瓶中，用1.00 mL 1%的甲醇鹽

93、酸（97.00 mL甲醇+3.00 mL鹽酸）溶解，作為貯備液待用，使用時(shí)用1%甲醇鹽酸稀釋成0.0003、0.003、0.015、0.03、0.15、0.30 mg·mL- 1的標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密稱取其它類黃酮2 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用1 mL色譜級甲醇溶解，作為儲備液待用，使用時(shí)用甲醇稀釋成0.0002、0.002、0.02、0.10、1、2.00mg·mL- 1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。</p>&l

94、t;p>　　所有萃取液均經(jīng)過0.22 µm過濾器過濾，平行制樣三次。</p><p>　　2.2.2 紫外可見分光光度計(jì)分析（UV）</p><p>　　用島津-2450紫外可見分光光度計(jì)對不同萃取液在200-700 nm檢測吸收波峰及吸光度（Fuleki and Franeis 1968），并掃描標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收光譜（見附錄1）。</p><p>　　

95、A.葉綠素及類胡蘿卜素含量參考高俊鳳的方法進(jìn)行測定（高俊鳳2000），計(jì)算公式如下：</p><p>　　Ca = 13.95D663 － 6.88D645</p><p>　　Cb = 24.96D645 － 7.32D663</p><p>　　Ca+b = Ca + Cb = 6.63 D663 + 18.08 D645</p><p

96、>　　Cx = （1000D470 － 2.05 Ca － 114 Cb）/ 245</p><p>　　葉綠體色素含量（mg·g-1）= (C * V*稀釋倍數(shù))/M*1000</p><p>　?。ㄗⅲ篋663、D645、D470分別為供試樣品乙醇萃取液在663 nm，645 nm和470 nm的吸光度；Ca 、Cb、Ca+b、Cx分別為葉綠素a、為葉綠素b、總?cè)~綠

97、素、類胡蘿卜素的濃度（mg·L-1），V為葉綠體色素萃取液定容體積（mL），M為供試樣品干重（g））</p><p>　　B.總黃酮含量測定方法：將蘆丁在烘箱里105 ℃烘至恒重后用甲醇溶解成濃度為2.00 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置入10.00 mL離心管中，加入0.20 mL 5%的 NaNO2搖勻后靜置6.00 m

98、in；加入0.20 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后靜置6.00 min；加入1.00 mL 4% NaOH，搖勻后室溫靜置15.00 min；加入60% 乙醇溶液定容至10.00 mL，搖勻后在510 nm波長下測定吸光度值，以0.20 mL樣品甲醇萃取液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測定，重復(fù)三次。葉片中總黃酮含量(mg·g-1) =10 × C × V1 / (M × 0.20)。C為測定樣品液中

99、總黃酮濃度(mg·mL-1)；M為樣品干質(zhì)量(g)；V1為樣品最后定容體積(mL)；0.20為測定時(shí)加入提取液量(mL)；10.00為測定時(shí)提取液定容體積(mL)（李娟等 2007）。</p><p>　　2.2.3 薄層層析</p><p>　　取濃縮后的甲醇鹽酸萃取液、水解萃取液和花青素/苷標(biāo)樣用玻璃毛細(xì)管點(diǎn)樣于纖維素薄層板上。將薄層板分別置于不同流動相（表2-1）的層析缸中

100、展開，測定各展開系統(tǒng)中顯色色帶在色譜上的Rf值(Harborne 1999,2000)。</p><p>　　表2-1 五種流動相組成</p><p>　　Table 2-1 The composition of five phase</p><p>　　對肉眼很難觀察到的無色或輕微黃色的類黃酮用以下顯色方法鑒定: 觀察正常光照、紫外光（254 nm）下和氨氣煙熏

101、薄層板后顏色變化，參照Harborne（1984）的方法進(jìn)行鑒定；將100 mg硼氫化鈉溶解于1.00 mL水中，加入9.00 mL異丙醇，將溶液霧化后噴到纖維素板上，觀察顏色變化；用軟刷將鋅粉均勻涂布在薄層板上，用6.00 mol·L-1的鹽酸噴灑顯色，觀察顏色變化。</p><p>　　將檢測到的甲醇鹽酸萃取液和水解萃取液的顯色斑點(diǎn)刮下后用1 mL 1%的甲醇鹽酸溶液萃取，將萃取液用0.22

102、81;m的濾膜過濾供后續(xù)的液相檢測使用。</p><p>　　2.2.4 高效液相-二極管陣列檢測色譜分析（HPLC-DAD）</p><p>　　使用日立L-2000色譜儀檢測，程序設(shè)置如下：檢測器為L-2455型二極管陣列檢測器,檢測波長為200-700 nm，C18柱（Hitachi，Japan，250 mm×4.6 mm，5 µm），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為10

103、µL，流速0.50 mL·min -1。流動相參數(shù)：A:0.04%的甲酸水溶液B:色譜級乙腈。采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?-40 min，A 95%-0,B 5%-100%；40-60 min，A 0,B 100%（Li H 2008）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各單體酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以每千克葉片中各單體酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。</p><p>　　2.2.5 pH值測定</p><p&g

104、t;　　pH值測定參考并改進(jìn)周文彬和邱保勝（2004）的細(xì)胞液提取法（cell sap extract）取新鮮葉片于干凈研缽中搗碎，用pH酸度計(jì)進(jìn)行檢測，試驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。</p><p>　　2.2.6 統(tǒng)計(jì)分析</p><p>　　采用Excle軟件處理數(shù)據(jù)、制圖，采用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。</p><p>　　第三章 結(jié)果與分析</p>

105、<p>　　3.1 紫葉小檗葉片色素的定性分析</p><p>　　3.1.1 紫外-可見分光光度計(jì)法初步鑒定色素類別</p><p>　　黃酮類化合物鑒定：黃酮類化合物在可見光區(qū)500-550 nm和紫外光區(qū)275 nm附近具有兩個(gè)吸收峰的特征譜，對紫葉小檗甲醇鹽酸萃取液檢測結(jié)果顯示，其在285 nm（峰1）和535 nm（峰2）處有兩個(gè)典型的特征吸收峰（圖3-1-A），表明紫

106、葉小檗葉片內(nèi)含有黃酮類化合物（Harborne 1958）。葉片呈現(xiàn)紅色的原因主要是花青素的大量積累，以及起輔助作用的其他黃酮類化合物（安·田齊 1989；馬卡姆等 1990），為對黃酮類化合物做進(jìn)一步的鑒定，取紫葉小檗葉片水解液進(jìn)行紫外檢測。結(jié)果表明，水解液在290 nm（峰3）和537 nm（峰5）處有吸收高峰（圖3-1-B），這位于花青素中的矢車菊素（Cy）和飛燕草素（Dp）的特征吸收波峰范圍內(nèi)。向上述水解液中加入5%