基于aflp標(biāo)記的梭魚(yú)群體遺傳多樣性分析【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　基于AFLP標(biāo)記的梭魚(yú)群體遺傳多樣性分析</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 農(nóng)業(yè)

2、資源與環(huán)境 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b>&

3、lt;/p><p><b>　　中文摘要1</b></p><p><b>　　英文摘要2</b></p><p><b>　　1. 前言 4</b></p><p>　　1.1 梭魚(yú)研究現(xiàn)狀4</p><p>　　1.2 AFLP標(biāo)記的基本原理及特

4、點(diǎn)5</p><p>　　2. 材料和方法7</p><p>　　2.1 樣本來(lái)源5</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)操作5</p><p>　　2.3 數(shù)據(jù)處理8</p><p><b>　　3. 結(jié)果9</b></p><p>　　3.1 AFLP 擴(kuò)增結(jié)果

5、9</p><p>　　3.2 梭魚(yú)各個(gè)群體遺傳分化及聚類(lèi)樹(shù)分析10</p><p><b>　　4. 討論13</b></p><p>　　致謝辭錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)13</b></p><p>　　[摘要] 梭魚(yú)是我國(guó)沿海的重

6、要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，在西北太平洋區(qū)有廣泛的分布。本研究利用AFLP技術(shù)對(duì)西北太平洋海域的8個(gè)群體91個(gè)個(gè)體梭魚(yú)的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，4對(duì)選擇性引物在91個(gè)個(gè)體中共擴(kuò)增產(chǎn)生186個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)97個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比列為52.15%。不同引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)差異較大，從39-62不等。在8個(gè)梭魚(yú)群體中，青島群體多態(tài)位點(diǎn)比例和Nei遺傳多樣性指數(shù)最高，云林群體多態(tài)位點(diǎn)比例和Nei遺傳多樣性指數(shù)最低。梭魚(yú)兩兩群體的FST值在0.0667和0.55

7、05之間，并且所有的FST值都差異極顯著（P<0.01）。8個(gè)群體的聚類(lèi)樹(shù)和所有個(gè)體的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)顯示梭魚(yú)群體分為兩支，珠江和云林群體一支（南方種群），其余中國(guó)群體和日本兩個(gè)群體聚為一支（北方種群），并且兩個(gè)種群間無(wú)個(gè)體的交叉，AMOVA分析結(jié)果表明，南北種群間遺傳差異顯著。本研究表明梭魚(yú)南北兩個(gè)種群是兩個(gè)隱蔽種。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 梭魚(yú) 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP) 遺傳結(jié)構(gòu) 種

8、群</p><p>　　[Abstract] Liza haematocheila is an important commercial fish in Northwestern Pacific，and it is widely distributed in the coastal. In this study, AFLP technology is used to analyze the genetic div

9、ersity of Liza haematocheila in the coastal of China and neighboring seas. Four primer combinations amplified 423 loci among 91 individuals, including 265 polymorphic loci. The proportion of polymorphic loci, the Nei gen

10、etic diversity of 8 populations varied from 22.73% to38.46%, 0.0890 to 0.1422 , resp</p><p>　　[Key words] Liza haematocheila Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP ) Genetic structure Populati

11、on </p><p><b>　　1． 前言</b></p><p>　　1.1 梭魚(yú)研究概況</p><p>　　1.1.1 梭魚(yú)分布與習(xí)性</p><p>　　梭魚(yú)(Liza haematocheila)屬于硬骨魚(yú)綱，鯔形目，鯔科，梭魚(yú)屬，俗稱(chēng)齒眼梭鯔等[1]。梭魚(yú)體呈紡錘形，頭短而寬，眼稍呈紅色，脂眼瞼不發(fā)達(dá)，

12、僅僅存于眼邊緣。外表覆蓋有大鱗，體側(cè)縱列鱗有41-47，背側(cè)呈現(xiàn)青灰色，背鰭兩個(gè)，第一背鰭起點(diǎn)距吻端較距尾鰭近。胸鰭基部無(wú)腋鱗，尾鰭凹形。腹部則呈現(xiàn)淺灰色，兩側(cè)鱗片有黑色豎紋。主要棲息在江河口和海灣內(nèi)，我國(guó)有廣泛分布，尤以渤海、黃海居多。喜群集生活，以水底泥土中的有機(jī)物為食。他們的生活習(xí)性具有廣鹽性和廣溫性，但溫度的變化需要漸變，而若驟然改變溫度，就容易造成死亡。梭魚(yú)適宜生活在PH值為7.6—9.3左右，它們對(duì)氧有較大的生態(tài)耐性，耗氧量

13、隨個(gè)體的增大而增加。梭魚(yú)屬于硬骨魚(yú)綱的鯔形目，眾所周知鯔科魚(yú)類(lèi)(Mugilidae)是知名的世界性分布的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，是沿海常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。性活躍，為廣溫、廣鹽性魚(yú)類(lèi)，可以棲息于淡水中，而梭魚(yú)（Liza haematocheila）是亞洲地區(qū)鯔科魚(yú)類(lèi)中最主要的經(jīng)濟(jì)代表種。梭魚(yú)幼魚(yú)以浮游動(dòng)物為主食，成魚(yú)主食底棲硅藻類(lèi)，也食底層有機(jī)質(zhì)。梭魚(yú)肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)很豐富，梭魚(yú)具廣鹽、廣溫、食物鏈短、生長(zhǎng)快速、病害少、繁</p><p&

14、gt;　　1.1.2 梭魚(yú)概況</p><p>　　梭魚(yú)是黃渤海常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)食用魚(yú)類(lèi)，主要棲息在?？诤哟ㄏ痰粎R處，春季三四月份于河口附近產(chǎn)卵，幼魚(yú)時(shí)常隨潮溯河在河口處生存，成為海港主要養(yǎng)魚(yú)對(duì)象之一。目前有關(guān)梭魚(yú)的研究主要集中在漁業(yè)生物學(xué)、組織胚胎發(fā)育、人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)等方面[2,5]。漁民利用幼魚(yú)的溯河性，在5月上旬將幼魚(yú)隨潮納入港內(nèi)放養(yǎng)，幼魚(yú)生長(zhǎng)很快，秋天的時(shí)候就可長(zhǎng)到200毫米，10月末即可收獲。根據(jù)梭魚(yú)

15、的生活習(xí)性，捕撈方法可以為定置網(wǎng)、鉤釣等。食用梭魚(yú)的最佳時(shí)期在春季， 民間就有“食用開(kāi)凌梭，鮮得沒(méi)法說(shuō)”的說(shuō)法。梭魚(yú)屬一次產(chǎn)卵型魚(yú)類(lèi)，渤海雌梭魚(yú)4齡性成熟，黃海3-4齡，東海3齡，產(chǎn)卵期渤海在5-6月，浙江沿海在4月上旬到5月上旬，廣東沿海在9-11月。</p><p>　　目前有關(guān)梭魚(yú)群體遺傳學(xué)研究主要集中在形態(tài)學(xué)、線粒體DNA、RAPD和同工酶標(biāo)記等方面。在形態(tài)學(xué)研究方面，李明德根據(jù)梭魚(yú)篩骨的形態(tài)，將其分為3

16、個(gè)形態(tài)型：弧形、平直型及V型，3者同時(shí)分布于自然海區(qū)[3]。宋佳坤等比較了59尾采自廣東合浦、北海，廣東湛江、廣州、汕頭，福建集美、溫州、舟山、天津等地的梭魚(yú)樣品進(jìn)行了形態(tài)比較研究，認(rèn)為我國(guó)沿海梭魚(yú)同日本沿海梭魚(yú)為同一種類(lèi)[6]。孟瑋利用棱梭作為外群研究了我國(guó)沿海不同地點(diǎn)梭魚(yú)的形態(tài)特征地理變異，單因子方差分析表明，梭魚(yú)各群體間不存在明顯的形態(tài)變異[7]。Meng 等利用同工酶標(biāo)記對(duì)丹東、日照、寧波和廣州梭魚(yú)4個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，

17、在10種酶中，共檢測(cè)到14個(gè)位點(diǎn)，各群體多態(tài)位點(diǎn)比例為0.07-0.14，群體間遺傳距離在0.0004-0.0021之間，結(jié)果顯示廣州群體與其余三個(gè)群體遺傳距離差異相對(duì)較大[8]。楊銳等利用同工酶標(biāo)記對(duì)野生群體和養(yǎng)殖群體梭魚(yú)遺傳變異進(jìn)行了研究，在10種酶中共檢測(cè)到22個(gè)位點(diǎn)。自然群體和多態(tài)位點(diǎn)比較較高。在養(yǎng)殖群體中兩個(gè)位點(diǎn)觀察到相當(dāng)多的雜合子, 導(dǎo)致這兩個(gè)位點(diǎn)雜合度遠(yuǎn)大于自然群體, 進(jìn)而造成養(yǎng)殖群體平均雜合度高于自然</p>

18、<p>　　幼體的擴(kuò)散在海洋生物生態(tài)和進(jìn)化過(guò)程中扮演了極為重要的角色[11,12]。許多海洋生物的浮游幼體可以借助洋流擴(kuò)散，這有可能導(dǎo)致距離很遠(yuǎn)的群體間產(chǎn)生基因交流。這些具有較強(qiáng)的潛在擴(kuò)散能力的海洋生物通常在很大的地理范圍內(nèi)表現(xiàn)出很低的遺傳分化。梭魚(yú)其幼體的浮游生活期約為四周。期間，一些體長(zhǎng)為11～20 mm 的幼體開(kāi)始集群并向近岸及河口區(qū)遷移[13-14]。若梭魚(yú)群體隨著洋流進(jìn)行遷移，則群體內(nèi)的基因交流會(huì)比較頻繁，其擴(kuò)散

19、能力也較強(qiáng)。為檢驗(yàn)梭魚(yú)的幼體擴(kuò)散對(duì)梭魚(yú)遺傳結(jié)構(gòu)的影響，Liu 等采用線粒體DNA對(duì)梭魚(yú)分布范圍內(nèi)9個(gè)群體272個(gè)個(gè)體進(jìn)行了研究[15]。共檢測(cè)到 3 個(gè)不同的單倍型類(lèi)群 ,這 3 個(gè)單倍型類(lèi)群可能是在更新世冰期被隔離在 3 個(gè)邊緣海內(nèi)而產(chǎn)生的分化。這一研究結(jié)果與以往的假設(shè)相反 ,3 個(gè)單倍型類(lèi)群在地理上的頻率分布存在很大差異。分子方差分析和群體多樣性指數(shù)都表明 3 個(gè)邊緣海內(nèi)的梭魚(yú)群體間存在顯著的遺傳差異。這些結(jié)果表明:與基于生物學(xué)特性

20、預(yù)期的梭魚(yú)具有較高的擴(kuò)散能力相反 ,梭魚(yú)群體空間上的基因交流是很有限的。東海的梭魚(yú)群體間缺乏系統(tǒng)地理格局 ,這可能是因?yàn)槟┐伪⑵诤笏篝~(yú)群體發(fā)生了</p><p><b>　　圖1-1 梭魚(yú)</b></p><p>　　Fig1-1 Picture of Liza haematocheila</p><p>　　1.2 AFLP標(biāo)記的基本原

21、理及特點(diǎn)</p><p>　　1.2.1 AFLP標(biāo)記的基本原理</p><p>　　AFLP (Amplified fragment length polymorphism)是將RFLP標(biāo)記與RAPD標(biāo)記相結(jié)合的一種分子標(biāo)記技術(shù)，這使得其獲得“最有力的分子標(biāo)記”稱(chēng)號(hào)。這也使得其兼?zhèn)淞薘FLP標(biāo)記的專(zhuān)一性可靠性,以及RAPD標(biāo)記的隨機(jī)性方便性[16]。因其通過(guò)選用不同的內(nèi)切酶來(lái)達(dá)到選擇性擴(kuò)

22、增的目的,故又被稱(chēng)作選擇性限制片段擴(kuò)增標(biāo)記（SRFA)。</p><p>　　AFLP技術(shù)的原理：對(duì)基因組酶切片段進(jìn)行選擇性的擴(kuò)增，將基因組的DNA用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割，形成不同的酶切位點(diǎn)以及分子量大小不等的隨機(jī)性酶切片段，接著在其兩端接上雙鏈的人工接頭，形成DNA模板。這些特異性片段經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸周期性的循環(huán)之后被擴(kuò)增，這些長(zhǎng)度不同的擴(kuò)增片段即為多態(tài)性片段。Vos等采用MseⅠ和EcoRⅠ組合對(duì)λpha

23、se、AcNPV等大小在48.8~16000 kb之間的四個(gè)物種的基因組進(jìn)行了AFLP的反應(yīng)原理進(jìn)行驗(yàn)證[17]，結(jié)果顯示檢測(cè)到的酶切片段數(shù)與預(yù)測(cè)的酶切片段數(shù)完全一致，這充分證明了AFLP技術(shù)原理的可靠性。</p><p>　　AFLP分析的接頭和引物都是由人工合成的雙鏈核苷酸序列。接頭一般由一個(gè)核心序列和一個(gè)酶專(zhuān)化的序列組成，通常有14~18個(gè)堿基對(duì)。引物由三部分組成:與人工接頭互補(bǔ)的5’端的核心堿基序列(Co

24、re sequence，CORE)、應(yīng)于限制性酶切片段的限制性末端的特異性酶切序列(Enzyme specific sequence, ENZ)和3’端選擇性堿基(Selective extension, ENT)。引物只識(shí)別和擴(kuò)增在兩個(gè)酶切末端內(nèi)側(cè)且與選擇性堿基互補(bǔ)的限制性片段。此方法中，引物的核心序列與接頭部分是相互對(duì)應(yīng)的，所以?xún)烧弑仨氉裾障嗤膶?shí)驗(yàn)原則:(1)為避免接頭之間的互相連接，對(duì)接頭不進(jìn)行磷酸化。（2)C和G的含量適宜，一

25、般而言，兩者相加總量要大于一半。(3)接頭與限制性片段連接后要確認(rèn)原來(lái)的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)不能恢復(fù)。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的多少主要取決于兩個(gè)因素：（1）引物3’末端的選擇性堿基的數(shù)目（2）引物3’末端的核苷酸組成。一般而言，選擇性堿基數(shù)不超過(guò)3個(gè)，基因組DNA大于108bp的選用3個(gè)選擇性堿基，基因組DNA在105~106bp的選用2個(gè)選擇性堿基，在此范圍內(nèi)每增加一個(gè)堿基會(huì)減少1/4的擴(kuò)增帶譜

26、。通過(guò)研究，Vos等人發(fā)現(xiàn)堿基數(shù)目越多，錯(cuò)配的概率越大，甚至可能出現(xiàn)假帶的情況。一般而言，C、G含量若越高，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)越少，而對(duì)于有大量A、T的基因組來(lái)說(shuō)，用含有它們的選擇性堿基可獲得數(shù)量更多的擴(kuò)增片段。此說(shuō)法也被Hansen和Qi在研究中證明。</p><p>　　1.2.2 AFLP標(biāo)記的特點(diǎn)</p><p>　?。?）DNA需求量少且可被用于線粒體 DNA。RELP研究中從線粒體里獲

27、得大量的DNA是很困難的。AFLP對(duì)模板濃度變化要求不高，濃度范圍在1000以?xún)?nèi)影響不大，故其產(chǎn)生的指紋圖譜十分相似。</p><p>　?。?）較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力。改變限制性?xún)?nèi)切酶或者選擇性堿基的種類(lèi)及數(shù)目可以調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條帶數(shù)。人工接頭可以被不同設(shè)計(jì)，因此搭配產(chǎn)生不同的引物，這便使得搭配有較高的靈活度，這也使其能檢測(cè)出大量的多態(tài)片段，從而超越了其他分子標(biāo)記法。較好的重復(fù)性。AFLP是在有無(wú)電泳條帶的基礎(chǔ)上分析的

28、,DNA的質(zhì)量越高或者酶的過(guò)量都可以免除由DNA酶切的不完全而產(chǎn)生的失真,在PCR里，退火溫度較高或者所用的引物較長(zhǎng)都可以將在擴(kuò)增中出現(xiàn)的錯(cuò)誤減少到最低限度,從而可以說(shuō)AFLP分析可重復(fù)性較強(qiáng)。</p><p>　?。?）較好的重復(fù)性。AFLP是在有無(wú)電泳條帶的基礎(chǔ)上分析的,DNA的質(zhì)量越高或者酶的過(guò)量都可以免除由DNA酶切的不完全而產(chǎn)生的失真,在PCR里，退火溫度較高或者所用的引物較長(zhǎng)都可以將在擴(kuò)增中出現(xiàn)的錯(cuò)誤

29、減少到最低限度,從而可以說(shuō)AFLP分析可重復(fù)性較強(qiáng)。</p><p>　?。?）隨機(jī)性強(qiáng)，沒(méi)有放射性危害。研究中不需要預(yù)先得知被分析的基因組 DNA的序列信息。</p><p>　?。?）高分辨率。AFLP的擴(kuò)增片段較RFLP分析法而言較短，適合在變性序列凝膠上進(jìn)行電泳分離，因此片段多態(tài)性檢出率高，內(nèi)部多態(tài)性就不會(huì)被掩蓋。</p><p>　?。?）樣品適用性廣。任

30、何來(lái)源的樣品都適用于AFLP標(biāo)記技術(shù)包括各種復(fù)雜度不一的DNA ,例如細(xì)胞質(zhì)DNA、質(zhì)粒、個(gè)別基因或某段基因片段, 同時(shí)在標(biāo)記時(shí)并不需要事先知道這些DNA的序列。用同樣的一組限制酶、引物,可以對(duì)各種生物的DNA分子進(jìn)行遺傳標(biāo)記研究。</p><p>　?。?）遺傳性穩(wěn)定。AFLP標(biāo)記在后代中的遺傳和分離運(yùn)用中符合Mendel的遺傳規(guī)律，而種群中，AFLP標(biāo)記又遵循了Hardy－Weinberg 平衡說(shuō)，因此，從技

31、術(shù)特點(diǎn)角度而言，AFLP 實(shí)際上是 RAPD 和 RFLP相結(jié)合的標(biāo)記方法。AFLP既克服了RFLP技術(shù)的復(fù)雜性、放射性危害以及穩(wěn)定性差、在標(biāo)記中出現(xiàn)隱性遺傳的缺點(diǎn)，同時(shí)又兼具有兩者的優(yōu)點(diǎn)。近幾年來(lái)，人們不斷將這一技術(shù)完善和發(fā)展，使得AFLP迅速成為迄今為止最有效的分子標(biāo)記[19]。</p><p>　　1.2.3 AFLP標(biāo)記的應(yīng)用</p><p>　　AFLP是一種較新的分子標(biāo)記的技術(shù)

32、,公開(kāi)應(yīng)用時(shí)間不長(zhǎng)，因此還沒(méi)被應(yīng)用到生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。但是該標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)已被廣大研究者認(rèn)識(shí)到，因此具有良好地應(yīng)用前景。目前,AFLP標(biāo)記已經(jīng)在遺傳多樣性檢測(cè)、居群遺傳結(jié)構(gòu)還有遺傳分化分析、物種親緣關(guān)系的分析、種質(zhì)資源的鑒定、基因流測(cè)定等方面得到了較為廣泛的應(yīng)用[20]。AFLP技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳多樣性分析中已廣泛應(yīng)用，在貝類(lèi)、對(duì)蝦、大黃魚(yú)、小黃魚(yú)、真鯛、牙鲆等經(jīng)濟(jì)水生生物上開(kāi)展了大量的研究[21-32 ]。</p>&l

33、t;p>　　1.3 本研究的目的與意義</p><p>　　梭魚(yú)是亞洲地區(qū)鯔科魚(yú)類(lèi)中最主要的經(jīng)濟(jì)代表種。目前由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染等人類(lèi)活動(dòng)的影響，梭魚(yú)類(lèi)的資源量急劇下降，開(kāi)展梭魚(yú)的遺傳多樣性保護(hù)顯得十分重要。有關(guān)梭魚(yú)的線粒體DNA序列研究顯示在梭魚(yú)群體內(nèi)存在3個(gè)顯著分化的單倍型類(lèi)群，并且3個(gè)類(lèi)群頻率在不同海區(qū)存在顯著差異。有關(guān)3個(gè)單倍型類(lèi)群是否代表顯著分化的隱蔽種還是只代表群體內(nèi)不同的母系起源，目前尚無(wú)定

34、論。在梭魚(yú)近緣種鯔魚(yú)群體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了3個(gè)顯著分化的線粒體類(lèi)群，結(jié)合微衛(wèi)星標(biāo)記，研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)單倍型類(lèi)群代表了不同的隱蔽種[33]。因此梭魚(yú)3個(gè)單倍型類(lèi)群的分類(lèi)地位值得探討。本研究采用AFLP標(biāo)記，從核基因角度研究不同梭魚(yú)群體的遺傳變異，探討梭魚(yú)3個(gè)單倍型類(lèi)群的間的關(guān)系。</p><p><b>　　2． 材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 樣

35、本來(lái)源</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用梭魚(yú)取自8個(gè)不同地理群體涵蓋Liu等所檢測(cè)到的梭魚(yú)3個(gè)單倍型類(lèi)群，分別是我國(guó)沿海的丹東、日照、青島、寧波、珠江、云林和日本的大分、函館，共采集了91個(gè)樣品（表2-1）。樣品冷凍運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，取背部肌肉經(jīng)過(guò)酒精固定后保存。</p><p>　　表2-1梭魚(yú)各個(gè)種群采樣情況以及擴(kuò)增狀況</p><p>　　Tabl

36、e 2-1 Parameters of genetic diversity for populations of Liza haematocheila</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)操作</b></p><p>　　采用蛋白酶K/酚氯仿方法提取基因組DNA，對(duì)于基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，取高質(zhì)量DNA模板50ng進(jìn)行AFLP反應(yīng)，AFLP實(shí)驗(yàn)方法參照Vo

37、s等，選用EcoRⅠ和M seⅠ兩種限制性?xún)?nèi)切酶在37℃下進(jìn)行酶切，此過(guò)程進(jìn)行約5——6小時(shí), 于70℃中放置15min，使酶失活，4℃下保存?zhèn)溆?。接著用T4連接酶進(jìn)行連接片段，于37℃下反應(yīng)4h。4℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ?μl連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增體系為20ul, 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94℃ 2min；接著94℃ 30s，56℃ 60s，72℃ 60s，共20個(gè)循環(huán)；4℃ 下保持。根據(jù)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增效果。該產(chǎn)物用超純水

38、稀釋10倍，然后對(duì)其進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；取5μl預(yù)擴(kuò)增稀釋混合液，10×PCR buffer plus Mg2+ 2μl， EcoRI引物(27.8ng/μl) 0.4μl， MseI引物 (27.8ng/μl) 0.4μl， Taq DNA聚合酶0.2μl,加超純水至總體積為20μl。選擇性反應(yīng)條件為先94℃ 2min，再94℃ 30s，65℃ 30s，（每循環(huán)退火溫度降低1℃），72℃ 60s，10個(gè)循環(huán)后變?yōu)椋?</

39、p><p>　　表2-2 用于AFLP分析法中的引物序列和接頭</p><p>　　Table2-2 Adaptor and primer sequences used in AFLP analysis</p><p><b>　　2.3 數(shù)據(jù)處理</b></p><p>　　首先將電泳圖譜中擴(kuò)增條帶的有無(wú)轉(zhuǎn)化為0，1原始數(shù)

40、據(jù)矩陣。采用兩種方法對(duì)AFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；其一，AFLP標(biāo)記是顯性標(biāo)記，依據(jù)原始數(shù)據(jù)矩陣統(tǒng)計(jì)總位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)和進(jìn)行AMOVA分析等；其二將每一個(gè)條帶視為1個(gè)位點(diǎn)，進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡假設(shè)，計(jì)算群體的Nei遺傳多樣性指數(shù)和基因分化系數(shù)。統(tǒng)計(jì)的遺傳學(xué)參數(shù)主要有：</p><p>　　多態(tài)位點(diǎn)比例：P=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)×100%</p>&

41、lt;p>　　遺傳相似系數(shù)：Sij=2Nij/(Ni+Nj) 其中，Nij為個(gè)體i與j共有的條帶數(shù)量；Ni、 Nj分別為個(gè)體i與j各自具有的條帶數(shù)量。</p><p>　　遺傳距離：D= - ln S,式中S為相似系數(shù)。</p><p>　　Nei遺傳多樣性指數(shù)h：h0 = 1 - ∑P2i, Pi 為單個(gè)位點(diǎn)上的等位基因頻率。</p><p>　　基因分化系

42、數(shù)Gst是衡量群體間遺傳分化的指標(biāo)，為總?cè)后w平均雜合度(hs)和各群體內(nèi)平均雜合度(ht)的函數(shù)，即Gst=1-hs/ht。</p><p>　　利用Arlequin進(jìn)行AMOVA分析，利用POPGEN1.32計(jì)算Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)，用MEGA3.0軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹(shù)。</p><p>　　圖2-3 梭魚(yú)的取樣地點(diǎn)</p><p>　

43、　Figure2-3 Sample location of Liza haematocheila</p><p><b>　　3． 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 AFLP 擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　4對(duì)選擇性引物在8個(gè)群體91個(gè)個(gè)體中共擴(kuò)增出186個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)97個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比列為52.15%。不同引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)

44、數(shù)差異較大，從39-62不等，引物E-AGA/M-CTG 擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最多，引物E-AGG/M-CAA擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最少。每個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)位點(diǎn)比例為38.46%-57.50%（表3-1）。8個(gè)群體分別擴(kuò)增出159、157、156、145、156、149、142、132條擴(kuò)增片段。平均多態(tài)位點(diǎn)比率分別為35.85%、35.67%、37.18%、33.10%、38.46%、32.89%、30.28%、22.73%，(見(jiàn)表2-1、表3-1).

45、日照群體擴(kuò)增條帶數(shù)最多，云林群體擴(kuò)增條帶數(shù)最少。</p><p>　　表3-1　不同引物的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　Table 3-1 Number of bands generated by primer combinations</p><p>　　3.2 梭魚(yú)各個(gè)群體遺傳分化及聚類(lèi)樹(shù)分析</p><p>　　利用PopGen對(duì)梭

46、魚(yú)8個(gè)地理群體遺傳多樣性進(jìn)行分析，梭魚(yú)8個(gè)群體的Nei遺傳多樣性指數(shù)在0.0890-0.1401之間。日本大分群體Nei遺傳多樣性指數(shù)最高，多態(tài)位點(diǎn)比例最高。云林群體Nei遺傳多樣性指數(shù)最低，多態(tài)位點(diǎn)比例最低（表2-1）。梭魚(yú)8個(gè)群體的遺傳距離在0.0864和0.1546之間，丹東和日照群體間遺傳距離最小，日照和云林群體間的遺傳距離最大（表3-2(a)）。為分析梭魚(yú)群體間的遺傳距離，計(jì)算兩兩群體的FST值，梭魚(yú)兩兩群體的FST值在0.0

47、667和0.5505之間，并且所有的FST值都差異極顯著（P<0.01）（表3-2(b)），說(shuō)明各群體間有顯著的遺傳分化。根據(jù)各群體間的遺傳距離，構(gòu)建了梭魚(yú)8個(gè)群體的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)，8個(gè)群體的聚類(lèi)樹(shù)顯示梭魚(yú)群體分為兩支，珠江和云林群體一支（南方種群），其余中國(guó)群體和日本兩個(gè)群體聚為一支（北方種群）（圖3-1）。此外，我們還計(jì)算了個(gè)體間的遺傳距離，構(gòu)建了梭魚(yú)個(gè)體的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)（圖3-2），個(gè)體的聚類(lèi)樹(shù)同群體的聚類(lèi)樹(shù)基本一致，9

48、1個(gè)體的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)明顯分成兩支，珠江和云林群體的所有個(gè)體聚成一支，其余個(gè)體聚成一支，個(gè)體聚類(lèi)樹(shù)的兩支</p><p>　　圖3-1 梭魚(yú)群體UPGMA聚類(lèi)樹(shù)</p><p>　　Figure 3-1 The UPGMA tree for Liza haematocheila</p><p>　　表3-2（a） 梭魚(yú)各群體的遺傳距離（上） 和FST （下）&

49、lt;/p><p>　　Table 3-2（a） Nei’s genetic distance (above) and pairwise FST (below) between</p><p>　　*significant P<0.01</p><p>　　表3-2(b)　梭魚(yú)群體的AMOVA分析數(shù)據(jù)</p><p>　　Table 5

50、Data derived from AMOVA of of Liza haematocheila</p><p>　　圖3-2 梭魚(yú)91個(gè)個(gè)體的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)</p><p>　　Figure 3-2 UPGMA dendrogram of 91 individuals of Liza haematocheila</p><p><b>　　4. 討論&

51、lt;/b></p><p>　　本論文采用AFLP標(biāo)記對(duì)梭魚(yú)8個(gè)群體的遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行了研究，系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)和AMOVA分析表明梭魚(yú)8個(gè)群體分為兩個(gè)不同的地理種群南方種群和北方種群，南方種群包括珠江和云林群體，北方種群包括剩余的6個(gè)群體。南方種群可能包括南海海區(qū)群體、北方種群包括東海、黃渤海和日本沿海。以前學(xué)者利用形態(tài)學(xué)、同工酶和線粒體對(duì)梭魚(yú)的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[7-8,15]，形態(tài)學(xué)結(jié)果認(rèn)為梭魚(yú)

52、各群體間無(wú)顯著的分化，同工酶結(jié)果顯示廣東群體同東海及黃渤海群體存在一定的遺傳分化，但遺傳距離較小（0.0021）處于種群內(nèi)的水平，Liu 等采用線粒體DNA對(duì)梭魚(yú)分布范圍內(nèi)9個(gè)群體272個(gè)個(gè)體進(jìn)行了研究，。共檢測(cè)到 3 個(gè)不同的單倍型類(lèi)群 ,這 3 個(gè)單倍型類(lèi)群可能是在更新世冰期被隔離在 3 個(gè)邊緣海內(nèi)而產(chǎn)生的分化。</p><p>　　綜合本研究的結(jié)果梭魚(yú)南方種群在線粒體上包含梭魚(yú)線粒體中的B和C兩支，北方種群

53、包含梭魚(yú)線粒體中的（A和B）兩支，根據(jù)本研究結(jié)果梭魚(yú)線粒體所揭示的3個(gè)支系不是代表了3個(gè)隱蔽種，相反南北兩個(gè)種群可能代表兩個(gè)隱蔽種。本研究結(jié)果同梭魚(yú)近緣種鯔魚(yú)的種群遺傳學(xué)結(jié)果存在不一致性。Shen等利用線粒體COI基因和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)西北太平洋區(qū)鯔魚(yú)種群系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，通過(guò)COI基因在鯔魚(yú)西北太平洋群體內(nèi)檢測(cè)到3個(gè)顯著分化的單倍型類(lèi)群，分布格局同梭魚(yú)相似，但根據(jù)10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的分析結(jié)果，顯示鯔魚(yú)3個(gè)線粒體分支間在核基因上存在強(qiáng)烈

54、的基因分化，支持鯔魚(yú)的3個(gè)線粒體分支代表3個(gè)形態(tài)相似的隱蔽種[33]。本研究結(jié)果表明梭魚(yú)3個(gè)線粒體支系間存在一定的基因交流，不支持線粒體3個(gè)支系代表3個(gè)隱蔽種，相反認(rèn)為梭魚(yú)存在兩個(gè)地理上分布不重疊的兩個(gè)地理種。</p><p>　　生物群體的遺傳多樣性是評(píng)價(jià)生物資源狀況的一個(gè)重要依據(jù)，它是物種適應(yīng)多變的環(huán)境,維持長(zhǎng)期生存和進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)。多態(tài)位點(diǎn)比率和基因多樣性指數(shù)是檢驗(yàn)群體遺傳多樣性的常用指標(biāo)，本研究通過(guò)比較梭

55、魚(yú)8個(gè)地理群體的多態(tài)位點(diǎn)比率和基因多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，其遺傳多樣性處于較低水平。同已知魚(yú)類(lèi)AFLP 數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn), 梭魚(yú)群體的多態(tài)位點(diǎn)比例低于我國(guó)沿海真鯛的3個(gè)群體(64 %～58. 4 %)[30]和紫紅笛鯛的野生群體(57. 14 %)[31]，也低于褐牙鲆的野生(46. 18 %) 和養(yǎng)殖群體(40. 07 %)[32] 。比較結(jié)果表明梭魚(yú)群體的遺傳多樣性處于中等的水平。</p><p>　　西北太平洋區(qū)的相關(guān)

56、研究結(jié)果表明，更新世冰期可能是導(dǎo)致很多海洋生物分化的重要因素，在過(guò)去的約80萬(wàn)年里，氣候的波動(dòng)以一個(gè)約為十萬(wàn)年的周期進(jìn)行。冰期引起的海平面變化非常強(qiáng)烈，在冰盛期（glacial maxima），海平面大約下降120-140米]。在冰期海平面下降，臺(tái)灣海峽形成陸橋，亞洲大陸與臺(tái)灣島通過(guò)陸橋相連 [34]。由于日本海海峽較淺（< 135m），在更新世的冰盛期，西北太平洋三大邊緣海（南海、東海和日本海）相互隔離，使某些海洋生物產(chǎn)生隔離分

57、化，形成線粒體不同的支系，隨著海平面上升，不同支系間相互交流，新形成的群體可能長(zhǎng)期適應(yīng)于當(dāng)?shù)丨h(huán)境逐漸產(chǎn)生分化，形成一些新的種群或亞種，但線粒體上相互存在基因交流的結(jié)果被記錄下來(lái)。李明德根據(jù)梭魚(yú)篩骨的形態(tài)，將其分為3個(gè)形態(tài)型：弧形、平直型及V型，3者同時(shí)分布于自然海區(qū)，但以弧形為主，3種形態(tài)型是否代表不同的隱蔽種[2-3]，由于缺乏本實(shí)驗(yàn)樣品的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)無(wú)法確認(rèn)。本研究結(jié)果表明梭魚(yú)可能存在兩個(gè)不同的隱蔽種，為一步加大樣品量，進(jìn)一步開(kāi)展形態(tài)

58、學(xué)和微衛(wèi)星標(biāo)記研究，尋找存在不同隱蔽種的證據(jù)。</p><p><b>　　[參 考 文 獻(xiàn)]</b></p><p>　　[1] 孟慶聞，繆學(xué)祖， 俞泰濟(jì)，等. 魚(yú)類(lèi)學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989.87-89.</p><p>　　[2] 李明德. 中國(guó)梭魚(yú)42年來(lái)的研究概況[J]. 海洋通報(bào)，1993，6：81-85.<

59、;/p><p>　　[3] 李明德，王秀玲，呂憲禹. 梭魚(yú)[M]. 北京：海洋出版社，1997.124-127.</p><p>　　[4] 朱元鼎，張春霖，成慶泰. 東海魚(yú)類(lèi)志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1963.98-102.</p><p>　　[5] 李明德， 王祖望. 渤海梭魚(yú)的年齡與生長(zhǎng)[J]. 海洋學(xué)報(bào)，1982，4（4）：508-515.</p&g

60、t;<p>　　[6] 宋佳坤. 我國(guó)鰭科魚(yú)類(lèi)的頭部側(cè)繞管形態(tài)及系統(tǒng)分類(lèi)[J]. 動(dòng)物學(xué)集刊，1981.9-21.</p><p>　　[7]戴繼勛,權(quán)潔霞，楊銳，梭魚(yú)遺傳多樣性研究，云南大學(xué)學(xué)報(bào)，1999,（03）:220.</p><p>　　[8] Meng W, Gao TX, Zheng B. Genetic Analysis of Four Populations

61、 of Redlip Mullet (Chelon haematocheilus) Collected in China Seas[J]. Journal of Ocean Universit of China,2007,6:72-75.</p><p>　　[9] 楊銳，莊志猛，喻子牛，等.梭魚(yú)養(yǎng)殖群體與自然群體等位基因酶的遺傳變異[J].海洋水產(chǎn)研究，2002，23：15-19.</p>&l

62、t;p>　　[10] 權(quán)杰霞，戴繼勛，沈頌東，等.梭魚(yú)人工養(yǎng)殖群體與自然群體的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)（RAPD）分析[J] .海洋學(xué)報(bào)，2000，22：82-87.</p><p>　　[11] Caley, M.J., Carr, M.H., Hixon, M.A., Hughes, T.P., Jones, G.P., Menge, B.A., 1996. Recruitment and the local dy

63、namics of open marine populations[J]. Annu. Rev. Ecol. Syst. 27, 477-500.</p><p>　　[12] Strathmann, R.R., Hughes, T.P., Kuris, A.M., Lindeman, K.C., Morgan, S.G., Pandolfi, J.M., Warner, R.R., 2002. Evolutio

64、n of self-recruitment and its consequences for marine populations [J]. Bull. Mar. Sci. 70, S377-S396.</p><p>　　[13] 吳光宗，楊東萊，龐鴻艷.渤海灣鱸魚(yú)魚(yú)卵和仔、稚魚(yú)分布的研究[J].海洋科學(xué)，1983，6，40-45.</p><p>　　[14] Yoshimatsu,

65、T., Matsui, S., Kitajima, C., 1992. Early development of laboratory-reared redlip mullet, Liza haematocheila[J]. Aquaculture, 105, 379-390.</p><p>　　[15] Liu JX, Gao TX, Wu SF, Zhang YP. Pleistocene isolatio

66、n in the marginal ocean basins and limited dispersal in a marine fish, Liza haematocheila (Temminck & Schlegel, 1845) [J]. Molecular Ecology, 2007,16: 275–288.</p><p>　　[16] 韓雙艷，郭勇.AFLP 在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.生

67、物技術(shù)通報(bào)，2002，（2）：22-24.</p><p>　　[17] Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting [J]. Nucleic Acids Res, 1995 , 23 : 4407-4414.</p><p>　　[18] 李?lèi)?ài)麗，馬峙英. AFLP 分子標(biāo)

68、記與作物改良［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（1）：89-94.</p><p>　　[19]張民照，康樂(lè). AFLP 標(biāo)記的特點(diǎn)及其在昆蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2002，45（4）：538 -543.</p><p>　　[20]張留所，孔曉瑜，喻子牛，等. AFLP 技術(shù)在水生動(dòng)物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用及前景展望［J］.高技術(shù)通訊，2003，（4）：95 -98.<

69、;/p><p>　　[21]王志勇, 柯才煥, 王藝?yán)? 等。從AFLP指紋和標(biāo)記基因序列看我國(guó)養(yǎng)殖的四種鮑的親緣關(guān)7系[J] . 高技術(shù)通訊,，2005，15（12）：93-98.</p><p>　　[22] 陳省平，包振民，潘 潔，等. 4 種養(yǎng)殖扇貝的群體遺傳多樣性及特異性AFLP 標(biāo)記研究[J].海洋學(xué)報(bào)，2005，27（2）：160-164.</p><p&g

70、t;　　[23] 王偉繼，高　煥，孔杰，等.利用AFLP技術(shù)分析中國(guó)明對(duì)蝦的韓國(guó)南海種群和養(yǎng)殖群體的遺傳差異[J] .高技術(shù)通訊，2005， 15（9）：81-86.</p><p>　　[24] 岳志芹，王偉繼，孔杰，等.用AFLP方法分析中國(guó)對(duì)蝦抗病選育群體的遺傳變異[J] .水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005， 29（1）：13-19.</p><p>　　[25] 王志勇，王藝?yán)?，林利民，?/p>

71、. 福建官井洋大黃魚(yú)AFLP指紋多態(tài)性的研究[J] .中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2002，9（3）：198-202.</p><p>　　[26] 劉必謙，董聞琦，王亞軍，等.岱衢族大黃魚(yú)種質(zhì)的AFLP分析[J] .水生物學(xué)學(xué)報(bào)，2005， 29（4）：413-416.</p><p>　　[27] Shui BN, Han ZQ, Gao TX, Miao ZQ. Genetic structure

72、 of Japanese Spanish mackerel (Scomberomorus niphonius) in the East China Sea and Yellow Sea inferred from AFLP data [J]. African Journal of Biotechnology, 2008, 7(21):3860-3865 .</p><p>　　[28] Han ZQ, Lin L

73、S, Shui BN, Gao TX. Genetic diversity of small yellow croaker Larimichthys polyactis revealed by AFLP markers [J]. African Journal of Agricultural Research, 2009, 4(7) 605-610.</p><p>　　[29]韓志強(qiáng)，高天翔，王志勇，等.黃姑魚(yú)

74、群體遺傳多樣性的AFLP分析[J] .水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30（5）:640-646.</p><p>　　[30] 王志勇， 王藝?yán)冢?林利民，等.利用AFLP 指紋技術(shù)研究中國(guó)沿海真鯛群體的遺傳變異和趨異[J ] .水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001 ，25 (4) :289-293.</p><p>　　[31] 張俊彬，黃良民.紫紅笛鯛遺傳多樣性的AFLP 分析[J] .熱帶海洋學(xué)報(bào),2004,2

75、3 (5) :50-55.</p><p>　　[32]張全啟，徐曉斐，齊潔，等.牙鲆野生群體與養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析[J] .中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2004 ,34 (5) :816 - 820.</p><p>　　[33] Shen KN,Jamandre BW, Hsu CC, Tzeng WN, Durand JD. Plio-Pleistocene sea level and

76、temperature fluctuations in the northwestern Pacific promoted speciation in the globally-distributed flathead mullet Mugil cephalus[J]. BMC Evolutionary Biology, 2011,11:83-90.</p><p>　　[34] Wang PX. Respons