丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究.pdf

1、丁草胺屬于酰胺類除草劑，它通過(guò)抑制雜草體內(nèi)蛋白質(zhì)合成而起到除草作用。斑馬魚(yú)具有產(chǎn)卵量多、前期胚胎透明、繁殖快、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，成為繼小鼠、果蠅、線蟲(chóng)之后又一新型模式生物。本論文采用魚(yú)類活體(In vivo)實(shí)驗(yàn)方法，以丁草胺原藥（我國(guó)應(yīng)用最多的三個(gè)除草劑之一）為供試藥劑，從下丘腦-垂體-甲狀腺軸、下丘腦-垂體-性腺軸和氧化損傷等角度，研究丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的急性毒性結(jié)

2、果顯示:丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)96h的LC50值是0.49 mg/L，根據(jù)農(nóng)業(yè)部《農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)準(zhǔn)則》農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類毒性等級(jí)的劃定標(biāo)準(zhǔn)，表明丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)咸魚(yú)的毒性為高毒。采用GC-MS\MS對(duì)丁草胺原藥中的雜質(zhì)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，96％丁草胺原藥中主要雜質(zhì)是二丁氧基甲烷和(2-氯-N-(2，6-二乙基苯基)乙酰胺。我們測(cè)定了斑馬魚(yú)整個(gè)生命周期中的甲狀腺激素變化動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明斑馬魚(yú)的胚胎在28±1℃條件下，受精后48～72 h內(nèi)孵化，授精后0-

3、3天胚胎孵化前T4和T3的含量沒(méi)有顯著變化;幼魚(yú)體內(nèi)T3含量在授精后第10天達(dá)到最高峰;幼魚(yú)體內(nèi)T4含量在授精后第21天達(dá)到最高峰。在斑馬魚(yú)生長(zhǎng)后期，甲狀腺激素會(huì)出現(xiàn)一個(gè)低平臺(tái)期，本研究為將來(lái)選用斑馬魚(yú)進(jìn)行污染物的內(nèi)分泌干擾研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 從下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT)調(diào)控角度出發(fā)，研究了丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)和成魚(yú)體長(zhǎng)、體重和生長(zhǎng)因子等形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)血漿和幼魚(yú)

4、組織中甲狀腺激素水平的影響;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)甲狀腺軸相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明(1)丁草胺染毒30天后，25μg/L和100μg/L劑量可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)因子(CF)增加，但是不同濃度丁草胺處理組中成魚(yú)的生長(zhǎng)因子與溶劑對(duì)照組相比，差異不顯著;(2)丁草胺可以提高斑馬魚(yú)成魚(yú)血漿中和幼魚(yú)組織中甲狀腺激素四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)水平;(3)丁草胺可以使斑馬魚(yú)幼魚(yú)促甲狀腺激素釋放

5、激素(CRH)、促甲狀腺激素(TSH)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)、甲狀腺激素受體(TRα)、脫碘酶(Deio1)和鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(S1c5a5)等基因的表達(dá)量上調(diào)，葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因(UGT1ab)基因的表達(dá)量下調(diào)，甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)、甲狀腺球蛋白(TG)、脫碘酶(Deio2)和甲狀腺激素受體(TRβ)的表達(dá)量沒(méi)有變化。結(jié)果顯示丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)和幼魚(yú)都具有一定的甲狀腺干擾作用。
　　 從下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)調(diào)控

6、角度出發(fā)，研究丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)產(chǎn)卵及后代的影響;運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)血漿中性激素睪酮、雌二醇和卵黃蛋白原水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)性腺軸的相關(guān)基因表達(dá)的影響，包括雌激素受體(ERα、ERβ1和ERβ2)、卵黃蛋白原（VTGI和VTGⅡ）和芳香化酶(CYP19)等基因。結(jié)果顯示丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)的性腺軸具有一定的干擾作用，主要表現(xiàn)在(1)丁草胺可以降低斑馬魚(yú)雌魚(yú)的產(chǎn)卵次數(shù)和產(chǎn)卵

7、量;(2)丁草胺可以降低雄魚(yú)的性腺指數(shù)(GSI)，但是對(duì)成魚(yú)的肝腺指數(shù)(LSI)沒(méi)有影響;(3)丁草胺可以降低斑馬魚(yú)雌魚(yú)血漿中的睪酮(T)和雌二醇(E2)水平，提高成魚(yú)血漿中卵黃蛋白原(VTG)水平;(4)丁草胺可以使斑馬魚(yú)幼魚(yú)卵黃蛋白原VTGⅡ表達(dá)量上調(diào)，但是對(duì)幼魚(yú)雌激素受體（ERα、ERβ1和ERβ2）和芳香化酶CYP19a的表達(dá)量沒(méi)有影響。
　　 以雌性成魚(yú)為受試對(duì)象，研究丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響。肝臟是主要