高效汞降解菌株的篩選及耐汞基因的克隆.pdf

1、【目的】利用氯化汞(HgCl2)進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，從自然界的土壤中分離耐汞菌。從中篩選出可以高效還原無(wú)機(jī)汞離子的優(yōu)良菌株進(jìn)行研究，以實(shí)際應(yīng)用于工業(yè)汞污水的處理和汞污染土壤和水體的修復(fù)。 【方法】①耐汞菌株的分離：采集日光燈廠廠區(qū)汞污染的土壤，用常規(guī)方法在含HgCl2的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)一步分離純化、觀察菌落的形態(tài)、革蘭氏染色、細(xì)菌生化分類鑒定及抗生素耐藥性分析； ②耐汞水平測(cè)定：用含Hg2．濃度不同的培養(yǎng)液進(jìn)行培

2、養(yǎng)，觀察菌株的生長(zhǎng)情況； ③高耐菌株生長(zhǎng)能力的研究：包括觀察菌株在含汞培養(yǎng)液中的生存趨勢(shì)：在不同洲條件下的生長(zhǎng)情況；在滅菌自來(lái)水及農(nóng)田土中的生存能力； ④高耐菌株對(duì)Hg2+的還原能力：將待測(cè)菌接種于含汞濃度不同的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48h后取上清，用雙道原子熒光光度計(jì)測(cè)定殘余的汞含量，得出汞還原率： ⑤16SrRNA分類鑒定：提取待測(cè)菌的基因組DNA，根據(jù)細(xì)菌16SrRNA基因中的保守序列設(shè)計(jì)并合成引物，PCR擴(kuò)增

3、產(chǎn)物，測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLASTN數(shù)據(jù)庫(kù)及同源性比較分析而明確待測(cè)菌的分類鑒定。 ⑥merA基因片段的克隆和鑒定：根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的已知的merA基因序列及同源性比較分析，在高度保守的DNA序列區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物，對(duì)待測(cè)菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLASTN進(jìn)行同源性比較分析，鑒定待測(cè)菌是否含有merA基因以及其與已知的merA基因的同源性。同時(shí)嘗試將所擴(kuò)增的基因片段轉(zhuǎn)化合適的受體菌。 【結(jié)果】①?gòu)暮?/p>

4、汞土壤中共分離得到7株耐HgCl2細(xì)菌，生化鑒定為假單胞菌及枯草桿菌，耐汞水平及抗生素耐藥性各不相同，分別命名為CHYl-7菌； ②CHY-7菌株對(duì)抗生素耐藥性較少，耐Hg2+水平達(dá)lOOmg／L，營(yíng)養(yǎng)要求低，在自然界中生存能力強(qiáng)，生長(zhǎng)的洲值范圍廣(pHS．0-10．0)，16SrRNA基因分類鑒定為惡臭假單胞菌：在HgCl2濃度為5．-．35mg／L條件下，該菌48小時(shí)還原Hg2．為Hg~的轉(zhuǎn)化效率為90．4％-84．2％：

5、 ③克隆CHY-7菌株的merA基因片段：已擴(kuò)增得到一段673bp的DNA序列，經(jīng)測(cè)序比對(duì)證實(shí)所擴(kuò)增的片段確屬merA基因，且位于細(xì)菌染色體上：已擴(kuò)增的merA基因片段可連接pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化DH5Q感受態(tài)細(xì)菌成功； 該菌株可實(shí)際應(yīng)用于工業(yè)汞污水的處理和汞污染土壤、水體的修復(fù)。從染色體基因組上擴(kuò)增得到的merA基因片段不但證實(shí)了該菌株可以高效降解氯化汞的分子基礎(chǔ)，還為進(jìn)一步分離、克隆完整的merA基因乃至mer-op