大螟對低溫脅迫的響應.pdf

1、大螟Sesamia inferens(Walker)又名稻蛀莖夜蛾、紫螟。大螟廣泛分布于東南亞產(chǎn)稻國家（菲律賓、越南、老撾、柬埔寨等）及南太平洋島嶼（巴布亞新幾內(nèi)亞等），在朝鮮、日本、印度等國家也有報到。過去的研究認為，大螟在我國的分布北限大致在北緯34°的陜西周至、河南信陽、安徽合肥和江蘇淮陰一線。隨著全球氣候變暖，大螟的分布北限也在逐漸向北擴展，己在北緯34°以北的稻區(qū)發(fā)生危害。大螟原為一種水稻上的常發(fā)次要害蟲，然而在21世紀初，安

2、徽、湖北、湖南、江蘇、江西等省相繼報道大螟種群數(shù)量迅速上升，對水稻的為害逐漸加重并成為水稻的主要害蟲之一。本文從生理生態(tài)和分子生物學角度研究大螟對低溫脅迫的響應，以便更好地了解大螟越冬階段的行為特征，探討大螟的耐寒性策略和對低溫脅迫的響應機理，從而為掌握該蟲的爆發(fā)成災機理提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、揚州地區(qū)越冬大螟的耐寒特性和策略
　　越冬初期（2012年10月份）的大螟幼蟲死亡率(M)與處理溫度(T,[-12

3、，-21)的關系符合關系式:M=0.9832e-0.0354(T+12)一0.0004（T+12)4。繼而推算LTemp50=-6.119℃，LTemp90=-9.774℃。整個越冬期間大螟幼蟲耐寒性呈現(xiàn)顯著的季節(jié)性變化，在2013-1-30達到最高。但過冷卻點變化不顯著，平均過冷卻點為-6.80℃。在2013年3月9日前，越冬大螟幼蟲的含水量變化差異不顯著，平均含水量為63.5％;之后隨環(huán)境溫度上升，含水量顯著增加，達到約76％。小分

4、子糖及多元醇（甘油、海藻糖、果糖、葡萄糖和肌醇）變化趨勢相似，隨著環(huán)境溫度降低，在1月份含量上升到各自的最高峰，分別為甘油359.79μ g/g、海藻糖20.46 mg/g、果糖69.78μg/g、葡萄糖377.25μg/g、肌醇59.55μg/g;隨后又隨著環(huán)境溫度上升而下降。綜合上述研究結(jié)果，初步推測揚州地區(qū)大螟的越冬耐寒策略為耐凍型。
　　2、克隆了5個大螟熱激蛋白基因
　　采用RT-PCR和RACE技術，成功的從大螟

5、中克隆得到5個熱激蛋白基因，分別為Sihsp83、Sihsc70、Sihsp21.4、Sihsp20.6和Sihsp19.6。5個熱激蛋白基因cDNA序列全長分別為2496、2160、1385、835和798 bp，開放閱讀框長度分別為2154、1962、564、552和525 bp，分別編碼717、653、187、183和174個氨基酸，推測分子量分別為82.6、71.6、19.6、20.6和19.6 kDa。序列分析發(fā)現(xiàn)5個熱激蛋白

6、與其他物種具有很高的相似性，都具有各自家族的典型結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位分析結(jié)果表明HSP83和HSC70位于細胞質(zhì)。在HSP21.4、HSP20.6和HSP19.6氨基酸序列中各發(fā)現(xiàn)1個HSP20家族典型基序。
　　通過比對基因組序列和cDNA序列發(fā)現(xiàn)，Sihsp83、Sihsp20.6和Sihsp19.6均不含有內(nèi)含子;Sihsc70含有2個內(nèi)含子，長度分別為685 bp和803 bp。前者位于61-745 bp（基因組序列），編碼

7、區(qū)上游，緊挨著編碼區(qū);后者位于954-1756bp（基因組序列），編碼區(qū)內(nèi);Sihsp1.4含有1個內(nèi)含子，1210 bp，位于472-1681 bp，基因編碼區(qū)內(nèi)。所有內(nèi)含子的基因組剪切位點符合經(jīng)典的GT-AG規(guī)則。系統(tǒng)進化分析顯示，與相近物種的熱激蛋白具有很高的同源性。
　　3、大螟內(nèi)參基因的篩選研究
　　通過RT-RCR技術克隆了7個大螟看家基因的部分片段，包括18S rRNA、EF1、GAPDH、RPS13、RPS2

8、0、TUB和ACTB。利用qRT-PCR技術研究了7個看家基因在大螟不同組織（頭部、體壁、脂肪體、前腸、中腸、后腸、血淋巴、馬氏管和唾腺），不同生長發(fā)育階段（卵、1-6齡、雌蛹、雄蛹、雌成蟲和雄成蟲）以及不同溫度處理(-8℃、-6℃、-4℃、-2℃、0℃和27℃)實驗條件下的表達穩(wěn)定性。運用常用的內(nèi)參基因篩選程序(NormFinder、geNorm和BestKeeper)以及比較△Ct法對各看家基因進行了排名，經(jīng)過RefFinder綜合

9、評估后，得出了最佳的內(nèi)參方案。不同組織內(nèi)參組合:RPS13、RPS20和EF1;不同發(fā)育階段內(nèi)參組合:18S rRNA、EF1和GAPDH;不同溫度處理內(nèi)參組合:18S rRNA、BPS20和TUB。
　　4、大螟5個熱激蛋白基因的表達模式
　　采用Real-time PCR研究了5個大螟熱激蛋白基因在大螟不同組織（頭部、體壁、脂肪體、前腸、中腸、后腸、血淋巴、馬氏管和唾腺）、不同生長發(fā)育階段（卵、1-6齡、雌蛹、雄蛹、雌成

10、蟲和雄成蟲）以及不同溫度處理（-8℃、-6℃、-4℃、-2℃、0℃和27℃）下的表達模式。結(jié)果表明，5種熱激蛋白基因在上述實驗條件下均有表達。在不同組織中，Sihsp83和Sihsp19.6在后腸中的表達量最高;Sihsp20.6在前腸中的表達量最高;Sihsp21.4在頭部中的表達量最高;Sihsc70在各組織中的表達量差異不顯著。在大螟不同生長發(fā)育階段中，Sihsp21.4在雌成蟲體內(nèi)表達最高;其余4種熱激蛋白基因在卵中均有很高的表