海藻酸鈉碳納米材料固定化對(duì)苯二甲酸降解菌的工藝研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　海藻酸鈉碳納米材料固定化對(duì)苯二甲酸降解菌的工藝研究</p><p><b>　　摘 要<

2、/b></p><p>　　為了提高PTA廢水的處理效率，采用固定化微生物的方法來處理PTA廢水。通過實(shí)驗(yàn)得出采用2%海藻酸鈉混合0.45%的碳納米材料包埋PTA降解菌使得PTA降解率達(dá)到最大。固定化PTA降解菌的最適溫度是30℃，最適pH為7。同時(shí)通過固定床處理得出PTA溶液通過固定化細(xì)胞的流速為30mL/min，高徑比為30:1（即柱高為30cm，內(nèi)徑為1cm），PTA濃度為0.2-0.4g/L時(shí)，PT

3、A的降解率達(dá)到最大。</p><p>　　關(guān)鍵詞：PTA降解菌；固定化；碳納米材料</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In order to improve the PTA wastewater treatment efficiency, adopt immobilized microorganism m

4、ethod to deal with the PTA wastewater. Through the experiment is mixed by 2% sodium alginate and 0.45% carbon nano-material of embedding PTA degradation bacterium make the PTA degradation rate achieve maximum. Immobilize

5、d PTA degrading bacteria optimum temperature is 30 ℃,the optimal pH is 7.At the same time through Fixed bed treatment get the PTA degradation rates achieve maximum when immobilized PTA d</p><p>　　Key words:

6、PTA degrading bacteria；immobilization；carbon nano-material</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言2</b></p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p

7、>　　2.1 材料與儀器3</p><p>　　2.1.1 儀器3</p><p>　　2.1.2 材料3</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法3</p><p>　　2.2.1 菌種培養(yǎng)3</p><p>　　2.2.2 胞內(nèi)酶胞外酶的確定的研究4</p><p>　　2.2

8、.3 不同環(huán)境下固定化細(xì)胞降解PTA的研究5</p><p>　　2.2.4 固定床降解PTA的研究5</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析6</b></p><p>　　3.1 胞內(nèi)酶胞外酶的確定6</p><p>　　3.2 不同量的碳納米材料對(duì)固定化細(xì)胞降解PTA的影響6</p>&l

9、t;p>　　3.3 不同溫度對(duì)固定化細(xì)胞降解PTA的影響7</p><p>　　3.4 不同pH對(duì)固定化細(xì)胞降解PTA的影響8</p><p>　　3.5 固定床降解PTA的工藝處理研究8</p><p>　　3.5.1 不同濃度PTA對(duì)固定化細(xì)胞降解能力的影響8</p><p>　　3.5.2 不同高徑比對(duì)固定化細(xì)胞降解情況的

10、影響9</p><p>　　3.5.3 不同流速對(duì)固定化細(xì)胞降解情況的影響9</p><p><b>　　4 結(jié)論10</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)11</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1

11、 前言</b></p><p>　　1.1 對(duì)苯二甲酸的研究現(xiàn)狀</p><p>　　對(duì)苯二甲酸(PTA)是一種重要的化工原料，目前廣泛應(yīng)用于合成樹脂、滌綸纖維、塑料薄膜、增塑劑和染料等行業(yè)[1]。PTA在廣泛應(yīng)用的同時(shí)，大量進(jìn)入自然環(huán)境中，據(jù)報(bào)道，我國(guó)目前PTA的產(chǎn)量大約在450萬噸以上，產(chǎn)生的廢水卻有1800萬噸，而且PTA的產(chǎn)量又在逐年增加，從而PTA廢水的排放量也會(huì)大大

12、增加。而目前處理PTA廢水的工藝，主要以二段好氧及AO等工藝為主[2-4]。</p><p>　　這些工藝普遍存在停留時(shí)間長(zhǎng)、處理負(fù)荷低、基建投資和處理成本高等問題。近年來國(guó)內(nèi)外越來越多的企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)都開始加大對(duì)PTA廢水的生物處理研究[5-7]，但如今還不能進(jìn)行得到大規(guī)模運(yùn)用。</p><p>　　1.2 對(duì)苯二甲酸降解菌固定化方面的研究</p><p>　　微

13、生物固定化技術(shù)是生物工程領(lǐng)域的一項(xiàng)新興技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于制藥、化工、食品發(fā)酵及環(huán)保等領(lǐng)域。近年來在廢水處理中采用固定化微生物技術(shù)越來越受到人們的關(guān)注，且取得一定的成果。它和傳統(tǒng)的懸浮生物處理法相比，具有處理效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、保持高效菌種、生物濃度高、耐沖擊、污泥生成量少、固液分離效果好等特點(diǎn)[8]。固定化微生物處理廢水的主要特點(diǎn)是設(shè)備小型化，系統(tǒng)化并節(jié)省運(yùn)行費(fèi)用。</p><p>　　而如今固定化對(duì)苯二甲酸降

14、解菌的方法主要有硅藻土吸附固定化微生物[9]、PVA包埋固定化[10]等。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中都得到了很好的成效，硅藻土吸附固定化微生物則是利用其具有孔隙率高、比表面積大、比重小、吸附性強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)異的理化性質(zhì)，而且其在處理工業(yè)廢水和凈化飲用水方面的技術(shù)已經(jīng)有20年左右的歷史[11]。以硅藻土作為細(xì)菌的載體，制成吸附固定化微生物來處理污水。而PVA固定化微生物的特點(diǎn)主要有外密內(nèi)疏的多空結(jié)構(gòu)，顆粒具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和通透性，且制作方法簡(jiǎn)

15、單，耐用，而且其中使用的系統(tǒng)啟動(dòng)性快，耐沖擊，便于連續(xù)化和自動(dòng)化控制等特點(diǎn)，而且到pH≥3.5時(shí)，該系統(tǒng)處理PTA廢水時(shí)不用調(diào)節(jié)pH，節(jié)省堿的消耗及運(yùn)行費(fèi)用。</p><p>　　1.2 本課題研究?jī)?nèi)容與意義</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)苯二甲酸降解菌進(jìn)行固定化處理，同時(shí)在固定化顆粒中摻雜入碳納米材料進(jìn)行研究和工藝處理[12-15]。分別在不同溫度、pH、細(xì)菌量的情況下研究該固定化菌

16、處理TA溶液，從而確定最佳的固定化條件。</p><p>　　由于目前在治理PTA生產(chǎn)廢水方法大多數(shù)具有占地面積大、投資和運(yùn)行費(fèi)用高、處理效率低的缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用人工篩選高效降解菌種并固定化處理PTA廢水，對(duì)于提高處理效果，節(jié)省投資，降低運(yùn)輸費(fèi)用具有積極意義。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>

17、;　　2.1 材料與儀器</b></p><p><b>　　2.1.1 儀器</b></p><p>　　本研究所采用的主要儀器和設(shè)備如表1所示。</p><p>　　表1 主要儀器和設(shè)備</p><p><b>　　2.1.2 材料</b></p><p>

18、　　2.1.2.1 菌種</p><p>　　菌種為假單胞菌由實(shí)驗(yàn)室提供。</p><p>　　2.1.2.2 藥品</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所采用的主要藥品如表2所示。</p><p>　　表2 主要實(shí)驗(yàn)藥品</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><

19、;p>　　2.2.1 菌種培養(yǎng)</p><p>　　2.2.1.1 斜面培養(yǎng)基的配方</p><p>　　表3 斜面培養(yǎng)基配方</p><p>　　用鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.0左右，在0.1Mpa，121℃的滅菌鍋滅菌20min。</p><p>　　2.2.1.2 菌體保存</p><p>　　接種環(huán)取菌種劃線于新

20、鮮斜面上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱，待菌體生長(zhǎng)旺盛，將斜面放在4℃的冰箱中低溫保藏。</p><p>　　2.2.1.3 液體培養(yǎng)基配方</p><p>　　用于做對(duì)苯二甲酸降解菌液體培養(yǎng)基成分如表4所示。</p><p>　　表4 液體培養(yǎng)基成分</p><p>　　2.2.1.4 菌體制備</p><p><b

21、>　?。?）斜面種子活化</b></p><p>　　取斜面保藏菌種介于新鮮斜面上，在30℃恒溫下培養(yǎng)。</p><p><b>　　（2）菌體培養(yǎng)</b></p><p>　　取1-2環(huán)在斜面活化后的細(xì)菌接種入裝有100mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，</p><p>　　30℃，140r/min的搖

22、床振蕩養(yǎng)48h。</p><p><b>　?。?）菌體細(xì)胞獲得</b></p><p>　　將培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)液在10000r/m離心10min，收集菌體細(xì)胞。用5倍體積的生理鹽水洗滌，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心，共3次，收集沉淀，即為菌體細(xì)胞。</p><p>　　2.2.2 胞內(nèi)酶胞外酶的確定的研究</p>

23、<p>　?。?）胞內(nèi)酶、胞外酶的提取</p><p>　　將培養(yǎng)48h的培養(yǎng)液在240nm下測(cè)其吸光度，算出對(duì)苯二甲酸的含量。然后在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心分離10min，收集上清液，定為胞外酶。用5倍體積的生理鹽水洗滌沉淀，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心，離心3次，收集沉淀，定為胞內(nèi)酶。</p><p>　　（2）胞內(nèi)、胞外酶的確定</p&g

24、t;<p>　　取6個(gè)培養(yǎng)瓶，分別貼上標(biāo)簽，在3個(gè)培養(yǎng)瓶中加入50mL胞外酶的上清液。向胞外酶液中加入PTA，使該酶液的PTA濃度為0.1g/L，同時(shí)也向另外3個(gè)裝有等量胞內(nèi)酶的培養(yǎng)瓶中加入0.1g/L的PTA溶液50mL，然后將6個(gè)培養(yǎng)瓶放入30℃、140r/min的搖床中振蕩。分別在1h，2h，4h，24h測(cè)其在240nm下的吸光度，測(cè)出其降解率。</p><p>　　2.2.3 不同環(huán)境下固定

25、化細(xì)胞降解PTA研究</p><p>　　（1）不同量的碳納米材料對(duì)固定化細(xì)胞降解PTA的研究</p><p>　　將培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)菌離心清洗收集菌體細(xì)胞（菌體濕重為1.016g）。將10mL生理鹽水加入收集的菌體細(xì)胞中混勻。同時(shí)用生理鹽水配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉水溶液200ml，分成5份，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.15%、0.3%、0.45%、0.6%、0.75%的碳納米材料

26、，制備成不同比例的海藻酸鈉碳納米材料混合溶液，同時(shí)向每個(gè)混合液中加入2mL細(xì)菌溶液。混合均勻后，用注射器取上述溶液滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%CaCl2溶液中固化為鈣凝膠球，即為我們所要的固定化細(xì)菌。固定處理2h后，用生理鹽水清洗3-4遍，最后分別加入含有0.1g/L的對(duì)苯二甲酸的生理鹽水中（溶液pH為7），在30℃、140r/min搖床下震蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)1h、2h、4h、24h后，在240nm下，以蒸餾水做空白，測(cè)其的吸光度。</p>

27、;<p>　?。?）固定化細(xì)胞降解PTA的最適溫度的研究</p><p>　　將培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)菌離心清洗收集菌體細(xì)胞（菌體濕重為0.989g）。然后將細(xì)菌加入到海藻酸鈉為2%，碳納米材料為0.45%的混合溶液中，將其滴入2% CaCl2溶液中得到固定化細(xì)菌。取15個(gè)培養(yǎng)瓶，將其分成5組，每組有3瓶。在每個(gè)瓶中加入濃度為0.1g/L的PTA溶液50mL（PTA溶液pH為7）。貼上對(duì)應(yīng)的溫度標(biāo)簽。向每

28、個(gè)培養(yǎng)瓶中加10mL的對(duì)苯二甲酸固定化細(xì)胞，在20、25、30、35、40℃的溫度下分別作靜態(tài)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1h、2h、4h、24h時(shí)在240nm下，以蒸餾水做空白，測(cè)其的吸光度。</p><p>　　（3）固定化細(xì)胞降解PTA的最適pH的研究</p><p>　　將培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)菌離心清洗收集菌體細(xì)胞（菌體濕重為1.105g）。然后將細(xì)菌加入到海藻酸鈉為2%，碳納米材料為0.45%的

29、混合溶液中，將其滴入2% CaCl2溶液中得到固定化細(xì)菌。取15個(gè)培養(yǎng)瓶，將其分成5組，每組3瓶，貼上對(duì)應(yīng)的pH標(biāo)簽。配置pH分別為5、6、7、8、9，濃度為0.1mol/L的PTA溶液，加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入50mL。向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入10mL對(duì)苯二甲酸固定化細(xì)胞。然后在30℃、140r/min搖床下震蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1h、2h、4h、24h時(shí)在240nm下，以蒸餾水做空白，測(cè)其的吸光度。</p><

30、;p>　　2.2.4固定床降解PTA的研究</p><p>　　（1）制備固定化細(xì)菌</p><p>　　將培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)菌離心清洗收集菌體細(xì)胞（菌體濕重為2.305g）。然后將細(xì)菌加入到海藻酸鈉為2%，碳納米材料為0.45%的混合溶液中，將其滴入2% CaCl2溶液中得到固定化細(xì)菌。固定2h后清洗3遍即可使用。</p><p>　　（2）固定床下不同濃度P

31、TA降解情況研究</p><p>　　將處理好的固定化細(xì)胞加入固定床中，高徑比30:1，調(diào)整好固定床。分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8g/L的PTA溶液各50mL分別進(jìn)行上樣。流速為10mL/min，其中PTA溶液是用生理鹽水配置而成。收集的液體重新回到貯液器中，如此循環(huán)往復(fù)。分別測(cè)得240nm下不同時(shí)間段的吸光值。</p><p>　　（3）不同高徑比下固定化細(xì)胞降解PTA的研

32、究</p><p>　　將處理好的固定化細(xì)胞按加入到固定床中，使得固定床的高徑比分別為15:1、20:1、30:1、40:1，調(diào)整好固定床。使用PTA濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進(jìn)行上樣，流速為10mL/min。收集的液體重新回到貯液器中，如此循環(huán)往復(fù)。分別測(cè)得在240nm下不同時(shí)間的吸光值。</p><p>　?。?）不同流速下固定化細(xì)胞降解PTA的研究</p>

33、<p>　　將處理好的固定化細(xì)胞按加入到固定床中，高徑比為30:1，調(diào)整好固定床。使用濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進(jìn)行上樣，流速分別為10、20、30、40mL/min。收集的液體重新回到貯液器中，如此循環(huán)往復(fù)。分別測(cè)得在240nm下不同時(shí)間的吸光值。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 胞內(nèi)酶胞外酶的確

34、定</p><p>　　從圖1可以明顯看出在相同的時(shí)間內(nèi)胞內(nèi)酶的降解速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胞外酶的降解速率，而且胞內(nèi)酶在4h內(nèi)幾乎把全部的PTA降解完全，從而看出對(duì)苯二甲酸降解菌的降解酶存在于細(xì)胞內(nèi)部。</p><p>　　3.2不同量的碳納米材料對(duì)固定化細(xì)胞降解PTA的影響</p><p>　　將含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.15%、0.3%、0.45%、0.6 %、0.75

35、%的碳納米材料固定化細(xì)胞分別加入到PTA溶液為50mL培養(yǎng)瓶，PTA溶液濃度為0.1g/L。.在相同條件下震蕩培養(yǎng)，分別在1h、2h、4h、24h測(cè)得吸光度，計(jì)算PTA濃度。結(jié)果如圖2所示。</p><p>　　從圖2可以看出，該固定化細(xì)胞降解率隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。而其中沒有摻雜碳納米材料的固定化細(xì)胞降解率最差，而摻雜了碳納米材料的固定化細(xì)胞降解率都比沒摻雜前的固定化細(xì)胞強(qiáng)，其中碳納米材料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45

36、%的固定化細(xì)胞降解率最好。由此可以看出，摻雜碳納米材料對(duì)固定化細(xì)胞降解率的提高有一定的作用。</p><p>　　3.3不同溫度對(duì)固定化細(xì)胞降解PTA的影響</p><p>　　將處理好的固定化細(xì)胞分別按相同的比例分配到裝有50mL的PTA溶液的培養(yǎng)瓶中，PTA溶液的濃度為0.1g/L。將其放入溫度分別為20、25、30、35、40℃的水浴鍋中培養(yǎng)，分別在1h、2h、4h、24h測(cè)得吸光度

37、，計(jì)算PTA濃度。結(jié)果如圖3所示。</p><p>　　從圖3可以看出溫度的過高或過低，都會(huì)使得細(xì)胞的活性降低，但是當(dāng)溫度過高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)加劇，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化，部分細(xì)菌發(fā)生不可逆失活，固定化細(xì)胞的活力損失力度加大。使得固定化細(xì)胞的降解能力急劇下降。綜上所述，固定化細(xì)胞降解PTA的環(huán)境溫度不宜過高，可以確定固定化細(xì)胞降解的最適溫度為30℃。</p><p>　　3.4不同pH對(duì)固定化細(xì)

38、胞降解PTA的影響</p><p>　　將處理好的固定化細(xì)胞分別按相同的比例分配到裝有50mL的PTA溶液的培養(yǎng)瓶中，PTA溶液的濃度為0.1g/L。將其放入pH分別為5、6、7、8、9的PTA溶液中培養(yǎng)，分別在1h、2h、4h、24h測(cè)得吸光度，計(jì)算PTA濃度后進(jìn)行比較。結(jié)果如圖4所示。</p><p>　　從圖4可以看出，pH值低于7時(shí)，固定化細(xì)胞的降解PTA的能力逐漸變差，而當(dāng)pH大

39、于7，并逐漸升高時(shí)，固定化細(xì)胞降解PTA的能力同樣逐漸變差。因此固定化細(xì)胞在pH為7時(shí)的降解PTA的能力最大。</p><p>　　3.5固定床降解PTA的工藝處理研究</p><p>　　3.5.1不同濃度PTA對(duì)固定床降解能力的影響</p><p>　　固定床高徑比為30:1，分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8g/L的PTA溶液各50mL分別進(jìn)行上樣。流

40、速為10mL/min，其中PTA溶液是用生理鹽水配置而成。收集的液體重新回到貯液器中，同時(shí)計(jì)算PTA在12h的降解率。結(jié)果如圖5所示。</p><p>　　從圖5可以看出，當(dāng)PTA濃度在0.2～0.6g/L時(shí)固定化細(xì)胞在12h內(nèi)對(duì)PTA的降解率基本相同，但是PTA濃度為0.6g/L時(shí)降解率有少許降低，當(dāng)PTA濃度為0.8g/L時(shí)降解率有明顯下降。由此得出當(dāng)固定化細(xì)胞中PTA濃度為0.2～0.4g/L是降解率達(dá)到最

41、大。</p><p>　　3.5.2不同高徑比對(duì)固定化細(xì)胞降解情況的影響</p><p>　　固定床高徑比(柱高與內(nèi)徑的比值)分別為15:1、20:1、30:1、40:1，調(diào)整好固定床。PTA濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進(jìn)行上樣，流速為10mL/min。分別測(cè)得在240nm下1～12h的吸光值，同時(shí)計(jì)算出TA濃度。結(jié)果如圖6所示。</p><p>　　從圖

42、6明顯可以看出，高徑比逐漸增大，固定化細(xì)胞對(duì)PTA的降解速率也逐漸升大。由此判斷高徑比越大，固定化細(xì)胞對(duì)PTA的降解速率也會(huì)隨之變大。</p><p>　　3.5.3不同流速對(duì)固定化細(xì)胞降解情況的影響</p><p>　　高徑比為30:1，濃度為0.2g/L的溶液各50mL分別進(jìn)行上樣，流速分別為10、20、30、40mL/min。分別測(cè)得在240nm下1～12h的吸光值。結(jié)果如圖7所示。

43、</p><p>　　從圖7可以看出，當(dāng)流速低于或者高于30mL/min時(shí)，固定化細(xì)胞的降解能力都逐漸降低，由此可知當(dāng)流速為30mL/min時(shí)，為固定化細(xì)胞降解PTA的最適流速。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　綜上所述，該對(duì)苯二甲酸降解菌的降解酶存在于細(xì)胞內(nèi)部，屬于胞內(nèi)酶。而當(dāng)0.45%碳納米材料與2%海藻酸

44、鈉混合固定化包埋細(xì)菌時(shí)，固定化細(xì)胞的降解率最大。其固定化細(xì)菌降解PTA的最適溫度為30℃，最適pH為7。同時(shí)通過固定床反應(yīng)器中測(cè)得PTA溶液流經(jīng)固定化細(xì)胞的流速為30mL/min，PTA溶液濃度在0.2～0.4g/L之間時(shí)，固定化細(xì)胞的降解效率最高，同時(shí)當(dāng)層析柱高徑比越大PTA溶液的降解率也越大。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1

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