影響根霉原生質(zhì)體制備因素及高蛋白酶菌株篩選【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　影響根霉原生質(zhì)體制備因素及高蛋白酶菌株篩選</p><p><b>　　摘 要</b&g

2、t;</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)研究了酶系統(tǒng)、酶解溫度、酶解時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑、菌齡、預(yù)處理方式等因素對(duì)根霉原生質(zhì)體形成的影響，獲得了制備根霉原生質(zhì)體的最佳條件。同時(shí)也研究了不同時(shí)間的高溫誘變與紫外誘變對(duì)原生質(zhì)體再生及再生后的根霉酶活力的影響。結(jié)果表明，當(dāng)菌齡為18h，0.8mol/L的NaCl作滲透壓穩(wěn)定劑，采用混合酶（蝸牛酶0.1%、纖維素酶0.5%、溶菌酶0.3%），酶解溫度30℃，酶解2h，原生質(zhì)體的形成

3、率最高。時(shí)間為5分鐘，7分鐘的紫外誘變胞外蛋白酶和淀粉酶有提高。</p><p>　　關(guān)鍵詞：根霉；原生質(zhì)體；融合；再生</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　The factors affecting the protoplast of Rhizopus was studied in details, in

4、cluding enzyme system and concentration, enzyme digestion temperature and time, osmotic pressure stabilizer, fungus age, pretreatment and so on. The results were as follows: the mycelia was cultured for 18h, 0.8mol/L NaC

5、l as osmotic pressure stabilizer, then incubated with 0.1%Snailase,0.6%cellulose and 0.3%lysozyme for 2h at 30℃, under such circumstance the formation rate of protoplast is highest. provided useful experie</p><

6、;p>　　Key Words: Rhizopus; protoplast; factors; regeneration</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 根霉的特性及應(yīng)用1</p><p>　　1.2

7、本實(shí)驗(yàn)的研究現(xiàn)狀與意義1</p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料2</p><p>　　2.1.1 供試菌株2</p><p>　　2.1.2 培養(yǎng)基2</p><p>　　2.1.3 主要儀器及試劑2</p><

8、p>　　2.1.4 滲透壓穩(wěn)定劑4</p><p>　　2.1.5 酶液的制備4</p><p>　　2.1.6 其他試劑4</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法4</p><p>　　2.2.1 菌株活化4</p><p>　　2.2.2 菌體培養(yǎng)4</p><p>　　2.

9、2.3 酶系和酶濃度的確定5</p><p>　　2.2.4 滲透壓穩(wěn)定劑的確定5</p><p>　　2.2.5 酶解溫度和時(shí)間的確定6</p><p>　　2.2.6 原生質(zhì)體制備6</p><p>　　2.2.7 雙親滅活7</p><p>　　2.2.8 原生質(zhì)體融合與再生7</p>

10、<p>　　2.2.9 融合子篩選7</p><p>　　2.2.10融合子胞外蛋白酶及淀粉酶活力測(cè)定8</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析8</b></p><p>　　3.1 影響原生質(zhì)體制備因素結(jié)果8</p><p>　　3.1.1不同配比酶解液對(duì)原生質(zhì)體形成的影響8</p>

11、<p>　　3.1.2 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成的影響9</p><p>　　3.1.3 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成的影響9</p><p>　　3.1.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響10</p><p>　　3.1.5 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響11</p><p>　　3.1.6 預(yù)處理方式對(duì)原生質(zhì)體形成的影響11&

12、lt;/p><p>　　3.1.7 其他影響因素11</p><p>　　3.2 原生質(zhì)體結(jié)果及再生選擇高酶活力菌種12</p><p>　　3.2.1菌株活化及菌體培養(yǎng)12</p><p>　　3.2.2 原生質(zhì)體制備12</p><p>　　3.2.3 原生質(zhì)體的再生13</p><p&g

13、t;　　3.2.4 高酶菌株的篩選13</p><p>　　4 結(jié)論與討論20</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)22</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　1.1 根霉的特性及應(yīng)用

14、</p><p>　　根霉(Rhizopus)是一種好氣性真菌，分類學(xué)歸屬于半知菌亞門、曲霉屬。根霉的菌絲無隔膜、有分枝和假根，營養(yǎng)菌絲體上產(chǎn)生匍匐枝，匍匐枝的節(jié)間形成特有的假根，從假根處向上叢生直立、不分枝的孢囊梗，頂端膨大形成圓形的孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)生孢囊孢子。孢子囊內(nèi)囊軸明顯，球形或近球形，囊軸基部與梗相連處有囊托。根霉的孢子可以在固體培養(yǎng)基內(nèi)保存，能長期保持生活力。根霉在自然界分布很廣，用途廣泛，其淀粉酶活性

15、很強(qiáng)，是釀造工業(yè)中常用糖化菌。我國最早利用根霉糖化淀粉(即阿明諾法)生產(chǎn)酒精。根霉能生產(chǎn)延胡索酸、乳酸等有機(jī)酸，還能產(chǎn)生芳香性的酯類物質(zhì)。根霉亦是轉(zhuǎn)化甾族化合物的重要菌類。與生物技術(shù)關(guān)系密切的根霉主要有黑根霉、華根霉和米根霉。</p><p>　　根霉主要存在于糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物、土壤等處，是我國傳統(tǒng)釀造食品醬、醬油和酒類的生產(chǎn)菌種，也可用于生產(chǎn)各種酶制劑、有機(jī)酸、糖化飼料、益生素等[1]。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的

16、蓬勃發(fā)展，人們對(duì)根霉的關(guān)注日漸增長。根霉在食品釀造方面的應(yīng)用歷史悠久，近些年在飼料加工方面的研究也日趨深入，這些方面的研究主要集中在根霉發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶方面上。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，根霉發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶可以水解制備蛋白胨。蛋白胨廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、醫(yī)藥、衛(wèi)生、臨床細(xì)菌檢驗(yàn)及科研等方面。根霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶在食品、飼料、農(nóng)副產(chǎn)品加工、石油開采和資源再利用等方面具有廣泛應(yīng)用前景，而果膠酶可以降低果汁的粘度、澄清果汁、提高果汁超濾通量、提高葡萄酒得率及過濾

17、速度，其應(yīng)用對(duì)食品加工業(yè)做出了很大貢獻(xiàn)。此外，根霉還應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶、氨基?；浮⒋蠖巩慄S酮糖苷酶、植酸酶等各種酶制劑。根霉發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸，如曲酸，是一種具有抗菌作用的有機(jī)酸，對(duì)水果、蔬菜有護(hù)色作用，還可以消除人體內(nèi)自由基，同時(shí)具有抑制黑色素生成酶活性的能力，還可用作攝影、膠片去斑劑等，因此在食品、化妝品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工等行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。</p><p>　　1.2 本實(shí)驗(yàn)的研究現(xiàn)狀與意義</p&

18、gt;<p>　　根霉是釀造業(yè)中的重要微生物，在其生長過程中分泌淀粉酶，能糖化淀粉生產(chǎn)酒精。所以，研究根霉特性對(duì)大力發(fā)展發(fā)酵工業(yè)，研發(fā)高質(zhì)量的產(chǎn)品有著廣泛的發(fā)展前景。然而生產(chǎn)實(shí)踐中，根霉的生產(chǎn)能力往往欠佳，或是蛋白酶活性高的菌株往往生長速度慢，而生長速度快的菌株往往蛋白酶活性低，所以人們?yōu)榱烁纳七@種狀況作了大量工作。在我國的釀造業(yè)中，根霉的選育主要采用物理和化學(xué)的誘變方法，但融合子篩選所采用的標(biāo)記方法往往使?fàn)I養(yǎng)缺陷，且工作

19、量較大，而且這些遺傳標(biāo)記還往往會(huì)干擾菌株的正常代謝，影響菌株的一些重要性狀。原生質(zhì)體融合工作在絲狀真菌中廣泛開展。原生質(zhì)體融合技術(shù)是微生物遺傳育種上的一項(xiàng)重要技術(shù)，它具有遺傳信息傳遞量大，不受親緣關(guān)系的影響，可有目的地選擇親株以選育理想的融合株，便于操作等優(yōu)點(diǎn)[2]，科技工作者[3-7]經(jīng)過大量的努力，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種上取得了大量的成績。目前國內(nèi)外利用原生質(zhì)體融合法選育優(yōu)良真菌成為一個(gè)熱門課題，然而制備高形成率及高再生率

20、的真菌原生質(zhì)體是原生質(zhì)體融合技術(shù)最基礎(chǔ)也是最首要的一步。</p><p>　　通過對(duì)根霉原生質(zhì)體一次基因改組選育出的高酶活力菌株，再次進(jìn)行原生質(zhì)體制備、雙親滅活、融合、再生后代融合菌株，進(jìn)行融合菌株后代蛋白酶活力、淀粉酶活力等多種方法測(cè)定、分析，同親本和一次基因改組選育出的高酶活力菌株等相比較，初步得到原生質(zhì)體二次基因改組技術(shù)和高酶活力菌株菌株。</p><p><b>　　2

21、材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 供試菌株</p><p>　　一次融合后的根霉菌株，來自于萬里學(xué)院07級(jí)的郭巍同學(xué)。實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行菌株的活化，之后才能進(jìn)行接種。</p><p><b>　　2.1.2 培養(yǎng)基</b>

22、</p><p>　　馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PDA)：取一定量的馬鈴薯，洗凈、去皮、切塊，在電子天平上稱取100g左右，與500mL的蒸餾水一起放入鍋中，煮沸20min，用四層紗布過濾后取浸出液，加入蔗糖10g，瓊脂10g，溶解后加蒸餾水至500mL。</p><p>　　馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PSA+蛋白胨)：取一定量的馬鈴薯、洗凈、去皮、切塊，稱取100g左右放入煮沸的蒸餾水中(約500mL左

23、右)，20min后取浸出液，加入蔗糖10g，牛肉浸膏2.5g，蛋白胨2.5g，定容為500mL的液體培養(yǎng)基，而馬鈴薯固體培養(yǎng)基是在此基礎(chǔ)上添加瓊脂粉。</p><p>　　馬鈴薯再生培養(yǎng)基：馬鈴薯200g洗凈去皮，之后切片放入沸水中煮20min，最后得到其浸出液，加4.5g瓊脂(最終溶液含量為0.9%)，加入葡萄糖20g以及甘露醇和無菌水配制成1L的甘露醇濃度為0.6mol/L的混合溶液。</p>

24、<p>　　酪蛋白水解培養(yǎng)基：Na2HPO4?7H201.07g，KH2PO40.36g，酪蛋白10g瓊脂粉15g，加蒸餾水定容到1000mL。</p><p>　　以上培養(yǎng)基配置都為自然pH值條件下于0.1Mpa條件下滅菌20min獲得。</p><p>　　2.1.3 主要儀器及試劑</p><p>　　表1 實(shí)驗(yàn)主要儀器</p>&l

25、t;p>　　表2 實(shí)驗(yàn)主要藥品</p><p><b>　　續(xù)表2</b></p><p>　　2.1.4 滲透壓穩(wěn)定劑</p><p>　　滲透壓穩(wěn)定劑種類：氯化鈉，氯化鉀，甘露醇，硫酸鎂。配制方法：用無菌水配制成0.8mol/L的溶液，配制之后都要進(jìn)行高溫高壓滅菌，在0.1MPa，121℃的條件下高溫高壓滅菌20min后備用。滲透壓

26、穩(wěn)定劑必須在無菌條件下使用，每次使用完之后馬上封口，盡快放入冰箱，以防雜菌的污染。</p><p>　　2.1.5 酶液的制備</p><p>　　混合酶液由蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶三種酶以一定的濃度混合，用滲透壓穩(wěn)定劑配制而成。酶液的配置要當(dāng)天配當(dāng)天用。一是為了防止酶的失活，二是防止對(duì)量的估計(jì)不足而造成浪費(fèi)。酶制劑用完之后都要盡快地放入冰箱，這也是為了防止酶的失活。在稱量之前要保證電子天

27、平的水平，還有在箱內(nèi)放入吸濕硅膠，這是因?yàn)槊傅母咝灾灰苌俚牧烤涂梢悦附猓拭看畏Q量的量不多，大多數(shù)只要幾毫克或幾微克，所以由于上述原因，就要做好準(zhǔn)備防止稱量的人為誤差和設(shè)備誤差而造成的酶制劑的稱量不準(zhǔn)確，最后造成酶解的不成功。同時(shí)酶液的配置。</p><p>　　要在無菌條件下配置防止有雜菌的進(jìn)入。此外，盛放酶液的容器和吸量用的移液管在使用前必須在0.1MPa，121℃的條件下高溫高壓滅菌20min，將雜菌除

28、去，使實(shí)驗(yàn)誤差降到最低。</p><p>　　2.1.6 其他試劑</p><p>　　融合劑：30%PEG(聚乙二醇)(MW=6000)，0.01mol/LCaCl2，pH7.5，0.25μm濾膜除菌。</p><p>　　磷酸鹽緩沖液(PB)：取0.2mol/LNaH2PO4溶液87.7mL與0.2mol/LNaH2PO4溶液13.3mL混勻，121℃高壓蒸汽滅

29、菌20min，得到pH值6.0的PB緩沖液。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 菌株活化</p><p>　　在無菌環(huán)境下，將已滅菌的PDA培養(yǎng)基傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，制成平板；待其冷卻凝固后，用無菌接種針蘸取少量保藏的根霉菌種，采用“三點(diǎn)法”點(diǎn)種于平板上，同樣蘸取少量保藏的酵母菌種，采用劃線

30、法接種于平板上，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3天。</p><p>　　2.2.2 菌體培養(yǎng)</p><p>　　于無菌室的無菌環(huán)境下，在酒精燈火焰旁，將液體培養(yǎng)基分裝入滅過菌的培養(yǎng)瓶中并標(biāo)號(hào)。將活化好的菌株接種入已經(jīng)滅過菌的盛有約30ml液體菌絲培養(yǎng)基的搖瓶中(菌絲大小不限，只要用接種針在培養(yǎng)基表面菌落處輕輕蘸取一下即可，每次接種后接種針均要在酒精燈火焰中滅菌并冷卻才可挑取下一個(gè)菌絲)

31、。之后放入30℃，轉(zhuǎn)速為120rad/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)18h。培養(yǎng)到這個(gè)時(shí)候的菌絲還沒有大的菌絲團(tuán)，菌絲團(tuán)的大小剛好（酶的進(jìn)入阻礙不大）還沒有孢子的生成，培養(yǎng)20h以后的菌絲開始產(chǎn)生孢子，會(huì)干擾了原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)，因?yàn)轱@微鏡下看起來原生質(zhì)體的大小和孢子相近，容易造成混淆。所以培養(yǎng)18h的菌絲最好，有利于酶解。</p><p>　　2.2.3 酶系和酶濃度的確定</p><p>　　由于絲狀

32、真菌細(xì)胞壁組成較為復(fù)雜，要獲得較高的原生質(zhì)體數(shù)，選擇適宜的裂解酶系統(tǒng)非常重要，使用微生物產(chǎn)生的酶復(fù)合物或商品酶的混合液比單獨(dú)使用一種酶的效果好[8]，本實(shí)驗(yàn)選取了濃度作為水平，酶的種類作為因素，制定了正交試驗(yàn)因素水平表(見表3)。</p><p>　　培養(yǎng)得根霉菌絲后，經(jīng)離心與培養(yǎng)液分離，根據(jù)表4中設(shè)計(jì)的比例配制混合酶液，并編號(hào)。稱取9份等量的菌絲體，對(duì)應(yīng)編號(hào)中加入相應(yīng)的混合酶液，各酶液的體積是等量的。以下步驟如

33、2.2.6，制得原生質(zhì)體懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。酵母菌體做同樣處理。</p><p><b>　　表3 因素水平</b></p><p>　　2.2.4 滲透壓穩(wěn)定劑的確定</p><p>　　根據(jù)滲透壓穩(wěn)定劑的性質(zhì)，選擇無機(jī)鹽類滲透壓穩(wěn)定劑NaCl、KCl、MgSO4和糖類滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇，設(shè)置0.8mol/L濃度。</p>

34、<p>　　培養(yǎng)得根霉菌絲后，菌絲經(jīng)離心與培養(yǎng)液分離，稱取5份等量的菌絲體，將離心管編號(hào)為1、2、3、4和無菌水對(duì)照，選用蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶濃度分別為0.1%、0.6%、0.3%作為酶解系統(tǒng)，加入以0.8mol/L的NaCl、KCl、甘露醇、MgSO4溶液和無菌水作為滲透壓穩(wěn)定劑配制的混合酶液，各酶液的體積是等量的。以下步驟如2.2.6，制得原生質(zhì)體懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。酵母菌體做同樣處理。</p><

35、;p>　　2.2.5 酶解溫度和時(shí)間的確定</p><p>　　分別選用1.5、2、2.5、3h四個(gè)時(shí)間作為酶解破壁的時(shí)間。</p><p>　　培養(yǎng)得根霉菌絲后，菌絲經(jīng)離心與培養(yǎng)液分離，稱取4份等量的菌絲體，將離心管編號(hào)為1、2、3、4，選用蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶濃度分別為0.1%、0.6%、0.3%作為酶解系統(tǒng)，加入以0.8mol/L的NaCl溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑配制的混合酶液

36、，各酶液的體積是相同的，在溫度為30℃下振蕩酶解。分別于四個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間取出，選用0.8mol/L的NaCl溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，經(jīng)離心，制得原生質(zhì)體懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。酵母菌體做同樣處理。</p><p>　　培養(yǎng)得根霉菌絲后，菌絲經(jīng)離心與培養(yǎng)液分離，稱取3份等量的菌絲體，將離心管編號(hào)為1、2、3、4、5，選用蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶濃度為0.1%、0.6%、0.3%作為酶解系統(tǒng)，加入以0.8mol/L的NaCl

37、溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑配制的混合酶液，各酶液的體積是相同的，分別在溫度為20、25、30、35、40℃下振蕩酶解。經(jīng)2h后取出，選用0.8mol/L的NaCl溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，經(jīng)離心，制得原生質(zhì)體懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。酵母菌體做同樣處理。</p><p>　　2.2.6 原生質(zhì)體制備</p><p>　　將培養(yǎng)好的菌絲體培養(yǎng)液用四層擦鏡紙過濾，根據(jù)離心管大小裝入一定量的菌絲體到已滅菌的離

38、心管中，以1400rad/min離心10min。之后去除上清液。然后將沉淀移入另一個(gè)已經(jīng)稱量過的滅過菌的離心管內(nèi)，封好進(jìn)行稱量(菌絲的移動(dòng)和菌絲的接種，還有上清液的去除等等材料有機(jī)會(huì)接觸外界環(huán)境的情況下，這些操作都要在無菌的條件進(jìn)行)。</p><p>　　酶解液的體積按照以下方法來換算：菌絲重量的1.5倍就是酶解液的量，酶解液為混合酶液，蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶以一定的濃度混合，用滲透壓穩(wěn)定劑配制而成。酶液的配

39、置要當(dāng)天配當(dāng)天用。一是為了防止酶的失活，二是防止對(duì)量的估計(jì)不足而造成浪費(fèi)。酶液的配置要在無菌條件下配置防止有雜菌的進(jìn)入，最后影響試驗(yàn)的結(jié)果。加入混合酶液后將菌絲和酶液充分混勻，放入適當(dāng)?shù)臏囟?、轉(zhuǎn)速為100rad/min的搖床中酶解一定的時(shí)間(每分鐘40~100轉(zhuǎn)的震蕩不僅可以加快原生質(zhì)體的釋放，使達(dá)到最大的原生質(zhì)體形成率的時(shí)間縮短，有利于提高再生率，而且可以抑制孢子的萌發(fā)，有利于原生質(zhì)體的形成)。</p><p>

40、;　　酶解完成之后將混合液用四層擦鏡紙(已紫外滅菌)過濾，接著將濾液裝入EP管(已滅菌)以6000rad/min離心20min(由于原生質(zhì)體小而輕所以一定要高轉(zhuǎn)速才能讓原生質(zhì)體沉淀下來)。之后取少許上清液在顯微鏡下進(jìn)行觀察，如沒有原生質(zhì)體說明原生質(zhì)體已經(jīng)完全沉淀了。此時(shí)可以將上清液去除(即將酶液去除，酶液的去除要盡快，否則會(huì)使酶解過程過度，從而造成原生質(zhì)體的破裂，影響原生質(zhì)體的形成)，然后用滲透壓穩(wěn)定劑懸浮原生質(zhì)體，配成1000個(gè)/mL

41、。以上步驟都要在無菌的條件下進(jìn)行，防止雜菌的進(jìn)入，造成污染影響試驗(yàn)結(jié)果。</p><p>　　2.2.7 雙親滅活</p><p>　　用15W國產(chǎn)紫外線燈管，照射距離30cm，各取5mL原生質(zhì)體懸浮液懸浮。于無菌平皿中分別進(jìn)行1、3、5、7min的照射誘變處理，分析致死率，取未誘變和紫外照射過的原生質(zhì)體涂布到再生平板上，在26～28℃條件下避光培養(yǎng)2~3天。</p><

42、;p>　　2.2.8 原生質(zhì)體融合與再生</p><p>　　取一定量的原生質(zhì)體懸液，加入兩倍體積的濃度40%的PEG4000，于30℃搖床融合20min，鏡檢融合情況，融合后加PB緩沖液洗滌離心2次，然后在超凈工作臺(tái)上涂布于再生培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿菌液放0.2~0.5mL。然后25℃培養(yǎng)48h，觀察菌落數(shù)目。</p><p>　　取根霉對(duì)數(shù)期菌液，經(jīng)離心收集菌體，一份樣品適當(dāng)稀釋后

43、涂布在完全平板上，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量，為酶處理前的細(xì)胞數(shù)，記為A。另一份菌體用磷酸緩沖液洗滌2次，棄上清液，向離心管中加入1mL0.3%β-巰基乙醇-0.1%Na2EDTA-PB溶液，于水浴中保溫10min~15min，間歇振蕩。離心收集菌體，PB洗滌2次后棄去上清液。加入一定量的蝸牛酶液，使蝸牛酶達(dá)到所需濃度，置水浴中，隔時(shí)取樣觀察原生質(zhì)體形成。在指定時(shí)間取樣終止反應(yīng)，離心棄上清液，用SMM高滲液懸浮菌體，適當(dāng)稀釋后分別涂布在完全培養(yǎng)平板上

44、和高滲再生平板上。置28℃培養(yǎng)48h，前者為酶處理后未脫壁的細(xì)胞數(shù)(B)，后者則為未脫壁的細(xì)胞與原生質(zhì)體再生的細(xì)胞總數(shù)(C)。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得酶處理前的細(xì)胞數(shù)A=125，酶處理后未脫壁的細(xì)胞數(shù)B=16，未脫壁的細(xì)胞數(shù)B=16，未脫壁的細(xì)胞與原生質(zhì)體再生的細(xì)胞總數(shù)C=36，按下列公式計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率：</p><p>　　原生質(zhì)體的形成率=(A-B)/A×100% </p>&l

45、t;p>　　原生質(zhì)體的再生率=(C-B)/(A-B)×100% </p><p>　　2.2.9 融合子篩選</p><p>　　融合子分離：48h后觀察結(jié)果計(jì)數(shù)，然后在超凈工作臺(tái)上用接種針挑取每個(gè)菌落接種到PDA培養(yǎng)基上分離純化，每個(gè)培養(yǎng)基放3~5個(gè)，25℃培養(yǎng)24h。然后觀察其形態(tài)特征，并在顯微鏡下觀察。</p><p>　　融合子插片觀察：在

46、分離后的每一個(gè)菌落生長邊緣斜插上玻片，然后25℃培養(yǎng)24h顯微鏡下觀察并檢查孢子大小。</p><p>　　2.2.10 融合子胞外蛋白酶及淀粉酶活力測(cè)定</p><p>　　將分離后的菌落，用直徑2mm的吸管戳4個(gè)小區(qū)域。每個(gè)菌落用接種針挑3個(gè)接種到酪蛋白培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)24h，48h分別觀察透明圈大小，并計(jì)算胞外蛋白酶活力和淀粉酶活力。</p><p>&l

47、t;b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 影響原生質(zhì)體制備因素結(jié)果</p><p>　　3.1.1 不同配比酶解液對(duì)原生質(zhì)體形成的影響</p><p>　　根據(jù)正交試驗(yàn)，制得原生質(zhì)體懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。(結(jié)果見表4)</p><p>　　表4 酶解形成原生質(zhì)體正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果</p>&l

48、t;p><b>　　表5 方差分析</b></p><p>　　由以上數(shù)據(jù)可知，處理8效果最好，即最佳的混合酶液濃度是蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶濃度分別為0.1%、0.6%、0.3%。而且，合適的酶液濃度是原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵影響因素。當(dāng)酶的濃度不足時(shí)，菌絲的細(xì)胞壁難以被消化，原生質(zhì)體難以分離出來，而酶的濃度過高時(shí)，又會(huì)由于消化過于徹底影響所分離出的原生質(zhì)體，影響其再生。</p&g

49、t;<p>　　3.1.2 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成的影響</p><p>　　根據(jù)滲透壓穩(wěn)定劑的性質(zhì)，選擇無機(jī)鹽類滲透壓穩(wěn)定劑NaCl、KCl、MgSO4和糖類滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇，設(shè)置0.8mol/L濃度。</p><p>　　表6 不同滲透壓穩(wěn)定劑下根霉菌原生質(zhì)體形成量</p><p>　　圖1 穩(wěn)定劑下根霉菌原生質(zhì)體形成量</p>

50、<p>　　由上圖可以看出，滲透壓穩(wěn)定劑選用濃度為0.8mol/L的NaCl效果最好。選用合適的穩(wěn)定劑不僅能獲得較高的原生質(zhì)體制備率，而且得到的原生質(zhì)體大小較均勻。</p><p>　　3.1.3 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成的影響</p><p>　　設(shè)定菌體培養(yǎng)時(shí)間分別為14、16、18、20小時(shí)。</p><p>　　表7 不同菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成的影響&

51、lt;/p><p>　　圖2 不同菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成的影響</p><p>　　隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的形成量上升。培養(yǎng)20h以后的菌絲開始產(chǎn)生孢子，會(huì)干擾了原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)，因?yàn)轱@微鏡下看起來原生質(zhì)體的大小和孢子相近，容易造成混淆。所以，確定最佳的菌齡為18h。</p><p>　　3.1.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成的影響</p><p>　　

52、分別選用20、25、30、35、40℃作為酶解破壁的溫度。</p><p>　　表8 不同酶解溫度下根霉原生質(zhì)體形成量</p><p>　　圖3 不同酶解溫度下根霉原生質(zhì)體形成量</p><p>　　合適的酶解溫度既促進(jìn)酶促反應(yīng)的進(jìn)行，又可以避免已形成的原生質(zhì)體遭到破壞。由上圖可知，最佳的酶解溫度是30℃，在此溫度下原生質(zhì)體的釋放量達(dá)到最大。在低于最適酶解溫度時(shí)，

53、隨著溫度的升高，原生質(zhì)體制備率不斷提高；高于最適酶解溫度時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯減少。</p><p>　　3.1.5 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成的影響</p><p>　　分別選用1.5、2、2.5、3h四個(gè)時(shí)間作為酶解破壁的時(shí)間。</p><p>　　表9 不同酶解時(shí)間下根霉原生質(zhì)體的產(chǎn)量</p><p>　　圖4 不同酶解時(shí)間下根霉原生質(zhì)體

54、的產(chǎn)量</p><p>　　由上表可以看出，酶解2h產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)目較多，效果最好。酶解時(shí)間過長，對(duì)于一些早期釋放的原生質(zhì)體膜有破壞作用，導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。</p><p>　　3.1.6 預(yù)處理方式對(duì)原生質(zhì)體形成的影響</p><p>　　不同預(yù)處理方式會(huì)引起細(xì)胞壁的組成或超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響裂解酶的敏感度。一方面，對(duì)已培養(yǎng)好的菌體，在酶解前用適量硫醇化合

55、物(如β-巰基乙醇和二硫蘇糖醇)預(yù)處理能還原細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)的二硫鍵，使分子鏈切開，酶分子易滲入，從而促進(jìn)細(xì)胞壁的水解及原生質(zhì)體的釋放[9]。另一方面，EDTA作為螯合劑，可以避免金屬離子對(duì)酶的抑制作用而提高酶的脫壁效果，從而提高原生質(zhì)體的形成率。</p><p>　　3.1.7 其他影響因素</p><p>　　制備原生質(zhì)體時(shí)輕輕搖動(dòng)或敲擊管壁可讓酶與菌體混合更均勻，并保持良好的通氣條件，

56、有利于提高原生質(zhì)體率。平皿比直立管更有利于酶與菌絲體保持充分接觸，更有利于酶解去壁釋放出更多原生質(zhì)體[10]。培養(yǎng)基組分顯著影響曲霉菌絲原生質(zhì)體的釋放，降低培養(yǎng)基中碳素或氮素養(yǎng)分供給量能顯著促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放，且降低碳素養(yǎng)分的促效更大[11]。此外，原生質(zhì)體的制備還受菌株本身的性質(zhì)、培養(yǎng)方式、酶解液pH等多種因素的影響。</p><p>　　3.2 原生質(zhì)體結(jié)果及再生選擇高酶活力菌種</p><

57、;p>　　3.2.1 菌株活化及菌體培養(yǎng)</p><p>　　圖5 根霉活化 圖6 根霉培養(yǎng)</p><p>　　活化的根霉菌在培養(yǎng)基上生長旺盛，菌絲稠密，頂部長有黑色孢子，接種中心孢子較多，并依次向周圍延伸，菌落顏色呈黃白色，如圖5所示。</p><p>　　經(jīng)過搖床培養(yǎng)的根霉菌絲在培養(yǎng)瓶中纏繞成一團(tuán)，懸于培養(yǎng)瓶中部，培養(yǎng)

58、液顏色變淺，如圖6所示。</p><p>　　3.2.2 原生質(zhì)體制備</p><p>　　圖7 根霉菌絲體 圖8 根霉孢子</p><p><b>　　圖9 根霉原生質(zhì)體</b></p><p>　　根霉原生質(zhì)體在40倍鏡下呈現(xiàn)狀態(tài)如圖9所示，原生質(zhì)體多為透明的圓球形，偶有幾個(gè)

59、呈橢圓形。</p><p>　　3.2.3 原生質(zhì)體的再生</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得酶處理前的細(xì)胞數(shù)A=125，酶處理后未脫壁的細(xì)胞數(shù)B=16，未脫壁的細(xì)胞與原生質(zhì)體再生的細(xì)胞總數(shù)C=36，根據(jù)以下公式：</p><p>　　原生質(zhì)體的形成率=87.20%，原生質(zhì)體的再生率=18.35%。</p><p>　　3.2.4 高酶菌株的篩

60、選</p><p>　　圖10 24h酪蛋白水解培養(yǎng)基上透明圈 圖11 48h酪蛋白水解培養(yǎng)基上透明圈</p><p>　　圖12 24h淀粉酶水解培養(yǎng)基上透明圈 圖13 48h水解淀粉酶培養(yǎng)基上透明圈</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過高溫誘變和紫外誘變后的原生質(zhì)體分別接種于再生培養(yǎng)基上，分別標(biāo)號(hào)，然后又從致死率在80%以上的再生培

61、養(yǎng)基中選出長勢(shì)好的菌種分別接種于酪蛋白培養(yǎng)基及淀粉培養(yǎng)基上經(jīng)過恒溫箱培養(yǎng)后，菌落周圍出現(xiàn)了明顯的透明圈，與菌落形成同心圓，較之親本要明顯很多，如圖12~13所示分別為培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后的情形。</p><p>　　表10 再生的菌種在酪蛋白水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)情況</p><p><b>　　續(xù)表10</b></p><p>　　注：A為高

62、溫誘變后的菌種在酪蛋白水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)的情況，B為高溫誘變后的菌種在酪蛋白水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)的情況。</p><p>　　表11 24小時(shí)透明區(qū)（CH值）Duncan多重比較</p><p>　　培養(yǎng)24小時(shí)后各菌落及透明圈大小情況如上表11所示，經(jīng)過Duncan多重比較，如上表11顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異

63、。</p><p>　　表12 48h透明區(qū)比（CH值）Duncan多重比較</p><p>　　培養(yǎng)48小時(shí)后各菌落及透明圈大小情況如上表12所示，經(jīng)過Duncan多重比較，如上表12顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異。</p><p>　　表13 再生的菌種在淀粉水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)情況</p>

64、;<p>　　表14 24小時(shí)透明區(qū)（CH值）Duncan多重比較</p><p>　　培養(yǎng)24小時(shí)后各菌落及透明圈大小情況如上表14所示，經(jīng)過Duncan多重比較，如上表14顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異。</p><p>　　表15 48h透明區(qū)比（CH值）Duncan多重比較</p><

65、;p>　　比較，如上表15顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異。</p><p>　　表16 再生的菌種在酪蛋白水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)情況</p><p><b>　　續(xù)表16</b></p><p>　　注：A為紫外誘變后的菌種在酪蛋白水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)的情況，B為紫外誘變后菌種

66、在酪蛋白水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)的情況。</p><p>　　表17 24小時(shí)透明區(qū)（CH值）Duncan多重比較</p><p>　　培養(yǎng)24小時(shí)后各菌落及透明圈大小情況如上表17所示，經(jīng)過Duncan多重比較，如上表17顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異。</p><p>　　表18 48h透明區(qū)比（

67、CH值）Duncan多重比較</p><p>　　培養(yǎng)48小時(shí)后各菌落及透明圈大小情況如上表18所示，經(jīng)過Duncan多重比較，如上表18顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異。</p><p>　　表19 再生的菌種在淀粉水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)情況</p><p>　　注：A為紫外誘變后的菌種在淀粉水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)

68、24小時(shí)的情況，B為紫外誘變后的菌種在淀粉水解培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)的情況。</p><p>　　表20 24小時(shí)透明區(qū)（CH值）Duncan多重比較</p><p>　　培養(yǎng)24小時(shí)后各菌落及透明圈大小情況如上表20所示，經(jīng)過Duncan多重比較，如上表20顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異。</p><p&g

69、t;　　表21 48h透明區(qū)比（CH值）Duncan多重比較</p><p>　　培養(yǎng)48小時(shí)后各菌落及透明圈大小情況如上表21所示，經(jīng)過Duncan多重比較，如上表21顯示在5%顯著水平下菌株1~5與親本有顯著差異，在1%顯著水平下菌株1~5與親本有極顯著差異。</p><p><b>　　4 結(jié)論與討論</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)

70、研究了酶系及其濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑和菌齡等因素對(duì)根霉原生質(zhì)體形成的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)和多組對(duì)照分析得出：最佳的混合酶液濃度是蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶以0.1%、0.5%、0.3%的濃度混合，0.8mol/L的NaCl溶液為滲透壓穩(wěn)定劑，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間2h，菌齡18h的實(shí)驗(yàn)條件下，根霉原生質(zhì)體形成率最高。此外，預(yù)處理方式等對(duì)原生質(zhì)體釋放也有顯著影響[11]。同時(shí)，對(duì)根霉原生質(zhì)體進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖贤庹T變以及高溫誘變，當(dāng)

71、原生質(zhì)體再生后，根霉胞外酶活較親本也有了較大的提高。</p><p>　　目前，制備原生質(zhì)體大都是利用酶解法脫去細(xì)胞壁。真菌細(xì)胞壁成分、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，一般要用幾種復(fù)合酶共同作用才能達(dá)到理想的效果[12]。但由于各菌種細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)存在差異，因此不同的菌株所用酶的種類和濃度也各不相同。根霉的細(xì)胞壁是由多層甲殼質(zhì)和α-1，3葡聚糖重復(fù)的復(fù)合體。因此，在一般情況下，采用具有分解甲殼質(zhì)和葡聚糖的裂解酶即能制備出原生質(zhì)體[

72、13]。隨著酶濃度的增加，根霉生質(zhì)體形成率提高，但過高的酶濃度使原生質(zhì)膜穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致原生質(zhì)體的破裂。通過正交試驗(yàn)可以明顯看出采用不同混合酶濃度原生質(zhì)體形成率有顯著地差異。對(duì)于酶解溫度和時(shí)間的選擇，通過實(shí)驗(yàn)可知，根霉在低于最適酶解溫度時(shí)，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體制備率不斷提高；高于最適酶解溫度時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯減少。酶解時(shí)間也并非越長越好。根霉菌絲細(xì)胞壁脫去后，原生質(zhì)體必須在高滲環(huán)境中保存及生長，否則會(huì)因?yàn)闈B透壓過低而破裂。通常使

73、用的滲透壓穩(wěn)定劑分為兩類：一類是鹽溶液系統(tǒng)，包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2等，另一類是糖溶液系統(tǒng)，包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖等[14]。對(duì)本實(shí)驗(yàn)而言，無機(jī)鹽溶液明顯優(yōu)于有機(jī)糖溶液。菌體的不同生理狀態(tài)，</p><p>　　原生質(zhì)體制備是原生質(zhì)體融合技術(shù)中最基礎(chǔ)的步驟，直接影響原生質(zhì)體的再生和融合，因此如何提高原生質(zhì)體的形成率，獲得大小均勻、穩(wěn)定的原生質(zhì)體是非常值得研究的。通過實(shí)驗(yàn)不難發(fā)現(xiàn)，根霉原

74、生質(zhì)體主要受破壁酶的種類和濃度、滲透壓穩(wěn)定劑、酶解時(shí)間、酶解溫度、菌齡、預(yù)處理方式等因素影響。本實(shí)驗(yàn)采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，由于存在較大的主觀誤差，因此對(duì)原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)有待進(jìn)一步探索研究以找到更準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)方法。根霉作為大多數(shù)醬制品的生產(chǎn)菌株，多年來被廣泛用于醬類生產(chǎn)的工藝研究中。本實(shí)驗(yàn)的完成，為通過原生質(zhì)體技術(shù)選育適合醬制品生產(chǎn)用的更為優(yōu)良的高蛋白酶生產(chǎn)菌株奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。</p><p><b>　　參

75、考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Yali Cheng, Richard R.Belanger.Protoplast preparation and regeneration from spores of the biocontrolfungusPseudozymafocculosa[J].FEMS Microbiology Letters,2000,190:287-291.</p&g

76、t;<p>　　[2] 張靜.原生質(zhì)體融合技術(shù)及其在微生物育種中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,17.(5):23-27.</p><p>　　[3] 張志光,李東屏,方芳.絲狀真菌原生質(zhì)體技術(shù)研究—培養(yǎng)條件對(duì)原生質(zhì)體的影響(VII)[J].南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),1998,21(1):60-65.</p><p>　　[4] 周禮紅,李國琴,王正祥等.紅曲霉原生質(zhì)體的

77、制備、再生及遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[J].遺傳,2005,27(3):423-428.</p><p>　　[5] Sanae Kano, Tadanori Aimi, Seita Masumotol, et al.Physiology and Molecular Characteristics of a Pine Wilt Nematode Trapping Fungus,Monacrosporium megalospo

78、rum[J]. Current Microbiology, 2004,49:158-164.</p><p>　　[6] 趙航.微生物除草劑菌種的原生質(zhì)體融合研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文,2005，15（9）：43-58.</p><p>　　[7] 顧克東.脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其原生質(zhì)體的制備[J].甘肅科學(xué)學(xué)報(bào),2003,15(4):40-43.</p><p

79、>　　[8] Ferenczy L et al. Formation of aberrant cell walls and of spores by growing Geotrichum candidum plrotopla[J]. Nature,1974,248:793.</p><p>　　[9] 趙樂輝,李穎,呂淑霞.木霉T21和T22原生質(zhì)體制備和再生研究初報(bào)[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36

80、(1):96-98.</p><p>　　[10] 王建華,趙學(xué)惠.去壁酶與酶解方式對(duì)曲霉原生質(zhì)體釋放的影響[D].微生物學(xué)雜志,2004,24(6):15-17.</p><p>　　[11]王建華,趙學(xué)惠.菌齡與培養(yǎng)基組分對(duì)曲霉原生質(zhì)體釋放的影響[J].工業(yè)微生物,2007,37(2):49-51.</p><p>　　[12] 趙航.微生物除草劑菌種的原生質(zhì)體

81、融合研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文.2005.39（9）：85-92</p><p>　　[13] 陳五嶺,姚勝利.氦氖激光在紅霉素鏈霉菌和龜裂鏈霉菌滅活原生質(zhì)體融合中的應(yīng)用[J].光子學(xué)報(bào),1998,27(7):651-655.</p><p>　　[14] 龐小燕,王吉瑛.構(gòu)建直接發(fā)酵淀粉產(chǎn)生酒精的酵母融合菌株的研究[J].生物工程學(xué)報(bào),2001,17(2):165-169.<