大葉冬青苦丁茶中熊果酸提取工藝的研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　大葉冬青苦丁茶中熊果酸提取工藝的研究</p><p><b>　　專業(yè)：應(yīng)用化學(xué)</b></p><p>　　摘 要： 本文綜述了苦丁茶的種類、主要的化

2、學(xué)成分和熊果酸的性能及研究進(jìn)展。本研究以大葉冬青苦丁茶為原料，研究了提取熊果酸用回流提取法的最佳提取工藝，并用分光光度法進(jìn)行含量的測定。</p><p>　　關(guān)鍵詞：熊果酸；苦丁茶；分光光度法 </p><p>　　Study on the Extraction Technology of Ursolic Acid from Kudingcha</p><p>　　

3、Abstract:This article summerizes the kinds and the main chemical compounds of kudingcha.This paper was showed the performance and the recent studies of ursolic acid.This study researches the best extraction process of ur

4、solic acid from kudingcha and examines the content of ursolic acid from kudingcha by Spectrophotometric method.</p><p>　　Key words: ursolic acid; kudingcha; spectrophotometric method</p><p><

5、b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　1.1概述1</b></p><p>　　1.2苦丁茶簡介1</p><p>　　1.2.1苦丁茶的種類及分布1</p><p>　　1.2.2苦丁茶

6、的主要化學(xué)成分1</p><p>　　1.3熊果酸的結(jié)構(gòu)及藥理作用2</p><p>　　1.3.1熊果酸的結(jié)構(gòu)與來源2</p><p>　　1.3.2熊果酸的藥理作用2</p><p>　　1.4熊果酸的提取及純化方法3</p><p>　　1.4.1熊果酸的主要提取方法3</p><

7、p>　　1.4.2熊果酸的主要純化方法4</p><p>　　1.4.3熊果酸的測定方法4</p><p>　　1.5苦丁茶中熊果酸的開發(fā)現(xiàn)狀5</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)部分5</b></p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)藥品與儀器5</p><p>　　2.2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)說明

8、6</p><p><b>　　2.3實(shí)驗(yàn)步驟6</b></p><p>　　2.3.1對照品溶液的制備6</p><p>　　2.3.2測定波長的確定6</p><p>　　2.4熊果酸的提取6</p><p>　　2.4.1樣品溶液的制備6</p><p>　

9、　2.4.2測定吸光度6</p><p><b>　　3結(jié)果與討論7</b></p><p>　　3.1熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備7</p><p>　　3.2提取工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)7</p><p>　　3.2.1乙醇濃度對熊果酸提取率的影響7</p><p>　　3.2.2液料比對熊果酸

10、提取率的影響8</p><p>　　3.2.3提取時(shí)間對熊果酸提取率的影響9</p><p>　　3.2.4提取溫度對熊果酸提取率的影響10</p><p>　　3.2.5提取次數(shù)對熊果酸提取率的影響10</p><p>　　3.3可行性研究11</p><p>　　3.3.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)11</p&g

11、t;<p>　　3.3.2精密度實(shí)驗(yàn)11</p><p>　　3.3.3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)11</p><p>　　3.3.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)12</p><p>　　3.4正交實(shí)驗(yàn)安排12</p><p><b>　　3.5結(jié)論14</b></p><p><b>　　4

12、展望14</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)14</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1引言</b></p><p><b>　　1.1 概述</b></p><p>　　苦丁茶產(chǎn)自

13、我國，種類繁多。得名來源于其沖泡后先苦后甘，飲后余味猶存?？喽〔璨粌H作為清涼的飲品而倍受青睞，而且更是由于苦丁茶具有解酒、消炎鎮(zhèn)痛、降血脂、降血糖等功效?？喽〔柚芯哂泻枯^高的熊果酸，而苦丁茶的眾多藥理作用都和其中含有的熊果酸有關(guān)。熊果酸又名烏索酸，烏蘇酸，是一種五環(huán)三萜類的化合物，具有保肝、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗糖尿病、降血脂血糖等多種生物學(xué)作用，并且還發(fā)現(xiàn)它具有抗致癌、抗促癌和抗血管作用，是一種新發(fā)現(xiàn)的高效抗癌活性成分，極有可能成為新型的抗

14、癌藥物。此外熊果酸還具有顯著的抗氧化功能，因而在化妝品和醫(yī)藥上被廣泛地使用。熊果酸眾多的藥用價(jià)值使得研究員們對不同科屬植物中熊果酸的含量進(jìn)行了分析測定。</p><p><b>　　1.2 苦丁茶簡介</b></p><p>　　1.2.1 苦丁茶的種類及分布</p><p>　　苦丁茶在我國已有2000多年的歷史，長期飲用苦丁茶，有良好的醫(yī)療

15、保健作用，因此苦丁茶有“綠色黃金”的美譽(yù)?？喽〔枭趤啛釒У貐^(qū)海拔800-1500米之間的山谷和山坡中下部的雜木林中?？喽〔柙谖覈戏礁饔蟹植迹渲姓憬?、廣西、福建種類較多，主要有大葉冬青、徹骨、日本毛女貞、貓兒刺、苦茶葉。其次是安徽、廣東、四川，主要有枸骨、貓兒刺、日本毛女貞。此外江西、湖南、云南貴州均有大葉冬青、日本毛女貞。浙江、廣西、福建、江西以大葉冬青苦丁茶為主，而在云南、貴州、四川以枸骨茶較多。</p><

16、p>　　1.2.2 苦丁茶的主要化學(xué)成分</p><p>　　苦丁茶含有的化學(xué)成分有氨基酸、維生素、多酚類、黃酮類物質(zhì)、咖啡堿、可溶性多糖、熊果酸等三萜類化合物。</p><p>　　苦丁茶中含有的氨基酸種類與普通茶葉中的相似，但在含量上差別很大。普通茶葉游離氨基酸的含量為苦丁茶鮮葉的15倍。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶中大約有17種游離的氨基酸，18種水解氨基酸，其中組氨酸為苦丁茶的特征氨基

17、酸，而且發(fā)現(xiàn)苦丁茶與別的茶葉具有不用的氮代謝類型。</p><p>　　苦丁茶中含有高含量的維生素C、維生素E、維生素B1、維生素B2，其中維生素E的含量較為豐富。</p><p>　　目前發(fā)現(xiàn)的苦丁茶中含有的微量元素主要有Ca，Mg，Mn，F(xiàn)e，Zn，Cu，Co，Mo，K，Pb，Ge，Al，Ni 等，這些都是人體所必須的微量元素。其中苦丁茶中Ca、Zn元素的含量比普通茶中的高，而Al、M

18、n元素的含量比普通茶葉的低。在廣西發(fā)現(xiàn)的苦丁茶，Mn的含量較高，具有很好的藥用價(jià)值。而貴州的苦丁茶Se含量較高，是普通茶葉的一倍多。浙江產(chǎn)的大葉苦丁茶中K、Ca、Mg、Ge 元素含量較小葉種苦丁茶高的多，但Pb、Cu 元素的含量卻不如小葉苦丁茶。</p><p>　　和其它茶葉相比，苦丁茶中多酚類物質(zhì)含量比較少。冬青屬苦丁茶多酚類的含量為9.01%～9.31%，貴州女貞屬苦丁茶多酚類的含量為8.8%～15.42%

19、，而四川女貞屬苦丁茶多酚類的含量為3.03%～5.05%。</p><p>　　苦丁茶中含有蘆丁、槲皮素和楊梅酮等黃銅類物質(zhì)，苦丁茶中正是因?yàn)橛羞@些黃酮類物質(zhì)的存在才造成了苦丁茶的味苦。黃酮類物質(zhì)大多以糖苷的形式存在，因?yàn)樵跓嶙饔孟拢擒瞻l(fā)生水解，降低了糖苷類物質(zhì)的苦味?？喽〔瑾?dú)特的先苦后甘正是由此而來。</p><p>　　苦丁茶中咖啡堿的含量很低，有的甚至不含，因此苦丁茶更加適合老人兒

20、童飲用。</p><p>　　苦丁茶中的多糖含量很高，苦丁茶的甜味，很可能與苦丁茶中含有的大量可溶性多糖有關(guān)。也是因?yàn)橛羞@些多糖的存在，使得苦丁茶有抗衰老、抗氧化、降血糖等作用。</p><p>　　苦丁茶已經(jīng)不是人們?nèi)粘Ｉ钪兴斫獾牟枇?，它的化學(xué)組成與普通的茶有著巨大的差異，正是由于這些差異使得苦丁茶有著與一般普通的茶葉所不具有的巨大藥用功效和開發(fā)利用價(jià)值。</p>&l

21、t;p>　　1.3熊果酸的結(jié)構(gòu)及藥理作用</p><p>　　1.3.1熊果酸的結(jié)構(gòu)與來源</p><p>　　熊果酸，別名又叫做烏索酸，烏蘇酸。分子式為C30H48O3,分子量 456.68。高純度的熊果酸是具有光澤的棱柱狀(在無水乙醇中結(jié)晶)或細(xì)毛樣針狀（在稀乙醇中結(jié)晶），低純度的為棕黃色或黃綠色粉末，含有特殊的氣味，熔點(diǎn)283～288℃。易溶于甲醇，乙醇，丙酮，吡啶中，不溶于水

22、和石油醚中。熊果酸是以游離形式或者苷糖的形式分布于植物中。這些植物主要有木犀科植物女貞葉，薔薇科植物枇杷葉和山楂，玄參科植物毛泡桐葉，唇形科植物夏枯草的全草和冬青科植物苦丁茶枸骨葉等。 </p><p>　　1.3.2熊果酸的藥理作用</p><p><b>　?。?）保肝作用</b></p><p>　　臨床研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)熊果酸對CC1引起的大

23、鼠肝毒性具有明顯的保護(hù)作用，用熊果酸處理后大鼠肝細(xì)胞的成活率大大提高。而且熊果酸能夠有效降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血清轉(zhuǎn)氨酶的含量，具有抗纖維化和恢復(fù)肝功能的作用，并且見效快而穩(wěn)定。</p><p><b>　?。?）抗腫瘤作用</b></p><p>　　經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸不僅能夠明顯對抗致癌物質(zhì)誘發(fā)的細(xì)胞癌變，而且對惡性的腫瘤細(xì)胞如L-1210白血病細(xì)胞、A-549人肺腺癌

24、細(xì)胞等有明顯的抑制作用。能夠使小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著提高，能抑制TSCCa 細(xì)胞增殖，并且能夠?qū)PA有抑制作用。熊果酸還具有抗血管生成作用，能夠控制腫瘤的生長，降低細(xì)胞的生存能力。并且體內(nèi)試驗(yàn)多次證明熊果酸可以明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。以上均可說明熊果酸的抗腫瘤作用十分廣泛，極有可能成為一種新型的低毒并且高效的抗癌藥物。</p><p><b>　?。?）抗氧化作用</b></p&g

25、t;<p>　　多項(xiàng)研究表明，活性氧自由基與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系。過量產(chǎn)生的活性氧使得DNA鏈斷裂、堿基的氧化以及缺失、蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)，使得致癌因子的活化，腫瘤的發(fā)生。熊果酸是一種強(qiáng)的抗氧化劑，能夠明顯的捕捉O2，降低腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。因?yàn)樾芄嵝再|(zhì)穩(wěn)定，又有良好的觸摸感，因此在美容護(hù)膚品中有著廣泛的應(yīng)用。熊果酸的抗氧化作用有效地對抗了人體的衰老、皮膚祛斑以及色素沉積。</p><p>　?。?）

26、降血脂、降血糖的作用</p><p>　　經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸有效地降低了家兔和小鼠的血膽固醇和B- 脂蛋白的含量，表明熊果酸具有降血脂、抗動脈粥樣硬化的作用。熊果酸能改善血脂異常引起的多種癥狀，如肝腎陰虛、耳鳴、口干、少寢等，效果顯著。</p><p>　　（5）抗艾滋病的作用</p><p>　　艾滋病的致病因子是人體免疫缺陷病毒 (HIV)。臨床試驗(yàn)表明熊果酸能

27、夠抑制HIV-1蛋白酶的活性，它主要是通過抑制HIV-1蛋白酶的聚合作用來抑制HIV-1蛋白酶的活性。</p><p><b>　?。?）其它作用</b></p><p>　　熊果酸除上述作用外，還具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗?jié)儭㈡?zhèn)靜安定的作用和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。</p><p>　　1.4熊果酸的提取及純化方法</p>&

28、lt;p>　　1.4.1熊果酸的主要提取方法</p><p>　　熊果酸的分離純化工作開始得較早，卻都存在著工藝流程長、收率較低的缺點(diǎn)。但是通過近幾年的研究，熊果酸的分離得到了很大的改進(jìn)，分離時(shí)間大大縮短，收率顯著提高。目前國內(nèi)外熊果酸的主要提取方法有回流提取法、連續(xù)提取法、超聲波提取法、微波提取法、滲漉提取法等。</p><p><b>　?。?）回流提取法</b&

29、gt;</p><p>　　回流提取法是用有機(jī)溶劑加熱提取，為避免溶劑揮發(fā)造成損失，需采用加熱回流裝置。在水浴中加熱回流，經(jīng)過2.5小時(shí)的微沸后減壓過濾，再在藥渣中加溶劑，進(jìn)行多次的回流，直到有效成分全部提盡為止。連續(xù)提取法在回流提取法的基礎(chǔ)上，彌補(bǔ)了回流提取法的不足。溶劑量不需要很大，操作也較為簡單。但是存在著提取液受熱時(shí)間長的缺點(diǎn)，對一些受熱時(shí)間長易分解的物質(zhì)不宜采用此方法。回流提取法和連續(xù)提取法在熊果酸的提

30、取工藝中用的比較多。并且大多采用乙醇溶劑，因?yàn)橐掖既軇┡c別的溶劑相比更為安全環(huán)保。</p><p><b>　?。?）超聲波提取法</b></p><p>　　超聲波提取是利用超聲波加強(qiáng)了物質(zhì)分子的運(yùn)動速度，使得溶劑的穿透力增強(qiáng)，提高了原料的溶出速度和溶出次數(shù)，縮短了提取時(shí)間。該提取方法效率高、提取時(shí)間短、提取溫度低、適應(yīng)性廣、操作簡單。</p><

31、;p><b>　?。?）微波提取法</b></p><p>　　微波提取法利用的是微波輻射，藥材通過吸收微波能，溫度上升后細(xì)胞膨脹破裂，有效成分滲出，利于提取的進(jìn)行，并且浸出速率的增加還提高了提取的效率。微波提取法有選擇性高，對有效成分破壞小、溶劑用量少、無污染等優(yōu)點(diǎn)。但在苦丁茶中熊果酸提取中還未見此方法。</p><p><b>　?。?）滲漉提取法

32、</b></p><p>　　滲漉提取是一種將提取原料裝在滲漉容器中，利用不斷添加的新溶劑，自上而下從滲漉器的下部流出浸出液的方法。當(dāng)原料滲進(jìn)溶劑中，滲出比重大的溶劑將與滲出比重小的溶劑置換位置，形成濃度差，使擴(kuò)散能夠順利進(jìn)行?？刂屏魉偈乖现械挠行С煞殖浞痔崛〕鰜頌橹?。研究員使用該方法用苯做溶劑成功的從長春花中提取到了熊果酸，只是該方法消耗的苯含量較大，在分離熊果酸的過程中中易殘留苯而影響品質(zhì)。&l

33、t;/p><p>　　1.4.2熊果酸的主要純化方法</p><p>　　熊果酸的主要純化方法即對熊果酸粗品進(jìn)行進(jìn)一步的分離、除雜、精制，主要有兩相溶劑萃取法、沉淀法、重結(jié)晶法、皂苷水解法、柱層析法。</p><p><b>　　（1）溶劑萃取法</b></p><p>　　兩相溶劑萃取法用氯仿、乙醚等作為溶劑。而系統(tǒng)溶劑萃

34、取法一般用石油醚或正己烷脫除親脂性雜質(zhì)，即進(jìn)行分布萃取。</p><p><b>　?。?）沉淀法</b></p><p>　　沉淀法主要有鉛鹽沉淀法、試劑沉淀法、酸堿沉淀法。鉛鹽沉淀法用醋酸鉛在水中或醇溶液中與中草藥成分生成難溶的鉛鹽沉淀。試劑沉淀是加入生物堿沉淀試劑，使得不溶物析出的方法。在熊果酸的分離研究中用到最多的就是酸堿沉淀法，它是利用每種物質(zhì)具有不同的酸堿

35、性，通過調(diào)節(jié)溶液的酸堿性使某一物質(zhì)沉淀出來。此辦法具有處理簡單，乙醇可回收利用等優(yōu)點(diǎn)。</p><p><b>　　（3）重結(jié)晶法</b></p><p>　　熊果酸產(chǎn)品通?？稍诩状?、乙醇中重結(jié)晶得到。重結(jié)晶是利用中草藥中化學(xué)物質(zhì)在常溫下是固體，根據(jù)不用物質(zhì)有不同的溶解度達(dá)到分離精制的目的。</p><p><b>　?。?）皂苷水解

36、法</b></p><p>　　皂苷水解法是用乙醇為溶劑進(jìn)行回流提取，石油醚用來脫脂去雜質(zhì)，用正丁醇萃取皂苷，鹽酸溶液水解皂苷，再在無水乙醇與甲醇比為1：1的溶液中重結(jié)晶，得到熊果酸晶體。但是水解法也存在著不足，由于皂苷所含的糖為2—羥基糖，在水解中會發(fā)生很多副反應(yīng)，例如脫水、取代基位移和構(gòu)型轉(zhuǎn)變等。因此，水解條件的選取是關(guān)鍵。目前研究工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)正是如何用氧化降解法、光解法等溫和的水解方法純化熊

37、果酸。</p><p><b>　?。?）柱層析法</b></p><p>　　柱層析法中的硅膠層析法是分離熊果酸的最佳方法，但由于硅膠柱有自身的弱點(diǎn)，工業(yè)化生產(chǎn)困難。</p><p>　　1.4.3熊果酸的測定方法 </p><p>　　目前測定熊果酸的測定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、薄層法。</p&g

38、t;<p><b>　?。?）分光光度法</b></p><p>　　分光光度法是一種快速便捷的檢測方法，以香草醛—高氯酸為顯色試劑，目前認(rèn)為主要的顯色原理是羥基脫水后，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，經(jīng)雙鍵位移或者是雙分子縮合反應(yīng)生成共軛雙烯，然后在酸的作用下形成碳陽離子鹽而顯色。若用香草醛—高氯酸試劑作為顯色劑，必須注意顯色劑的用量、顯色的時(shí)間、顯色的溫度、測定的波長、顯色穩(wěn)定等因素。因此必

39、須注意容器的干燥，因?yàn)樗謱y定結(jié)果有很大的干擾。揮去熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑時(shí)溫度不能太高，不然熊果酸氧化。5%香草醛—冰醋酸溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，放置太久，香草醛易被氧化。香草醛及冰醋酸易揮發(fā)，顯色的操作要迅速。三萜類化合物具有相同的顯色基團(tuán)，因此用比色分析只能得到三萜類物質(zhì)的總量。</p><p>　?。?）高效液相色譜法</p><p>　　高效液相色譜測定熊果酸的分離具有眾多優(yōu)點(diǎn)。但由于

40、昂貴的色譜柱填料，阻礙了它的廣泛應(yīng)用。用高效液相色譜法測定熊果酸含量，固定相為C18，流動相以甲醇—水體系為主。甲醇與水的比例從80:20-97:3不等。檢測熊果酸用高效液相色譜大多使用紫外檢測器。一般選擇215nm-220nm為熊果酸的最佳檢測波長。熊果酸的色譜分析測定還有其它的方法，有毛細(xì)管膠束電動色譜法，該方法已測定了夏枯草中熊果酸的含量，也有用衍生化氣相色譜。</p><p><b>　　（3）

41、薄層法</b></p><p>　　薄層法是分離檢測植物提取物中熊果酸的重要方法之一。其分析檢測比高效液相色譜更為完善。薄層法具有分離和分析雙重功能。運(yùn)用的關(guān)鍵在于對照品的選擇、樣品液的制備以及展開劑的選擇。在樣品溶液制備時(shí)選擇乙醚為萃取溶劑，之后將萃取劑減壓濃縮，再用石油醚浸泡殘?jiān)詈笥梅菢O性的有機(jī)溶劑溶解定容。對于展開劑，要求的是能夠突出主要斑點(diǎn)，多數(shù)以多元弱極性混合展開劑為主，硼酸或冰醋酸的加

42、入很好地解決了斑點(diǎn)拖尾這一現(xiàn)象。研究者們還采用乙酸乙酯溶液為展開劑的其中一個(gè)組分。因?yàn)橐宜嵋阴僦械葮O性，它的加入能夠有效地調(diào)節(jié)展開劑的極性，熊果酸的分離因此會更為有效。而顯色劑一般選用2%—10%的硫酸乙醇溶液。</p><p>　　1.5苦丁茶中熊果酸的開發(fā)現(xiàn)狀</p><p>　　苦丁茶中的熊果酸含量最高，苦丁茶是一種無毒的物質(zhì)，因此將苦丁茶用作提取熊果酸的原料既安全又高效。我國苦丁

43、茶資源豐富。但我國苦丁茶存在嚴(yán)重的異物同名和同物異名現(xiàn)象，目前至少發(fā)現(xiàn)有12科23個(gè)屬的植物作為苦丁茶飲用。主要有冬青科、木樨科、金絲桃科、紫草科等。而苦丁茶的研究以冬青科研究最多，而且也最具有影響力。其他科的苦丁茶不論是在飲用價(jià)值還是在藥用價(jià)值方面，影響都較小。在冬青科植物中，被稱為“苦丁茶”并廣為使用的植物主要有枸骨葉、大葉冬青、苦丁茶冬青、五棱冬青以及霍山冬青?？喽〔柚行芄岬热扑岬拈_發(fā)利用還未見相關(guān)報(bào)道。針對熊果酸的眾多生物學(xué)

44、作用和我國苦丁茶豐富的資源，對苦丁茶更為深層次的研究將有很重要的意義。</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器</p><p><b>　　（1）藥品 </b></p><p>　　熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度：HPLC≥98%</

45、p><p>　　香草醛 分析純</p><p>　　高氯酸 分析純</p><p>　　無水乙醇 分析純</p><p>　　95%乙醇 分析純</p><p>　　冰醋酸

46、 分析純</p><p>　　大葉冬青苦丁茶 產(chǎn)地：安徽</p><p><b>　　（2）儀器 </b></p><p>　　CDEL-23D多功能粉碎機(jī)(上海京達(dá)電器制造公司)DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）</p><p>　　RE-5003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州南北儀器

47、設(shè)備有限公司）WT1002Y 電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)</p><p>　　分析天平(常州萬泰天平儀器有限公司)</p><p>　　22E型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）</p><p>　　圓底燒瓶、球形冷凝管、燒杯、膠頭滴、量筒（100ml）、容量瓶(10ml,25ml,50ml,100ml)、蒸發(fā)燒瓶、布氏漏斗、抽濾瓶、真空泵、濾紙&l

48、t;/p><p>　　2.2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)說明</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選用大葉冬青苦丁茶為原料，采用對環(huán)境友好的乙醇為提取溶劑，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。用回流提取法?；亓魈崛》ㄋ枰娜軇┝坎皇呛艽?，操作也較為簡單、安全。但是存在著提取液受熱時(shí)間長的缺點(diǎn)，而熊果酸在所需加熱條件下是不會分解的，因此選用回流提取法。在具體操作上，安排正交實(shí)驗(yàn)以乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，設(shè)計(jì)安排1

49、6組實(shí)驗(yàn)，提取次數(shù)統(tǒng)一為2次，得出最佳提取工藝條件。在查閱了大量的文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，熊果酸的分析大都采用高效液相色譜法和薄層掃描色譜法，本文采用分光光度法，為那些不具備昂貴的高效液相色譜儀和薄層掃描法色譜的單位和個(gè)人提供了一種檢測方法。</p><p><b>　　2.3實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　　2.3.1對照品溶液的制備</p><p>

50、;　　稱取熊果酸對照品5.0 mg于50 ml 容量瓶中，加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。得濃度為0.1 mg/ml 對照品溶液。</p><p>　　2.3.2測定波長的確定</p><p>　　準(zhǔn)確吸取對照品溶液0.4 ml，分別置于10 ml容量瓶中，將容量瓶放入70℃熱水浴鍋揮干乙醇，加人5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml、高氯酸0.8 ml，放人60℃熱水浴中加熱15min

51、，放冷至室溫，用冰醋酸定容至刻度，搖勻，與波長400-600 nm間掃描。得最大波長是548 nm。</p><p><b>　　2.4熊果酸的提取</b></p><p>　　2.4.1樣品溶液的制備</p><p>　　選用大葉冬青苦丁茶粉碎，取5.00 g置于圓底燒瓶中，加入70%的乙醇溶液35ml，在85℃水浴回流2小時(shí)，減壓抽濾，濾渣

52、按上述條件重復(fù)提取共2次。合并濾液，減壓回收乙醇，殘留物放冷至室溫后用無水乙醇溶解并定容至100 ml，準(zhǔn)確吸取5 ml于25 ml容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度， 制得供試品溶液。</p><p>　　2.4.2測定吸光度 </p><p>　　取供試品溶液1ml于10 ml容量瓶中，將容量瓶放入70℃熱水浴鍋中揮干乙醇，加人5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 ml，放人

53、60 ℃熱水浴中加熱15 min, 放冷至室溫，用冰醋酸定容至刻度，搖勻。在波長548nm 處測定吸收值。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備</p><p>　　準(zhǔn)確吸取對照溶液0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0ml 分別置于10 mL 容量瓶中，將容

54、量瓶放入70℃熱水浴鍋揮干乙醇，加人5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml、高氯酸0.8 ml。放人60℃熱水浴中加熱l5 min，放冷至室溫，用冰醋酸定容至刻度, 搖勻。以未加對照品的比色液做空白，在波長548 nm 處測定吸收值，結(jié)果見表3-1。 </p><p>　　表3-1不同熊果酸含量的吸光值</p><p>　　以熊果酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作圖得到校準(zhǔn)曲線。其回歸方程

55、為y = 8.65x+ 0.0545，R2= 0.9919，結(jié)果表明，熊果酸在0.002-0.010mg/mL 范圍內(nèi)，熊果酸的濃度與其吸光值呈良好的線性關(guān)系。如圖3-1.</p><p>　　圖3-1熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　3.2提取工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)</p><p>　　3.2.1乙醇濃度對熊果酸提取率的影響</p><p>

56、;　　稱取5.00 g苦丁茶粉末6份置于圓底燒瓶中，分別加入乙醇濃度分別為20%、40%、60%、80%、90%、100%的溶液60 ml，在90℃水浴中分別回流2次，每次2小時(shí)，減壓抽濾兩次提取液，測定并計(jì)算在不同條件下熊果酸的提取率。結(jié)果如圖3-2。</p><p>　　圖3-2乙醇濃度對熊果酸提取率的影響</p><p>　　圖3-2反映了乙醇濃度對熊果酸提取率的影響規(guī)律。當(dāng)乙醇濃度

57、小于60%時(shí)，提取率很小。隨著加入的乙醇濃度的增加，提取率逐漸增加，加入的乙醇濃度達(dá)到80%后，提取率開始出現(xiàn)較大值，并隨著濃度的增加繼續(xù)提高。這是由于熊果酸是很弱的極性分子，溶于乙醇，不容易于水。根據(jù)相似相溶的原理，溶液中乙醇所占的含量越多，熊果酸越容易溶解在該種溶液中。因此，熊果酸的溶解率隨著溶劑中乙醇含量的增多而增大。工業(yè)中乙醇的濃度受到限制，因此選用85%-95%的乙醇提取熊果酸。</p><p>　　3

58、.2.2液料比對熊果酸提取率的影響</p><p>　　稱取5.00 g苦丁茶粉末6份置于圓底燒瓶中，分別加入25 ml、30 ml、35 ml、40 ml、50 ml、60 ml乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%的溶液，在90℃水浴中分別回流2次，每次2小時(shí)，減壓抽濾兩次提取液，測定并計(jì)算在不同條件下熊果酸的提取率。結(jié)果如圖3-3。</p><p>　　圖3-3液料比對熊果酸提取率的影響</p&

59、gt;<p>　　圖3-3反映了液料比對熊果酸提取率的影響規(guī)律。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)液料比小于7時(shí)，提取率相對較低，隨著液料比的增加，提取率增加迅速，達(dá)到7時(shí)，開始出現(xiàn)較大值，但當(dāng)料液比大于7以后，提取率增加趨勢變緩。因此選用的液料比應(yīng)大于7。</p><p>　　3.2.3提取時(shí)間對熊果酸提取率的影響</p><p>　　稱取5.00 g苦丁茶粉末，加入60ml乙醇體積分?jǐn)?shù)為

60、90%的溶液，在90℃水浴中每隔30 min取樣一次，每次取2 ml。測定并計(jì)算在不同條件下熊果酸的提取率。結(jié)果如圖3-4。</p><p>　　圖3-4提取時(shí)間對熊果酸提取率的影響</p><p>　　圖3-4反映了提取時(shí)間對熊果酸提取率的影響規(guī)律。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)提取時(shí)間少于60 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，提取率增加迅速；在90 min時(shí)，出現(xiàn)一個(gè)較高的提取值，但當(dāng)提取時(shí)間超過9

61、0 min后，提取率的增加趨勢變緩。為了使得熊果酸不因長的提取時(shí)間發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，故提取時(shí)間應(yīng)盡量縮小。</p><p>　　3.2.4提取溫度對熊果酸提取率的影響</p><p>　　稱取5.00g苦丁茶粉末6份置于圓底燒瓶中，分別加入60 ml乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%的溶液，各在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中分別回流2次，每次2小時(shí)，減壓抽濾兩次提取液，測定并計(jì)算在不

62、同條件下熊果酸的提取率。結(jié)果如圖3-5。</p><p>　　圖3-5提取溫度對熊果酸提取率的影響</p><p>　　圖3-5反映了提取溫度對熊果酸提取率的影響規(guī)律。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提高提取溫度有利于熊果酸的提取，并且當(dāng)提取溫度達(dá)到90℃左右時(shí)，熊果酸的提取率達(dá)到最大。之后隨著溫度的升高提取率反而減小，主要原因應(yīng)該是由于熊果酸在高溫下被氧化。所以提取溫度應(yīng)控制在90℃左右。</p&

63、gt;<p>　　3.2.5提取次數(shù)對熊果酸提取率的影響</p><p>　　稱取5.00 g苦丁茶粉末6份置于圓底燒瓶中，分別加入60 ml乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%的溶液，各在90℃水浴中分別回流1次、2次、3次、4次，每次2小時(shí)，減壓抽濾兩次提取液，測定并計(jì)算在不同條件下熊果酸的提取率。結(jié)果如圖3-6。</p><p>　　圖3-6提取次數(shù)對熊果酸提取率的影響</p&g

64、t;<p>　　圖3-6反映了提取次數(shù)對熊果酸提取率的影響規(guī)律。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著提取次數(shù)的增加提取率增大。但當(dāng)提取次數(shù)超過3次后，提取率的增加明顯減小。因此提取次數(shù)應(yīng)根據(jù)其它條件選擇2~3次。</p><p><b>　　3.3可行性研究</b></p><p>　　3.3.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　取對照品溶液及供試

65、品溶液1.0 ml 左右, 同上述方法制備比色液后每間隔10 min 在548 nm處測定吸光值。結(jié)果見表3-2。</p><p><b>　　表3-2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　3.3.2精密度實(shí)驗(yàn)</p><p>　　取提取好的樣品溶液，進(jìn)行6 次平行試驗(yàn)，測定吸光度。結(jié)果見表3-3。</p><p>&

66、lt;b>　　表3-3精密度實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　3.3.3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　準(zhǔn)確稱取同一批苦丁茶粗粉5 份，每份約5 g，按上述樣品溶液的制備方法制備并測定吸光度。</p><p><b>　　結(jié)果見表3-4。</b></p><p><b>　　表3-4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

67、</b></p><p>　　3.3.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)</p><p>　　準(zhǔn)確稱取5 g苦丁茶粉末5份，加入5 ml熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，按上述樣品溶液制備方法制備并測定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3-5。</p><p>　　表3-5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)</p><p><b>　　3.4正交實(shí)驗(yàn)安排</b><

68、/p><p>　　由單因素實(shí)驗(yàn)可知，乙醇的體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)均影響著熊果酸的提取率。由于在實(shí)際生產(chǎn)過程中，不可能進(jìn)行多次提取，而且提取次數(shù)大于3后，提取率基本不變，故在正交實(shí)驗(yàn)中提取率一律選取2次。選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素應(yīng)用L16 (45) 正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)。正交因素水平表見表3-6所示。</p><p>　　提取率%=[(C

69、15;n×V)÷W] ×100%(C為熊果酸濃度mg/ml，n是稀釋倍數(shù)，V是溶液體積，W為苦丁茶質(zhì)量g)</p><p>　　表3-6正交因素與水平表</p><p>　　按表3-6安排進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表3-7。</p><p><b>　　表3-7正交實(shí)驗(yàn)表</b></p>

70、<p>　　由表3-7可知：從極值R來看，因素的主次順序?yàn)锳CBD，乙醇的體積分?jǐn)?shù)是最為顯著的影響因素。提取溫度的影響最不顯著，可能是由于當(dāng)溫度高于85℃后，提取液始終處于微沸的狀態(tài)下。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與單因素實(shí)驗(yàn)一致。通過比較k值可得各因素的最優(yōu)水平為A4B4C2D1，即乙醇的體積分?jǐn)?shù)為95%，液料比為14：1，提取時(shí)間為2.5個(gè)小時(shí)，提取溫度85℃，提取次數(shù)2次，浸出率達(dá)最大值1.2102%。</p><

71、p><b>　　3.5結(jié)論</b></p><p>　　本文研究了大葉冬青苦丁茶中熊果酸用回流提取法最佳的提取工藝，考察了不同溫度、時(shí)間、液料比和乙醇的體積分?jǐn)?shù)對熊果酸提取的影響，其結(jié)論如下：</p><p>　　1）通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件為：在85℃水浴鍋中，以體積分?jǐn)?shù)為95%的水溶液為提取溶劑，提取2.5小時(shí)，提取2次，浸出率可達(dá)1.21

72、02%。</p><p>　　2）熊果酸為五環(huán)三萜類化合物，溶于甲醇、乙醇、丁醇、略溶于丙酮, 微溶于苯、氯仿、乙醚, 不溶于水和石油醚?？紤]到成本和試劑的安全性，選用乙醇較適宜, 故本實(shí)驗(yàn)選用乙醇。</p><p>　　3）回流提取法所需要的溶劑量不是很大，操作也較為簡單、安全。但是存在著提取液受熱時(shí)間長的缺點(diǎn)，選擇提取時(shí)間為2.5小時(shí)，提取率較高。選用回流提取法可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。<

73、;/p><p>　　4）分光光度法測定苦丁茶中熊果酸的含量，操作快捷簡便，并且重現(xiàn)性、精密度、回收率好，對照品和樣品溶液在1h內(nèi)穩(wěn)定性卻不是太樂觀，這跟香草醛和冰醋酸易揮發(fā)有關(guān)，因此顯色反應(yīng)一定要迅速。</p><p>　　5）從大葉冬青苦丁茶中提取到的熊果酸的含量明顯要高于其它科屬苦丁茶，安徽產(chǎn)的大葉冬青苦丁茶中有高含量的熊果酸，這使得安徽產(chǎn)的大葉冬青苦丁茶也可以作為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)熊果酸的原料，

74、為熊果酸的開發(fā)提供了新的原料。</p><p>　　6）根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，苦丁茶中熊果酸是含量最多的一種三萜類化合物。由于熊果酸與其他三萜類化合物的分子結(jié)構(gòu)相似，因此用分光光度法只能粗略地估算熊果酸的含量，若想要較為精確地測定苦丁茶中熊果酸的含量，就需要使用高效液相色譜法進(jìn)一步分析。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p&g

75、t;　　苦丁茶作為我國南部及西南地區(qū)民間傳統(tǒng)的藥用植物，具有悠久的歷史，其茶湯具有清熱解毒、殺菌消炎、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智和抗輻射、抗衰老、活血脈、調(diào)血脂、降血壓等功效；特別是大葉冬青苦丁茶中含有較高含量的熊果酸，因此以后的研究多可在大葉冬青苦丁茶中進(jìn)行。而熊果酸所具有多種的藥理作用，使得苦丁茶的臨床前景非常樂觀，作為新型保健藥的開發(fā)具有十分廣闊的前景。</p><p><b&g

76、t;　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 李國章,于華忠,卜曉英,曹庸,饒力群.分光光度法測定湘產(chǎn)苦丁茶中熊果酸含量[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2006,23(2):401-404.</p><p>　　[2] 任秀蓮,周春山,魏琦峰,肖建波,雷啟福,湯小勝.苦丁茶中熊果酸的分離純化研究[J].中國藥學(xué)雜志,2004,39(8):571-574.</p>&

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