綿羊皮膚unigene數(shù)據(jù)庫(kù)及其功能分析

1、<p>　　綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)及其功能分析</p><p>　　張文廣1，2 3，張燕軍1，高愛(ài)琴1 3，吳江鴻1，3，常子麗1，2，武瑞兵1，麗春1，李金泉1 3,*</p><p>　　1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，呼和浩特，010018</p><p>　　2內(nèi)蒙古ATCG生物信息研究所，呼和浩特，010020</p>

2、<p>　　3內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特, 010020</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　為了輔助羊毛性狀的分子機(jī)理研究，以期找到控制羊毛性狀的基因，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)和內(nèi)蒙古ATCG生物信息研究所對(duì)目前國(guó)際上發(fā)表的在綿羊皮膚中表達(dá)的基因作了系統(tǒng)總結(jié)，構(gòu)建了綿羊皮膚和毛囊相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫(kù)和透視分析工具。該

3、數(shù)據(jù)庫(kù)包含6360個(gè)UniGene及其對(duì)應(yīng)表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的超級(jí)鏈接和電子差異顯示分析。這一數(shù)據(jù)庫(kù)及其分析工具可以為深入研究毛嚢發(fā)生的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，幫助研究人員開(kāi)展綿羊皮膚毛囊相關(guān)候選基因的研究與產(chǎn)毛性狀QTL的關(guān)聯(lián)分析。</p><p>　　Bioinformatics pivotdata for UniGene analysis in wool sheep skin</p><p

4、>　　Zhang Wenguang1,2, Zhang Yanjun1, Gao Aiqin1, </p><p>　　Wu Jianghong1,2, Chang Zili1,2, Wu Ruibing1, Li Jinquan1,*</p><p>　　1 College of Animal Science and Medicine, Inner Mongolia Agricul

5、tural University, Hohhot, 010018</p><p>　　2 Institute of ATCG, Nei Mongol Bio-Information, Hohhot, 010020</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　The Bioinformatics group at t

6、he Inner Mongolia Agricultural University and Institute of ATCG, Nei Mongol Bio-Information is developing bioinformatics tools and resources for scientists engaged in gene analysis in fur-bearing animals. The pivotdata d

7、eveloped encompass both the UniGene database and the associated analytical tool required for differential expression profile of sheep skin. The pivotdata has now been fully implemented for sheep unigene data including 63

8、60 UniGene cluster. We have als</p><p>　　第一作者，張文廣（1973-），副教授，研究方向?yàn)椋瑒?dòng)物遺傳育種與生物信息學(xué)。Email： atcgnmbi@yahoo.com.cn。*通訊作者，李金泉（1957-），教授，研究方向?yàn)?，?dòng)物遺傳育種。電話(huà)：0471-4309195。</p><p>　　我國(guó)是個(gè)養(yǎng)羊大國(guó)，2005年我國(guó)存欄羊總數(shù)為3.73

9、億只，飼養(yǎng)量位居世界第一，其中綿羊17.4億只，占總數(shù)的46.66%[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外毛紡產(chǎn)品已經(jīng)向輕薄、柔軟、挺括、高檔方向發(fā)展，世界羊毛生產(chǎn)及貿(mào)易突出的變化是超細(xì)型羊毛需求增加。因此，加快超細(xì)細(xì)毛羊品種選育是世界細(xì)毛羊育種工作的重點(diǎn)。綿羊大多數(shù)產(chǎn)毛經(jīng)濟(jì)性狀都是中度遺傳的，長(zhǎng)期以來(lái)，人們培育了數(shù)以百計(jì)的品種和品系。常規(guī)育種的遺傳進(jìn)展進(jìn)展緩慢，一般不足5%。人類(lèi)基因組和動(dòng)物基因組研究的新成果不斷激發(fā)廣大畜牧科學(xué)工作者嘗試通過(guò)標(biāo)記輔助

10、選擇來(lái)提高遺傳改良的速度，甚至完全寄希望于分子育種。因?yàn)槔碚撋侠梅肿佑N方法培育品種只需要較少的世代就可以完成，比如2~5代就可育成一個(gè)新品種。雖然家畜的數(shù)量性狀是由微效多基因和一些效應(yīng)較大的所謂主效基因共同決定的，但是人們?nèi)匀豢释瞥苫蛟\斷試劑盒，期望通過(guò)對(duì)個(gè)別主效基因的選擇就可起到準(zhǔn)確選擇種畜的效果。雖然這個(gè)夢(mèng)想還有許多理論和實(shí)踐問(wèn)題需要解決[2]，也有在基因組掃描和侯選基因方面的研究論文不斷發(fā)表，但是，我們必須清醒地認(rèn)識(shí)到人們

11、還沒(méi)有找到有效的主效基因用于數(shù)量性狀的分子育種[3]。因此，探討數(shù)量</p><p>　　為了進(jìn)一步輔助羊毛性狀的分子機(jī)理研究，以期找到控制羊毛細(xì)度的基因位點(diǎn)或者QTL，為細(xì)毛羊的遺傳育種提供理論基礎(chǔ)，急需對(duì)目前國(guó)際上發(fā)表的有關(guān)羊毛性狀發(fā)生和生長(zhǎng)中的相關(guān)基因作一系統(tǒng)總結(jié)，從而為基因芯片設(shè)計(jì)和候選基因篩選提供生物信息學(xué)支撐.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)和內(nèi)蒙古ATCG生物信息研究所對(duì)不同部位綿羊皮膚表達(dá)序列標(biāo)簽的研究揭示了體側(cè)部

12、綿羊毛生長(zhǎng)相關(guān)的部分基因[4]，該研究結(jié)果與國(guó)際上已經(jīng)發(fā)表的綿羊皮膚毛囊發(fā)育和皮膚cDNA文庫(kù)的成果相結(jié)合，構(gòu)建了綿羊皮膚和毛囊相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫(kù)和透視分析工具。該數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具可以幫助研究人員開(kāi)展綿羊皮膚毛囊相關(guān)的基因表達(dá)與系統(tǒng)生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)研究。</p><p><b>　　1、數(shù)據(jù)來(lái)源</b></p><p>　　表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequenc

13、e tag, EST)是一個(gè)基因的部分轉(zhuǎn)錄片段，通過(guò)構(gòu)建EST文庫(kù)可以較大規(guī)模地獲得基因表達(dá)信息。因此EST策略是各物種基因組研究的主要方法，廣泛應(yīng)用于基因的預(yù)測(cè)、表達(dá)圖譜的構(gòu)建、芯片及差異表達(dá)的研究[5]，但是通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法獲取EST費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不僅受到通量和規(guī)模上的限制，更受到特定樣本的制約，故難以全面反映相應(yīng)組織基因表達(dá)的整體情況。與此相比，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)dbEST中收錄的EST，涉及了各國(guó)科學(xué)家對(duì)各

14、組織及器官、不同生理狀態(tài)以及不同發(fā)育階段的研究結(jié)果，為研究提供了龐大而相對(duì)可靠的數(shù)據(jù)。NCBI UniGene則是一個(gè)將dbEST的序列進(jìn)行聚類(lèi)的數(shù)據(jù)庫(kù)，代表同一基因的不同EST被歸入同一UniGene，故一個(gè)UniGene可以近似代表一個(gè)基因。UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了對(duì)基因的描述、基因代碼、染色體定位等注釋信息，為大規(guī)模地研究基因表達(dá)提供了支持[6]。對(duì)這些數(shù)據(jù)庫(kù)的整理和挖掘，將為毛囊生物學(xué)研究帶來(lái)新思路、新信息[5]。作者利用M

15、S-EXCEL VBA宏程序開(kāi)發(fā)了程序包，建立了利用EST構(gòu)建綿羊皮膚基</p><p>　　登陸NCBI dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)(2007-12-20)，查找綿羊皮膚組織EST，以FASTA格式保存于本地計(jì)算機(jī)。登陸NCBI UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)(2007-12-20)FTP下載綿羊UniGene，保存于本地計(jì)算機(jī)[6]。分析在綿羊皮膚中表達(dá)的31833條EST，整理后共得到25792條高質(zhì)量EST可歸入U(xiǎn)niGen

16、e，這些EST歸并入6360個(gè)非冗余UniGene，占已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的綿羊UniGene（12286）的51.8%。這些UniGene在綿羊皮膚的各種EST庫(kù)中共出現(xiàn)11917次，平均出現(xiàn)1.8次。根據(jù)25792條EST統(tǒng)計(jì)，其中表達(dá)次數(shù)少于5次 的UniGene有5523個(gè)，占86.8%，而表達(dá)次數(shù)超過(guò)100次的只有17個(gè)UniGene（圖1）。</p><p>　　圖1 綿羊皮膚中UniGene的表達(dá)頻數(shù)及其分布&

17、lt;/p><p><b>　　2、表達(dá)譜比較</b></p><p>　　根據(jù)對(duì)12個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的EST庫(kù)分析歸類(lèi)了6360個(gè)非冗余基因，為分析綿羊正常皮膚組織的基因表達(dá)譜奠定了基礎(chǔ)。該數(shù)據(jù)庫(kù)提供了每個(gè)UniGene的超鏈接，方便研究者根據(jù)需要快速檢索該基因。例如，現(xiàn)有的電子差異顯示(digital differential display, DDD)方法[6]可用

18、于差異基因的挖掘，獲得的數(shù)據(jù)涵蓋量大，較全面整體地反映了綿羊正常組織的基因表達(dá)情況，能夠?yàn)檠芯空咛峁┰摶蚬δ艿南嚓P(guān)信息（如圖2）。對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)的整理發(fā)掘?qū)⑹墙窈笱芯康闹攸c(diǎn)和熱點(diǎn)。研究者可以隨時(shí)添加新的EST數(shù)據(jù)，能在較短的時(shí)間內(nèi)完成數(shù)據(jù)分析工作。由于該數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)EXCEL版本的本地化的EST分析工具，具有廣泛適用性。該工具可以快速準(zhǔn)確地鏈接NCBI的數(shù)據(jù)，分析特定組織或發(fā)育階段的基因表達(dá)譜，避免了手工逐條查找基因的繁瑣及保存信息的困難

19、。獲得的信息以Excel格式保存，便于數(shù)據(jù)的查找、比對(duì)、分類(lèi)與統(tǒng)計(jì)及后續(xù)的在線分析。同時(shí)該EXCEL透視表可通過(guò)簡(jiǎn)單修改來(lái)處理不同形式的分析，獲取不同的信息，不僅能從整體上分析特定基因表達(dá)的時(shí)空特征，而且還能為挖掘組織特異性基因提供有價(jià)值的參考。</p><p>　　圖2 根據(jù)EST計(jì)數(shù)獲得的UniGene組織表達(dá)譜</p><p>　　不同基因的組織表達(dá)譜也有很大差別，揭示在綿羊皮膚中特

20、異表達(dá)的基因十分必要。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的羊皮膚EST，獲得1254條在綿羊、山羊、小鼠和人中保守的同源基因（），這些“基因”在小鼠和人的各個(gè)組織中的均有不同程度表達(dá)（圖3和4），其中的1069和1139個(gè)基因分別在小鼠和人的皮膚中表達(dá)，反映了皮膚基因表達(dá)的共性。</p><p>　　圖3 1254個(gè)同源基因在小鼠各組織器官中的分布</p><p>　　圖4 1254個(gè)同源基因在人各組織

21、器官中的分布</p><p>　　由于人和小鼠的基因表達(dá)數(shù)據(jù)規(guī)模龐大，利用綿羊皮膚中表達(dá)的基因與人和小鼠的皮膚中表達(dá)的基因比較，可以挖掘保守的皮膚表達(dá)基因和差異表達(dá)基因，結(jié)果表明，在這四個(gè)物種中，有1023個(gè)基因均在四個(gè)物種的皮膚中表達(dá)，但是有69個(gè)基因只在綿羊和山羊的皮膚中表達(dá)（圖5）。對(duì)特異表達(dá)的69個(gè)基因的系統(tǒng)分析將有可能揭示羊絨毛生長(zhǎng)的部分分子機(jī)制。結(jié)合綿羊皮膚表達(dá)的UniGene數(shù)據(jù)，利用其中已知的皮膚

22、表達(dá)的基因序列，分析這些基因表達(dá)的特征對(duì)研究皮膚毛囊相關(guān)基因意義很大。CSIRO對(duì)1089個(gè)皮膚表達(dá)的EST的原位雜交結(jié)果表明，很大比例的EST在表達(dá)該基因的皮膚中沒(méi)有組織特異性。其中82%非特異表達(dá)，13%在毛球表達(dá)，4%集中在毛纖維表層（表1）。</p><p>　　圖5 1254個(gè)同源基因在綿羊、山羊、小鼠和人皮膚中的分布</p><p>　　表1皮膚EST組織原位雜交匯總<

23、/p><p>　?。ㄒ訡SIRO，2006年）</p><p><b>　　3、功能注釋</b></p><p>　　根據(jù)比較基因組學(xué)方法對(duì)6360個(gè)UniGene的分析結(jié)果，其中36.65%（2331個(gè)）的UniGene與已知的基因沒(méi)有同源序列。以人的GeneOntology為參考數(shù)據(jù)庫(kù)[7]，對(duì)綿羊皮膚表達(dá)的保守基因進(jìn)行Ontology分析，

24、結(jié)果表明，這些基因分別顯著（p<0.01）參與以下Ontology分類(lèi)，其中生物學(xué)過(guò)程包括：cellular process(P<0.01)，physiological process(P<0.01)；分子功能包括；binding(P<0.01)，catalytic activity( P<0.01) ，structural molecule activity( P<0.01)，transcripti

25、on regulator activity( P<0.01)，translation regulator activity( P<0.01)；細(xì)胞組分包括：cell( P<0.01)，cell part( P<0.01)，envelope( P<0.01)，membrane-enclosed lumen( P<0.01)，organelle( P<0.01)，or</p><

26、p>　　圖6 綿羊皮膚UniGene的功能分布圖</p><p><b>　　4、討論</b></p><p>　　4.1 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)及數(shù)據(jù)</p><p>　　EST是功能基因組研究的重要手段，隨著生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中EST的累積,將EST應(yīng)用</p><p>　　于生物學(xué)的研究成為又一熱點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)外研究人員

27、利用癌癥基因組解剖計(jì)劃(cancer genome anatomy project,CGAP)的EST數(shù)據(jù)庫(kù)[6]，構(gòu)建了腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌、卵巢癌等特定組織或疾病的基因表達(dá)譜。因此，建立基于NCBI dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)的本地化基因表達(dá)譜分析工具，為功能基因組學(xué)的研究提供了新思路、新方法。</p><p>　　生物學(xué)數(shù)據(jù)保存在大量的數(shù)據(jù)庫(kù)和文本文件中，一般的生物學(xué)研究者手工獲取和分析所</p><

28、;p>　　需的數(shù)據(jù)不但耗時(shí)耗力，更易導(dǎo)致錯(cuò)誤。同時(shí)由于各實(shí)驗(yàn)室獲得數(shù)據(jù)及存貯數(shù)據(jù)的方式不同，造成了在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取和比對(duì)數(shù)據(jù)的困難，故借助計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)提取或比較不同來(lái)源的數(shù)據(jù)成為分析生物學(xué)數(shù)據(jù)不可或缺的方法。EST FASTA格式文件和UniGene文件有固定格式，這就使得提取這兩個(gè)文件中匹配的信息構(gòu)建基因表達(dá)譜成為可能。我們構(gòu)建的綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)方便了研究人員的使用和基因分析。</p><p&

29、gt;　　4.2 綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用</p><p>　　綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是遺傳標(biāo)記與UniGene相結(jié)合，二是QTL分析與UniGene相結(jié)合。為了利用生物信息學(xué)方法篩選綿羊微衛(wèi)星標(biāo)記,可以利用SSRIT和SSRFinder等生物信息學(xué)軟件對(duì)綿羊UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)的6360個(gè)皮膚表達(dá)的UniGene進(jìn)行搜索，篩選綿羊EST-SSRs標(biāo)記，這一應(yīng)用對(duì)于綿羊

30、毛相關(guān)性狀的標(biāo)記輔助選擇具有重要應(yīng)用價(jià)值。或者結(jié)合已經(jīng)獲得的綿羊羊毛性狀的QTL區(qū)域分析結(jié)果，與UniGene的遺傳圖譜相關(guān)聯(lián)，可以把QTL的分辨率提高到UniGene水平，再利用侯選基因分析和遺傳學(xué)驗(yàn)證，可以把QTL發(fā)展成QTG，真正實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇。這兩個(gè)方面的應(yīng)用是該數(shù)據(jù)庫(kù)的主要優(yōu)點(diǎn)。</p><p>　　4.3 從綿羊皮膚UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)探討綿羊皮膚生物學(xué)的研究方向</p><p&

31、gt;　　羊毛的生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)過(guò)程。綿羊毛產(chǎn)量與皮膚表面積、毛纖維密度、毛纖維直徑的平方、毛纖維長(zhǎng)度成正比。根據(jù)Woolmark的統(tǒng)計(jì)，在影響羊毛價(jià)值的諸多因素中，羊毛纖維直徑的價(jià)值達(dá)到總價(jià)值的70%，羊毛強(qiáng)度占11%，羊毛長(zhǎng)度僅占5%。因此在美麗奴綿羊的選育中，根據(jù)不同的育種目標(biāo)，均給予毛纖維直徑較大的權(quán)重。綿羊毛生長(zhǎng)的生物學(xué)研究從19世紀(jì)50年代開(kāi)始，并且在細(xì)胞水平的發(fā)展過(guò)程被研究的相當(dāng)清楚[8]。提出了控制毛囊形成、毛囊密度

32、和成年動(dòng)物的毛囊與纖維特征的三個(gè)基礎(chǔ)理論：①羊毛毛囊之間的競(jìng)爭(zhēng)[4]；②一種生物化學(xué)模式形成機(jī)制（反應(yīng)—擴(kuò)散理論）；③皮膚的毛乳頭細(xì)胞的一個(gè)有限集合體的競(jìng)爭(zhēng)[7]。雖然這些理論還很不完善，但不管解釋是否正確，一種存在毛囊密度和纖維直徑之間的相互關(guān)系是清楚的，當(dāng)毛囊密度發(fā)生變化時(shí)這種相互關(guān)系發(fā)生改變。類(lèi)似的，在長(zhǎng)度生長(zhǎng)率（L）和纖維直徑（D）之間也存在某種相關(guān)性。一種動(dòng)物在一定的環(huán)境條件下，L/D或L/D2是一個(gè)近似的常數(shù)[8]。在羊毛生

33、長(zhǎng)的每一個(gè)重要成分之間都存在復(fù)雜的相互關(guān)系，仍然有許多生物學(xué)問(wèn)題需要解決。</p><p>　　為了提高綿羊毛價(jià)值和基礎(chǔ)研究的需要，研究者從毛的細(xì)微結(jié)構(gòu)、毛囊的生物學(xué)調(diào)控以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配等方面進(jìn)行了大量研究和總結(jié)。這些有價(jià)值的研究成果促進(jìn)了人們對(duì)影響羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量的主效基因和QTL的研究。研究者根據(jù)參考家系設(shè)計(jì)，確定了一些影響羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量的主效基因和QTL。雖然影響羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量的QTL的被逐步鑒定，比如用微衛(wèi)

34、星標(biāo)記發(fā)現(xiàn)在綿羊第3、6、7、25號(hào)染色體上有控制毛纖維各性狀的QTL[9]，但是標(biāo)記密度影響其選擇效率。由于用合適的標(biāo)記密度進(jìn)行基因組掃描的代價(jià)相當(dāng)高，在進(jìn)一步研究這些羊毛性狀QTL之前需要重新整理這些數(shù)據(jù)。有了數(shù)據(jù)庫(kù)中的UniGene數(shù)據(jù)，就可以針對(duì)落在某個(gè)QTL中的在皮膚中表達(dá)的UniGene來(lái)做遺傳測(cè)試，其代價(jià)也會(huì)大幅度降低。事實(shí)上，在應(yīng)用分子標(biāo)記和EST進(jìn)行遺傳分析之前，許多對(duì)羊毛性狀有重要影響的基因已經(jīng)通過(guò)他們?cè)诒硇蜕系臉O端

35、影響被鑒定出來(lái)，并且通過(guò)經(jīng)典雜交的驗(yàn)證。例如，羊毛的色素沉著方式被許多基因所影響，其中最重要的就是Agouti位點(diǎn)(ASIP)；影響纖維質(zhì)量最重要的基因是和毛髓有關(guān)的N-type基因，根據(jù)COGNOSAG的命名，它已經(jīng)被重新命名為halo—</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　1．中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒，中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社，2006，P486。<

36、/p><p>　　2．張文廣，王雅春，李金泉。數(shù)量遺傳學(xué)和基因組學(xué)與未來(lái)的動(dòng)物育種學(xué)。黃牛雜志，2004，30（5）：31-36。</p><p>　　3．張文廣。內(nèi)蒙古絨山羊開(kāi)放核心群優(yōu)化育種規(guī)劃的研究，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2004。</p><p>　　4．Zhang Wenguang, Wu Jianghong, Li Jinquan et. al. OM

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38、<p>　　7．http://www.geneontology.org/, 2008-3-1.</p><p>　　8. 王高富，吳登俊。影響綿羊羊毛性狀的主效基因和QTL?，F(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2006，5：60-63。</p><p>　　9. 曾獻(xiàn)存，陳韓英，彭林澤等。影響羊毛性狀和羊毛品質(zhì)的主要基因和QTL的研究進(jìn)展。甘肅畜牧獸醫(yī)，2006，36（5）：39-41。</