基于coⅱ基因的我國海域4個(gè)長蛸群體的遺傳變異研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))</p><p>　題 目：基于COⅡ基因的我國海域4個(gè)長蛸群體的遺傳變異研究</p><p>　學(xué) 院：</p><p>　學(xué)生姓名：</p><p>　專 業(yè)：生物科學(xué)</p><p>　班 級(jí)：</p><p>　指導(dǎo)教師：

2、</p><p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　摘 要Ⅲ</b></p><p>　　AbstractIV</p><p><b>　　引 言1</b></p><p>

3、<b>　　1 材料與方法2</b></p><p><b>　　1.1實(shí)驗(yàn)材料2</b></p><p>　　1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑2</p><p>　　1.2.1 實(shí)驗(yàn)所用的基本試劑2</p><p>　　1.2.2 自配試劑2</p><p>　　1.2.3

4、瓊脂糖凝膠板的制備3</p><p>　　1.3 主要儀器與設(shè)備3</p><p>　　1.4 實(shí)驗(yàn)耗材4</p><p>　　1.5 實(shí)驗(yàn)方法4</p><p>　　1.5.1 長蛸基因組DNA的提取4</p><p>　　1.5.2 基因組DNA的檢測5</p><p>　　1.

5、5.3 基因組線粒體基因的擴(kuò)增[25]5</p><p>　　1.5.4瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6</p><p>　　1.5.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定和數(shù)據(jù)分析6</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析7</p><p>　　2.1 基因組DNA的提取結(jié)果7</p><p>　　2.2基因組線粒體基因

6、的擴(kuò)增結(jié)果7</p><p>　　2.3 長蛸群體遺傳多樣性分析8</p><p>　　2.3.1 長蛸COII基因片段的基本統(tǒng)計(jì)與分析8</p><p>　　2.4 長蛸群體的遺傳分化與基因流10</p><p>　　2.5 長蛸群體的聚類分析和遺傳距離12</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)討論

7、13</b></p><p>　　3.1 長蛸DNA的提取和線粒體基因擴(kuò)增13</p><p>　　3.2 長蛸群體的遺傳多樣性分析13</p><p>　　3.3 研究展望14</p><p><b>　　小 結(jié)15</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)

8、16</b></p><p><b>　　致 謝33</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　采用PCR擴(kuò)增技術(shù)對中國4個(gè)不同海域（山東青島、浙江溫州、浙江舟山、福建東山）的長蛸群體的COII基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增和測序，獲得了長度為560bp長度的同源序列，分析了不同海域群體內(nèi)和

9、群體間的遺傳變異。結(jié)果表明，89個(gè)個(gè)體共有28個(gè)單倍型，其中青島群體8個(gè)，舟山群體7個(gè)，溫州群體6個(gè)，東山群體7個(gè)。通過序列比對，變異均勻地分布于序列各個(gè)區(qū)域，但密碼子偏好不明顯?？?cè)后w單倍型多樣性指數(shù)（H）0.884±0.018，核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）0.10640±0.00656，平均核苷酸差異數(shù)（K）57.348，顯示出一定的遺傳多樣性。采用MEGA3.1對4個(gè)海域的長蛸群體進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)樹，結(jié)果表明

10、：青島、舟山2個(gè)群體由于遺傳距離較近首先聚為一支，而與東山群體遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，與溫州群體親緣關(guān)系最遠(yuǎn)而最后聚類。Tajima’s D和Fu’s FS檢驗(yàn)顯示溫州群體可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，而其它3個(gè)群體可能未經(jīng)歷過歷史擴(kuò)張事件。我國海域長蛸的這種遺傳結(jié)構(gòu)的形成原因還有待于進(jìn)一步證實(shí)。通過本次研究，從線粒體DNA水平分析我國不同海域長蛸群體的遺傳變異情況，期望為開展我國長蛸群體的資源評價(jià)、物種保護(hù)及分</p><p>　

11、　關(guān)鍵詞：長蛸；線粒體基因；COⅡ基因；遺傳變異</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Fragments of COII gene were amplified and sequenced.in Octopus variabilis samples from 4 our different sea areas in China (

12、Qingdao, Wenzhou, Zhoushan, Fujian) A 560bp aligned sequence were obtained and analyzed to detect genetic variation within and among the groups. The results showed that 89 individuals produce a total of 28 haplotypes, wi

13、th eight in Qingdao group, seven in Zhoushan group, six in Wenzhou group, seven in Dongshan group. By sequence alignment, the variation is evenly distributed</p><p>　　Key words：Octopus variabilis; mitochondr

14、ial genes; COII gene; Genetic variation</p><p><b>　　引 言</b></p><p>　　長蛸 (Octopus variabilis) 是我國沿海重要的海洋頭足類，又名馬蛸、長腿蛸、大蛸，屬軟體動(dòng)物門（Mollusca）頭足綱（Cephalopada）蛸科（Octopodidae）蛸屬動(dòng)物，分布于我國黃海、渤海、

15、東海和南海海域。長蛸肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血，收斂生肌的作用，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是暢銷國際國內(nèi)市場的水產(chǎn)品，也一直是我國重要的海洋捕撈種類之一。但近年來，由于我國沿海頭足類資源的大力開發(fā)，捕撈強(qiáng)度日益加大，其資源量也日趨衰退。為了更有效地保護(hù)和管理我國的長蛸資源，維持其可持續(xù)采捕，同時(shí)也為今后長蛸資源更合理的人工開發(fā)，有必要對其種群結(jié)構(gòu)和遺傳變異作深入的研究，從而為我國長蛸資源的保護(hù)和管理提供必要的指導(dǎo)。</p><

16、;p>　　目前關(guān)于長蛸遺傳多樣性的研究資料還非常少，在國內(nèi)外僅見于等位基因酶的遺傳變異研究[9]，鮮有從線粒體DNA上研究長蛸的遺傳多樣性。線粒體DNA(mtDNA)作為細(xì)胞中的相對獨(dú)立的核外遺傳物質(zhì)，廣泛的存在于生物體的各種組織細(xì)胞中，由于其具有分子量小、分子結(jié)構(gòu)簡單且穩(wěn)定、母性遺傳、一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)化速度快、突變率高、均一、無組織特異性等特征，易于分離純化[10]，重復(fù)性好，已成為研究動(dòng)物起源進(jìn)化，群體遺傳分化及系統(tǒng)發(fā)育的理想研究材

17、料[11]，在漁業(yè)資源研究方面得到廣泛應(yīng)用[12]。目前，隨著DNA測序技術(shù)和分子信息學(xué)的快速發(fā)展，線粒體DNA作為一種優(yōu)良的標(biāo)記技術(shù)廣泛的用于生物的遺傳變異研究[13,14,15]。線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基II (Cytochrome oxidase II, COⅡ）是mtDNA 13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之一,該基因的產(chǎn)物是細(xì)胞色素氧化酶亞基II,后者是細(xì)胞色素氧化酶的重要組成部分。與其他線粒體蛋白質(zhì)編碼基因相比, COⅡ基因的進(jìn)化速率較

18、快,常被用來研究親緣關(guān)系較近的種、種下分類單元以及地理種群之間的關(guān)系[16（2）]。</p><p>　　本文利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序的方法對來自山東青島、浙江溫州、浙江舟山、福建東山的89個(gè)個(gè)體的COII基因片段序列進(jìn)行了測定和分析，從線粒體DNA水平分析我國不同海域長蛸群體的遺傳變異情況，期望為開展長蛸群體的資源評價(jià)、物種保護(hù)及分子標(biāo)記育種提供遺傳學(xué)資料，同時(shí)與其他海域長蛸群體的序列進(jìn)行了比較，為其種質(zhì)資源

19、的保護(hù)、管理以及對物種的起源進(jìn)化及長蛸群體結(jié)構(gòu)和遺傳分化的研究提供基礎(chǔ)資料。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　長蛸成體樣本89尾，于2008年采自4個(gè)不同自然海域（青島群體21尾、舟山群體23尾、溫州群體22尾、東山群體23尾），全

20、部野生。長蛸規(guī)格體長大約在15-27cm，體重約100克，健康狀況良好。經(jīng)鑒定后冰鎮(zhèn)活體空運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，取肌肉3-5g立即凍存于-70℃冰箱中備用。</p><p>　　1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑</p><p>　　1.2.1 實(shí)驗(yàn)所用的基本試劑</p><p>　　去離子水：實(shí)驗(yàn)室自制</p><p>　　瓊脂糖：中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司<

21、/p><p>　　氯仿：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　NaCl：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　濃鹽酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　無水乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　乙酸鈣：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　冰乙酸：國

22、藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　異戊醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　蛋白酶K：寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　乙二胺四乙酸（EDTA）：北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心</p><p>　　三羥甲基氨基甲烷（Tris）：國藥集團(tuán)化學(xué)

23、試劑有限公司</p><p>　　十二烷基硫酸鈉（SDS）：寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　以上試劑均為國產(chǎn)分析純；</p><p>　　10×buffer（Mg2+ free）、MgC12、dNTP、Taq酶、DL 2000 DNA Marker、引物(COI、16S rRNA)均購自上海捷瑞生物工程有限公司。</p>&l

24、t;p>　　1.2.2 自配試劑</p><p>　　（1）5M NaCl溶液：NaCl 73.1g溶于200ml水中，定容至250ml，高壓蒸汽滅菌，4℃保存；</p><p>　?。?）70%乙醇溶液：350ml無水乙醇與150ml水混勻；</p><p>　　（3）0.5M EDTA溶液：EDTA 146.12g溶于300ml水中，加入少量NaOH濃溶液

25、，使之完全溶解，加少量濃鹽酸調(diào)整PH至8.0，加水定容至1000ml，分裝成500ml后，高壓蒸汽滅菌，4℃保存；</p><p>　　（4）50×TAE緩沖溶液：Tris 242g，冰乙酸溶液57.1ml，0.5M EDTA（PH=8.0）100ml，加水定溶至1000ml；</p><p>　　（5）10% SDS溶液：電泳級(jí)SDS 25g溶于200ml水中（水浴加熱至68℃

26、），加少量濃鹽酸調(diào)整PH至7.2，加水定溶至250ml，高壓蒸汽滅菌，4℃保存；</p><p>　　（6）1M Tris-HCl溶液：Tris 121.14g溶解于500ml水中，加少量濃鹽酸調(diào)整PH至8.0，加水定溶至1000ml；</p><p>　?。?）TE抽提緩沖液：5ml 1M Tris-HCl溶液，10ml 0.5M EDTA溶液，加水定溶至500ml，高壓蒸汽滅菌，4℃保

27、存；</p><p>　?。?）TE溶模板：5ml 1M Tris-HCl溶液，100ul 0.5M EDTA溶液，加水定溶至500ml，高壓蒸汽滅菌，4℃保存；</p><p>　?。?）蛋白酶K（20mg/ml）：20mg可溶性蛋白酶K 加入到溶解緩沖液（1ml 50mM Tris-HCl PH=8.0，加0.237mg乙酸鈣，終濃度1.5mM）中，充分溶解混勻，用PCR管分裝成每管1

28、00ul，-20℃冷凍保存；</p><p>　　（10）氯仿異戊醇（24:1）溶液：4ml異戊醇溶于96ml氯仿溶液中，混勻4℃保存；</p><p>　　（11）1.5%的瓊脂糖凝膠：瓊脂糖0.45g放入錐形瓶中，加入30ml 1×TAE緩沖溶液，置微波爐加熱至完全溶解，取出混勻，則為1.5%瓊脂糖凝膠液。</p><p>　　1.2.3 瓊脂糖凝膠板

29、的制備</p><p>　　0.8%的瓊脂糖凝膠板：取洗凈晾干的制膠槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子，將冷卻到60℃左右的0.8%瓊脂糖凝膠液緩緩倒入制膠槽內(nèi)，形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡），待膠凝固后取出梳子。</p><p>　　1.3 主要儀器與設(shè)備</p><p>　　錐形瓶：容量250ml，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司</p>

30、<p>　　燒杯：容量100ml，500ml，1000ml，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　量筒：容量50ml，100ml，250ml，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司</p><p>　　廣口瓶：容量250ml，500ml，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司</p><p>　　移液器：容量2.5ul、10ul、20ul、100ul、200ul、10

31、00ul，法國Gilson公司</p><p>　　立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-50S11型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠</p><p>　　電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9070MEB型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠</p><p>　　電熱恒溫水浴鍋：HWS26型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司</p><p>　　電子天平：EL10

32、4型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司</p><p>　　實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)：FE20型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司</p><p>　　美的微波爐：MM823ESJ-PA型，廣東美的微波爐制造有限公司</p><p>　　離心機(jī)：GL-166-II型，上海安亭科學(xué)儀器廠</p><p>　　雙穩(wěn)定電泳儀：DYY-8C型，北京市六一儀器廠<

33、;/p><p>　　BIO-RAD凝膠成像儀：GDXI型，美國伯樂BIO-RAD公司</p><p>　　PCR儀：PTC-200型，美國伯樂BIO-RAD公司</p><p>　　海爾冰箱（4℃、-20℃）：海爾BCD-539WF型，對開門，中國海爾集團(tuán)</p><p>　　上菱冰箱（-70℃）：上菱BCD-123型，上海上菱電器制造有限公司&

34、lt;/p><p><b>　　1.4 實(shí)驗(yàn)耗材</b></p><p>　　玻璃棒：購自江蘇省泰興市振科儀器廠</p><p>　　一次性PE薄膜手套：購自上海市醫(yī)用衛(wèi)生材料廠</p><p>　　20µl、200µl及1000µl Tip槍頭：購自上海捷瑞生物工程有限公司</p>

35、<p>　　0.2ml、1.5ml及5ml Eppendorf管：購自美國Axygen公司</p><p><b>　　1.5 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　1.5.1 長蛸基因組DNA的提取</p><p>　　基因組總DNA的提取采用常規(guī)的“酚-氯仿”抽提法[22,23]。取保存于-70℃冰箱中的長蛸樣品的少量肌肉組織

36、100mg于1.5ml離心管中，加入475ul TE抽提緩沖液，將樣品肌肉組織用醫(yī)用剪刀剪碎（盡量細(xì)），加入25ul 10% SDS溶液，終濃度為0.5%，混勻后加入5ul 20mg/ml蛋白酶K至終濃度50ug/ml，55℃水浴消化約4h。水浴消化完全后取出冷卻，加入500ul飽和酚（等體積），輕搖8分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心10分鐘，用擴(kuò)口吸頭移出含DNA的上清液，重復(fù)上述步驟兩次。加入等體積的飽和酚：氯仿（1:1），輕搖10

37、分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心10分鐘，用擴(kuò)口吸頭移出含DNA的上清液。加入等體積的氯仿異戊醇（24:1）溶液，輕搖10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心10分鐘，用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相。加入1/25體積的5M NaCl溶液（終濃度為0.1mol/L）和2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，上下顛倒數(shù)次，可見白色絮狀DNA，-20℃沉淀30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘冷凍離心10分鐘，棄上清液。用70%乙醇溶液300ml清洗沉淀

38、一次，12</p><p>　　1.5.2 基因組DNA的檢測</p><p>　　提取后的DNA用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，每一個(gè)DNA樣品取5ul溶解的DNA母液和約1ul上樣緩沖液混勻后小心上樣，在另一加樣孔加入DL 2000 DNA Marker 3ul作為Marker，在雙穩(wěn)定電泳儀上電壓保持122V，1×TAE緩沖溶液中電泳分離25分鐘左右。電泳結(jié)束后，用EB

39、溶液染色20分鐘左右，在美國伯樂BIO-RAD公司的GDXI型凝膠成像儀下檢測所提DNA是否完整，估計(jì)DNA的濃度和大小。</p><p>　　1.5.3 基因組線粒體基因的擴(kuò)增[25]</p><p>　?。?）PCR擴(kuò)增引物</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用線粒體DNA中的COII基因片段為目的DNA片段?；蚱螖U(kuò)增所選用的引物為曼氏無針烏賊的擴(kuò)增引物[26]，

40、引物由上海捷瑞生物工程有限公司代為合成。</p><p>　　COII基因片段擴(kuò)增所用引物的核苷酸序列為：</p><p>　　COII r：5'-GTATAAATGAGTGRTTTGCWCCAC-3'；</p><p>　　COII f：5'-TGACCCAATGAGGACAATTAGG-3'。</p><p&g

41、t;　?。?）PCR反應(yīng)體系</p><p>　　PCR擴(kuò)增反應(yīng)在美國伯樂BIO-RAD公司的PTC-200型PCR儀上進(jìn)行。在0.2ml PCR薄壁管內(nèi)配制50ul反應(yīng)體系，依次加入以下組分：</p><p>　　表1 50ul的反應(yīng)體系</p><p>　　Tab.1 50ul reaction system</p><p>　　充分混

42、勻后，稍加離心。</p><p>　?。?）PCR反應(yīng)程序</p><p>　　按下面的循環(huán)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性1分鐘，51℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，全部循環(huán)完成后72℃再延伸5分鐘，4℃維持。取不同的4個(gè)海域（青島、溫州、舟山、福建）長蛸群體進(jìn)行群體擴(kuò)增。</p><p>　　1.5.4瓊脂

43、糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物</p><p>　　PCR擴(kuò)增結(jié)束后，每一個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物和約1ul上樣緩沖液混勻后在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，以DL 2000 DNA Marker作為Marker，在雙穩(wěn)定電泳儀上120V電壓下電泳分離25分鐘左右，電泳緩沖液為1×TAE緩沖溶液。電泳結(jié)束后，用EB溶液染色20分鐘，在美國伯樂BIO-RAD公司的GDXI型凝膠成像儀下觀察和拍照，存圖。

44、</p><p>　　1.5.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定和數(shù)據(jù)分析</p><p>　　對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定。測序由上海英俊生物科技有限公司完成。測序結(jié)果通過bioedit7.0，phylip3.5，MEGA3.1等軟件工具[27]計(jì)算所得序列的堿基組成、遺傳距離、顛換轉(zhuǎn)換位點(diǎn)以及UPGMA系統(tǒng)樹。再用DNAsp4.10（DNA sequence polymorphism）軟件進(jìn)行多態(tài)

45、性位點(diǎn)、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)等遺傳多樣性參數(shù)的計(jì)算。用Arlequin3.01軟件估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布（AMOVA法），并計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)Fst及顯著性（重復(fù)次數(shù)1000），群體間基因流Nm由公式Nm=（1-Fst）/2 Fst計(jì)算而得。采用Fu’s Fs檢驗(yàn)來檢測中性假說是否成立,Fu’s Fs中性檢驗(yàn)結(jié)果如為負(fù)值并且顯著偏離中性，則可能是由于群體擴(kuò)張引起的。</p><p>&l

46、t;b>　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1 基因組DNA的提取結(jié)果</p><p>　　隨機(jī)取89個(gè)不同海域（青島21個(gè)、溫州23個(gè)、舟山22個(gè)、東山23個(gè)）長蛸樣品進(jìn)行基因組總DNA提取，所得到的基因組總DNA用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，經(jīng)EB溶液染色后，在BIO-RAD凝膠成像儀下觀察到一條比較明顯的DNA帶（圖1）。從圖中可以看出：長

47、蛸基因組DNA提取效果較好，有個(gè)別樣品殘留有較多的雜質(zhì)。雜質(zhì)殘留的原因可能是因?yàn)橄煌耆虺樘釙r(shí)間不充分而使RNA和蛋白質(zhì)有殘留。由于PCR擴(kuò)增特異性很強(qiáng)，要求的DNA量也很少，所以RNA和蛋白質(zhì)的殘留一般不影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。</p><p>　　M：DL 2000 DNA Marker</p><p>　　圖1 青島長蛸群體基因組總DNA </p><p>　　F

48、ig.1 DNA of Qingdao Octopus variabilis</p><p>　　2.2基因組線粒體基因的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　利用曼氏無針烏賊的擴(kuò)增引物對4個(gè)海域長蛸群體的89個(gè)個(gè)體的基因組總DNA進(jìn)行了線粒體COII基因片段的PCR擴(kuò)增，均獲得了特異性很好的PCR產(chǎn)物，在BIO-RAD凝膠成像儀下觀察到一條清晰的DNA帶（圖2）。從圖上可以觀察到，長蛸的線粒體C

49、OII基因片斷為560bp左右。</p><p>　　M：DL 2000 DNA Marker D1～D22：溫州長蛸樣品COII基因擴(kuò)增產(chǎn)物</p><p>　　M：DL 2000 DNA Marker D1～D22：samples are from Wenzhou</p><p>　　圖2 溫州長蛸群體COII基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物</p><

50、p>　　Fig. 2 PCR amplyplified products of COII in Wenzhou Octopus variabilis</p><p>　　2.3 長蛸群體遺傳多樣性分析</p><p>　　2.3.1 長蛸COII基因片段的基本統(tǒng)計(jì)與分析</p><p><b>　?。?）堿基組成 </b></p&g

51、t;<p>　　對4個(gè)長蛸群體共89個(gè)個(gè)體的COII序列進(jìn)行測定，經(jīng)clustal w1.83軟件編輯和比對后，獲得了長度為560bp長度的同源序列，經(jīng)Mega 3.1軟件分析，該序列的T、C、A、G堿基含量分別為35.5%、19.0%、35.6%和9.9%。A+T含量（71.1%）大大高于G+C（28.9%）含量，符合一般頭足類CYTB基因的序列特點(diǎn)，DNAsp4.10軟件分析顯示，89個(gè)個(gè)體共檢測到235個(gè)變異位點(diǎn)，占

52、分析位點(diǎn)總數(shù)的42.0%，其中單突變位點(diǎn)（Singleton varible sites）108個(gè)，簡約信息位點(diǎn)(Parsimony informative sites)127個(gè)；變異均勻地分布于序列各個(gè)區(qū)域，但密碼子偏好不明顯，主要發(fā)生在編碼區(qū)密碼子的第3位上，占變異位點(diǎn)的43.4%，其它變異均發(fā)生在1和2位點(diǎn)上，分別占變異位點(diǎn)的30.6%和26.0%；</p><p><b>　?。?）遺傳變異分析

53、</b></p><p>　　用DNAsp4.10軟件對各長蛸群體的遺傳變異參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示。89個(gè)個(gè)體共有28個(gè)單倍型，其中青島群體8個(gè)，舟山群體7個(gè)，溫州群體6個(gè)，福建東山群體7個(gè)；總?cè)后w單倍型多樣性指數(shù)（H）0.884±0.018，核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）0.10640±0.00656，平均核苷酸差異數(shù)（K）57.348，顯示出一定的遺傳多樣性。對4個(gè)群體的遺傳變

54、異參數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)福建東山群體的遺傳多樣性相對較高，福建東山群體的的HD、Pi值和K值分別為0.522±0.124、0.02665±0.01999和14.443，其他3個(gè)群體的HD、Pi值和K值分別在0.407-0.790、0.00110-0.00233、0.619-1.305之間。</p><p>　　圖4長蛸COII基因測序峰圖</p><p>　　Fig. 4

55、Gene sequencing-map of Octopus variabilis based the sequence of COII fragement</p><p>　　2.4 長蛸群體的遺傳分化與基因流</p><p>　　遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)表明，4群體在單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)等遺傳參數(shù)上也存在較大的差異，如表2所示；對群體間分化系數(shù)（Fst）和基因流（Nm）進(jìn)行檢測表明

56、，4個(gè)群體之間均具顯著的遺傳分化（p﹤0.05），其中溫州群體與其他3個(gè)群體之間分化最為顯著，分化系數(shù)均在0.910以上，基因流Nm均小于1；雖然4個(gè)群體之間的遺傳分化系數(shù)比較大而且呈顯著分布，但是4個(gè)群體之間仍有一定的基因流（Nm﹥1），結(jié)果見表3；AMOVA分析進(jìn)一步顯示長蛸群體間的遺傳差異有6.84%存在于群體內(nèi)部，93.16%存在于群體之間，進(jìn)一步證實(shí)了長蛸群體間的分化。</p><p>　　表2 長蛸種

57、群的遺傳變異參數(shù)統(tǒng)計(jì)</p><p>　　Tab. 2 Summary of genetic diversity based the sequence of COII fragement in different populations of Octopus variabilis</p><p>　　表3 長蛸種群的遺傳分化和基因流</p><p>　　Tab. 3

58、 Fagement in different populations of Octopus variabilis and gene flow</p><p>　　注：樹枝上的數(shù)字為自動(dòng)抽樣得到的對該樹枝的支持百分?jǐn)?shù)</p><p>　　Notice: The bootstrap confidence values of each branch are showed the branch&l

59、t;/p><p>　　圖5基于COII基因的4個(gè)長蛸群體的UPGMA聚類結(jié)果</p><p>　　(其中QD、ZS、WZ、FJ分別代表青島、舟山、溫州、福建)</p><p>　　Fig.5 UPGMA phyliogenetic tree of Octopus variabilis based the sequence of COII fragement</p&

60、gt;<p>　　2.5 長蛸群體的聚類分析和遺傳距離 </p><p>　　采用Mega 3.1軟件對89個(gè)個(gè)體進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果表明，所有個(gè)體可以明顯聚為2支，一支由青島、舟山和福建群體的個(gè)體組成，另一支由溫州群體的個(gè)體組成，如圖2所示；根據(jù)4個(gè)群體的遺傳距離進(jìn)一步作群體聚類也表明，青島、舟山和福建3個(gè)群體由于遺傳距離較近首先聚為一支，而溫州群體另聚為一支。遺傳距離分析表明，兩支間的遺

61、傳距離達(dá)到了0.204；對兩類群進(jìn)行Tajima’s D和Fu’s FS檢驗(yàn)，結(jié)果表明溫州群體可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張（Tajima’s D﹤0，F(xiàn)u’Fst﹤0，p﹤0.05）；而其它3個(gè)群體可能未經(jīng)歷過歷史擴(kuò)張事件（Tajima’s D﹤0，F(xiàn)u’Fst﹤0，p﹥0.05）。</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)討論</b></p><p>　　3.1 長蛸DNA的提取和

62、線粒體基因擴(kuò)增</p><p>　　長蛸屬軟體動(dòng)物頭足綱動(dòng)物，有關(guān)其DNA提取及分子生物學(xué)方面的研究還不多見，本文采用常規(guī)酚氯仿抽提法，對長蛸DNA進(jìn)行了提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能很好地提取出長蛸的DNA，如本文圖1所示，但DNA提取過程我們發(fā)現(xiàn)，雖然這種方法提取的DNA主帶仍較明顯，但卻有較多殘留雜質(zhì)產(chǎn)生，這一方面可能是RNA造成的拖帶現(xiàn)象，另外也可能是由于提取過程的碎片段造成的，這在本實(shí)驗(yàn)室其他同學(xué)和其它頭足類（短蛸

63、、曼氏無針烏賊）的提取中都有發(fā)現(xiàn)，但采用其它方法（實(shí)驗(yàn)室其他同學(xué)和老師的工作）卻未有這么明顯的拖帶現(xiàn)象。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)采用這種方法提取的DNA，會(huì)在膠孔位置留下較多的白色印記，可能是蛋白質(zhì)，這些都是今后在長蛸DNA提取方面需要進(jìn)一步完善的地方。</p><p>　　對于長蛸線粒體基因的擴(kuò)增，如前所述，本文采用曼氏無針烏賊線粒體基因的擴(kuò)增引物對長蛸的COII基因進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能得到特異性非常高的亮帶，如結(jié)果

64、中圖2所示，將該引物與其它軟體動(dòng)物如貝類，甚至其它魚類相比，發(fā)現(xiàn)相同的引物也能在這些海洋生物中擴(kuò)增出基因來，該結(jié)果說明海洋頭足類的線粒體基因可能與其它動(dòng)物的線粒體基因之間同樣存在較高的保守性，其它生物的線粒體基因引物可以在頭足類中得到很好的應(yīng)用，這為今后其它頭足類線粒體基因的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。</p><p>　　3.2 長蛸群體的遺傳多樣性分析</p><p>　　本文采用線粒體CO

65、II基因?qū)?個(gè)海域（青島、溫州、舟山、福建）長蛸遺傳變異進(jìn)行了研究。89個(gè)個(gè)體共有28個(gè)單倍型，其中青島群體8個(gè)，舟山群體7個(gè)，溫州群體6個(gè)，福建群體7個(gè)；總?cè)后w單倍型多樣性指數(shù)（H）0.884±0.018，核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）0.10640±0.00656，平均核苷酸差異數(shù)（K）57.348，顯示出一定的遺傳多樣性。對4個(gè)群體的遺傳變異參數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)福建群體的遺傳多樣性相對較高，福建群體的的HD、Pi值和K

66、值分別為0.522±0.124、0.02665±0.01999和14.443，其他3個(gè)群體的HD、Pi值和K值分別在0.407-0.790、0.00110-0.00233、0.619-1.305之間。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，4群體在單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)等遺傳參數(shù)上也存在較大的差異，變異均勻地分布于序列各個(gè)區(qū)域。</p><p>　　目前無脊椎動(dòng)物線粒體DNA中A+T含量較高已被許多學(xué)者證

67、實(shí)[30]，本實(shí)驗(yàn)引用的長蛸群體從COII基因片段獲得的堿基組成看，該序列的T、C、A、G堿基含量分別為35.5%、19.0%、35.6%和9.9%。A+T含量（71.1%）大大高于G+C（28.9%）含量，符合一般頭足類CYTB基因的序列特點(diǎn)，DNAsp4.10軟件分析顯示，89個(gè)個(gè)體共檢測到235個(gè)變異位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)總數(shù)的42.0%，其中單突變位點(diǎn)（Singleton varible sites）108個(gè)，簡約信息位點(diǎn)(Parsi

68、mony informative sites)127個(gè)；變異均勻地分布于序列各個(gè)區(qū)域，但密碼子偏好不明顯，主要發(fā)生在編碼區(qū)密碼子的第3位上，占變異位點(diǎn)的43.4%，其它變異均發(fā)生在1和2位點(diǎn)上，分別占變異位點(diǎn)的30.6%和26.0%。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中通過與青島群體、舟山群體、溫州群體和福建群體序列的遺傳多樣性參數(shù)比較，并進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，所有個(gè)體可以明顯聚為2支，一支由青島

69、、舟山和福建群體的個(gè)體組成，另一支由溫州群體的個(gè)體組成，根據(jù)4個(gè)群體的遺傳距離進(jìn)一步作群體聚類也表明，青島、舟山和福建3個(gè)群體由于遺傳距離較近首先聚為一支，而溫州群體另聚為一支。表明溫州群體可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，而其它3個(gè)群體可能未經(jīng)歷過歷史擴(kuò)張事件，關(guān)于我國海域4個(gè)長蛸群體遺傳結(jié)構(gòu)形成的具體原因還有待于今后研究的進(jìn)一步證實(shí)。</p><p><b>　　3.3 研究展望</b></p&

70、gt;<p>　　長蛸由于其營養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟(jì)的價(jià)值，它的養(yǎng)殖前景十分看好。本文的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究長蛸的遺傳變異、種群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化打下基礎(chǔ)，同時(shí)為開展長蛸群體的資源評價(jià)、物種保護(hù)及分子標(biāo)記育種提供遺傳學(xué)資料，為長蛸的進(jìn)化研究積累資料。但是要想進(jìn)一步了解其遺傳背景還需其他分子生物學(xué)方面的資料，如線粒體其他基因、核基因組DNA等。當(dāng)然傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究可能也是今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。</p><

71、p><b>　　小 結(jié)</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)通過對4個(gè)不同海域（青島、溫州、舟山、福建）長蛸群體的COII基因片段的遺傳變異研究，檢測到4個(gè)群體之間均具顯著的遺傳分化，其中溫州群體與其他3個(gè)群體之間分化最為顯著。遺傳距離分析表明，溫州群體可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張而其它3個(gè)群體可能未經(jīng)歷過歷史擴(kuò)張事件。就遺傳多樣性分析，福建群體的遺傳多樣性相對較高，個(gè)體間雖存在一定的遺傳差異，但

72、遺傳差異程度很小，不存在明顯的群體內(nèi)分化。這一結(jié)果表明，群體間的遺傳距離隨地理位置的遠(yuǎn)近表現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系：地理距離越近則遺傳距離越小，遺傳相似程度越高。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 凌去非, 李思發(fā), 殷建國. 丁鱥不同群體線粒體COⅡ基因序列分析[J]. 水利漁業(yè), 2007,(01).</p>&l

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90、，精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無華、平易近人的人格魅力對我影響深遠(yuǎn)。</p><p>　　本論文從選題到完成，每一步都是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下完成的，傾注了導(dǎo)師大量的心血。在此，謹(jǐn)向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x。以及班主任劉老師在學(xué)習(xí)生活方面給予我很大的幫助，在此表示真誠的謝意! 在實(shí)驗(yàn)過程中，李紅梅師姐在數(shù)據(jù)處理方面給予了我很大的幫助，在此表示誠摯的感謝!</p&g