畢業(yè)論文紫穗槐amorfrutin的提取與分析

1、<p>　　紫穗槐Amorfrutin的提取與分析</p><p>　　摘要：Amorfrutin是一種具有抗癌活性的苯基類化合物，且具有一定的抗糖尿病效應(yīng)。這種天然活性物質(zhì)不僅具有降血糖、抗炎癥的功效，還具有很好的耐受性。 Amorfrutin及其類似物還可以預(yù)防脂肪肝-一種因過(guò)量高脂營(yíng)養(yǎng)引起的常見(jiàn)病，而且可被用作功能性的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑或作為為患者量身定制的溫和性治療藥物成分。Amorfrutin最早發(fā)現(xiàn)于

2、原產(chǎn)于北美的甘草及紫穗槐果實(shí)里，而對(duì)于國(guó)內(nèi)紫穗槐是否也含有這種天然產(chǎn)物，則需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)國(guó)內(nèi)引進(jìn)栽培的紫穗槐的果實(shí)里是否含有Amorfrutin這種物質(zhì)進(jìn)行了探究。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，采取溶劑萃取法，用無(wú)水乙醇對(duì)紫穗槐果實(shí)中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行提取后，通過(guò)液相質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)萃取液成分進(jìn)行分析鑒定，得到提取物的質(zhì)譜圖，證實(shí)了提取物中確實(shí)含有Amorfrutin。然后改變實(shí)驗(yàn)條件及提取工藝，先將紫穗槐果實(shí)用5%的鹽酸和氯仿進(jìn)行萃取，再經(jīng)石油醚和

3、甲醇萃取，經(jīng)液相質(zhì)譜聯(lián)用分析，在甲醇相中得到了Amorfrutin的譜圖。最后再將兩次不同結(jié)果圖譜的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度進(jìn)行對(duì)比，證實(shí)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中經(jīng)萃取處理后的紫穗槐果實(shí)中提取到更多的Amorfrutin，初步找到提取紫穗槐果實(shí)里A</p><p>　　關(guān)鍵詞：天然產(chǎn)物；紫穗槐；萃取；Amorfrutin；糖尿病</p><p>　　The extraction and analyses of

4、Amofrutin from Amorpha fruticosa</p><p>　　Abstract: Amorfrutin as an anti-cancer activity of phenyl compound, has a certain anti-diabetic effects. According the world latest discovery, this natural active su

5、bstance with hypoglycemic, anti-inflammatory effect, also has good resistance effect at the same time. Amorfrutin and its analogues can also prevent fatty liver, a common disease caused by the excessive of fat nutrition.

6、 And it can also be used as functional nutritional supplements or a mild treatment to the patients. The natural sub</p><p>　　Key words: natural products, Amopha fruticosa, extraction, Amorfrutin，diabetes mel

7、litus </p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　第1章 緒 論1</p><p>　　1.1 研究背景2</p><p>　　1.1.1 紫穗槐果實(shí)中化學(xué)成分的研究3</p><p>　　1.1.2 天然活性物質(zhì)提取方法3</p>

8、<p>　　1.2 物質(zhì)鑒定及分析方法5</p><p>　　1.2.1 液質(zhì)聯(lián)用法5</p><p>　　1.2.2 硅膠層析法6</p><p>　　1.2.3 液相色譜法7</p><p>　　1.3 紫穗槐果實(shí)的化學(xué)成分和Amofrutin的研究現(xiàn)狀9</p><p>　　1.4

9、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x10</p><p>　　第2章 紫穗槐果實(shí)里Amorfrutin的提取11</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)儀器裝置和試劑11</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器11</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)裝置11</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)試劑錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。<

10、;/p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)原理12</p><p>　　第3章 結(jié)果與討論1</p><p>　　3.1 方案一結(jié)果2</p><p>　　3.2 方案二結(jié)果3</p><p>　　3.3 方案三結(jié)果3</p><p><b>　　3.4 討論5</b&g

11、t;</p><p>　　第4章 結(jié)論12</p><p><b>　　致謝25</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)26</b></p><p><b>　　第1章 緒 論</b></p><p>　　1.1 研究背景 </

12、p><p>　　紫穗槐為豆科紫穗槐屬多年生落葉灌木。在世界范圍內(nèi)具有廣泛的分布。紫穗槐屬植物全世界約25種，原產(chǎn)北美，我國(guó)引入栽培的只有紫穗槐一種，南北均有栽植?，紫穗槐在我國(guó)又稱綿槐、油條、椒條、穗花槐、紫翠槐、苕條。臨床上單方應(yīng)用，“治燒燙傷，癰瘡，濕疹”。 多年生豆科落葉小喬木, 原產(chǎn)北美洲， 多作為水土保持樹(shù)種, 其枝條可用于編織，葉子可作綠肥，其根、莖、葉可作藥用。其揮發(fā)油是一種理想的天然香料，具有止癢驅(qū)蚊

13、的功能，紫槐的這些重要用途，已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注，近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)已經(jīng)開(kāi)始有紫穗槐種子為原料的產(chǎn)品生產(chǎn) 。 </p><p>　　之前國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家對(duì)紫穗槐果實(shí)里的化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)紫穗槐果實(shí)里含有豐富的有機(jī)化合物，主要為黃酮類化合物以及一些揮發(fā)油的成分。有醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紫穗槐果實(shí)里的黃酮類化合物具有一定的抗癌活性。</p><p>　　天然產(chǎn)物活性成分(功能因子)具有特定的功效[15]

14、。通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)和臨床驗(yàn)證證明了它們具有抗氧化、抗衰老、抗菌消炎、抗癌、提高免疫力、降血脂、降血壓、降血糖等功效。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)天然產(chǎn)物活性物質(zhì)進(jìn)行了全方位和多領(lǐng)域的研究，研究其原料及原料的栽培和培養(yǎng)技術(shù)，以期獲得高含量活性成分的原料，研究天然產(chǎn)物的提取分離制備技術(shù)、活性物質(zhì)的構(gòu)成與結(jié)構(gòu)、功效和機(jī)理等，方興未艾。研究的主要目的和實(shí)際的應(yīng)用在于開(kāi)發(fā)生產(chǎn)功能保健食品、添加劑或藥品。天然產(chǎn)物的提取分離制備技術(shù)，傳統(tǒng)方法主要是溶劑萃取，如熱水浸

15、提、堿液提取和醇類提取等。其它溶劑的考察主要集中在如丙酮、乙酸乙酯、乙醚、苯 氯仿、正丁醇等有機(jī)溶劑對(duì)活性物質(zhì)的提取上。近年來(lái)，人們?cè)趥鹘y(tǒng)方法的基礎(chǔ)上采用了微波、超聲波物理助提技術(shù)和酶分解等生物技術(shù)來(lái)提高提取率。</p><p>　　大多數(shù)活性物質(zhì)的粗提物中活性物質(zhì)含量偏低，為了得到高含量和高純度的產(chǎn)品必須進(jìn)行精制，根據(jù)天然產(chǎn)物的性質(zhì)常用精制方法有：沉淀劑法、層析技術(shù)、超臨界C02萃取技術(shù)、膜分離技術(shù)。層析技術(shù)，

16、包括吸附層析法、柱層析法、薄層層析法(TLC)、紙層析法、氣一液層析法、升華法和高效液相層析法(HPLC)等。工業(yè)化生產(chǎn)中常用的是柱層析，常見(jiàn)的吸附劑有：硅膠、硅藻主、氧化鎂、氧化鋁、纖維素、聚酰胺、分子篩和離子交換樹(shù)脂等，應(yīng)用廣泛的主要為聚酰胺，大孔樹(shù)脂等吸附劑。超臨界C02萃取技術(shù)，超臨界流體C02是萃取小分子、低極性、親脂性物質(zhì)的理想溶劑。超臨界流體萃取技術(shù)與傳統(tǒng)提取方法相比具有萃取時(shí)間短、效率高、高選擇性提取、工藝流程簡(jiǎn)化、低溫

17、操作、適于對(duì)熱敏性物質(zhì)提取、無(wú)溶劑殘留、安全無(wú)毒、可實(shí)現(xiàn)有效成分的快速、準(zhǔn)確分析等優(yōu)點(diǎn)。膜分離技術(shù)，用天然或人工合成的高分子膜，以外加壓力或化學(xué)位差為推動(dòng)力，對(duì)雙組分或多組分的溶液進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和富集的方法。對(duì)于提取的活性物質(zhì)，尤其是未知結(jié)構(gòu)的物質(zhì)要進(jìn)行鑒定，主要方法有：紙色一紫外及可見(jiàn)光譜分析；高效液相色譜(HPLC)一質(zhì)譜分析(MS)；核磁共振波譜法(NMR)；X一</p><p>　　1.1.1 紫穗

18、槐果實(shí)里化學(xué)成分的研究</p><p>　　Amorfrutin先后被發(fā)現(xiàn)于甘草及紫穗槐的果實(shí)的提取物中，其具有很好的抗炎效果，并在后期的實(shí)驗(yàn)中在小鼠身上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[9]?？茖W(xué)家們對(duì)甘草的研究提取也驗(yàn)證了其具有抗糖尿病效應(yīng)，不僅可以降低血糖，還能抗炎，且耐受性極好。此外，Amorfrutin及其類似物還可以預(yù)防脂肪肝－一種因過(guò)量高脂營(yíng)養(yǎng)引起的常見(jiàn)病。紫穗槐果實(shí)中的Amorfrutin提取物有如此重要的功效，對(duì)

19、其研究勢(shì)在必行，而可能在提取方法等方面的技術(shù)不成熟，可能引起提取的化合物不純或者提取量不多，這個(gè)時(shí)候，如果能在實(shí)驗(yàn)室人工合成Amorfrutin，通過(guò)不斷實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證能否得到較高產(chǎn)率的物質(zhì)，則可選取相應(yīng)的方法來(lái)進(jìn)行大規(guī)模的投入生產(chǎn)。</p><p>　　Amorfrutin可被用作功能性的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑或作為為患者量身定制的溫和性治療[8]。鑒于糖尿病等代謝性疾病的迅速蔓延，我們的目的是進(jìn)一步開(kāi)發(fā)這些物質(zhì)以在未來(lái)用于人體

20、。為了這一目標(biāo)，研究人員必須在對(duì)糖尿病患者的臨床研究中檢測(cè)這些物質(zhì)和植物Amorfrutin提取物的效應(yīng)。</p><p>　　目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室對(duì)紫穗槐果實(shí)里的化學(xué)成分進(jìn)行多種研究。有研究用活性跟蹤法從紫穗槐葉中分離出有效混合物,經(jīng)薄層制備,分離出4種化合物純品。經(jīng)鑒定分別為-脫氫-灰葉酚；脫氫-魚(yú)藤素-灰葉素；脫氫-灰葉酚。對(duì)大皺鰓金龜甲的試驗(yàn)表明,這些化合物中的任何一種,單獨(dú)給藥時(shí),均不具有明顯的殺蟲(chóng)效果,但

21、以一定的比例混合后用藥, 則表現(xiàn)出理想的殺蟲(chóng)效果，可能是協(xié)同作用的結(jié)果[15]。</p><p>　　采用GC—MS對(duì)紫穗槐果實(shí)中揮發(fā)油成分進(jìn)行分析的方法：用揮發(fā)油提取器對(duì)紫穗槐果實(shí)中的揮發(fā)油進(jìn)行了提取和測(cè)定。采用30m X0.25lnln彈性石英毛細(xì)管柱，ND檢測(cè)器，結(jié)合GC-MS，對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行了分析。得到結(jié)論是：紫穗槐果實(shí)揮發(fā)油含量是2．1％，從中分離出30個(gè)化合物，鑒定了其中的26個(gè)成分，并測(cè)定了相對(duì)含量，

22、其主要成分為大牦牛兒烯(11.40％)、13一蒎烯(5.85％)、蒈烯一3(3．02％)、古巴烯(5.84％)、石竹烯(8.40％)、奧(4.49％)、D一偽一旺雪松烯(4.53％)、l，3，3一三甲基一[2,2,1.02,6]三環(huán)已烷(13.63％)[26]。</p><p>　　1.1.2 天然產(chǎn)物提取工藝與方法</p><p>　　近年來(lái)，隨著人們對(duì)天然產(chǎn)物的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)的逐步

23、深入，世界范圍內(nèi)掀起了天然產(chǎn)物中活性成分研究的熱潮，國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目中就有多項(xiàng)是關(guān)于此課題的研究，然而天然產(chǎn)物的成分十分復(fù)雜且有些物質(zhì)含量甚微， 提取時(shí)又要求活性成分不能被破壞，溶劑萃取等傳統(tǒng)提取方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行深入研究的需要。如何快速，有效地將活性成分提取出來(lái)以及對(duì)提取物的進(jìn)一步分離純化已成為天然產(chǎn)物研究的瓶頸,特別是近年來(lái)人們環(huán)保意識(shí)的迅速提高和國(guó)家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的施行，更使得開(kāi)發(fā)新的天然產(chǎn)物提取技術(shù)成為大勢(shì)

24、所趨。目前，科學(xué)工作者在對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)一步改善的同時(shí)，又發(fā)展出了多種新的提取技術(shù)[7]。</p><p>　　對(duì)天然產(chǎn)物中活性成分進(jìn)行提取，最常用的是溶劑萃取法，所用溶劑包括水和有機(jī)溶劑，水能夠溶出的成分較多，導(dǎo)致后處理困難，有機(jī)溶劑分親水性和親脂性兩種，選擇性好，但揮發(fā)性大且一般有毒，提取方法主要有浸漬、滲漉、煎煮、回流和連續(xù)提取，浸漬和滲漉簡(jiǎn)單易行。一般在常溫或溫?zé)釛l件下操作適于熱不穩(wěn)定成分的提取但溶劑消耗量大

25、、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、提取效果差。水煎煮法是我國(guó)最早使用的傳統(tǒng)方法，大部分成分可被不同程度的煎出但具有揮發(fā)性以及遇熱易破壞的成分不宜用此法。用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑加熱提取則需采用回流法。為了彌補(bǔ)回流提取中溶劑消耗量大，操作麻煩的不足，可采用連續(xù)提取，又稱索氏提取法。這是溶劑萃取中最常使用的方法，提取效率較高但提取液受熱時(shí)間長(zhǎng)，熱不穩(wěn)定成分易分解[42]。</p><p>　　近來(lái)發(fā)展的自動(dòng)索氏提取將高溫滲漉與常規(guī)索氏提取相結(jié)合。

26、溶劑用量比常規(guī)索氏提取少一半，且所需時(shí)間大幅度縮短。</p><p>　　水蒸氣蒸餾也是一種常用的提取方法。被提取的成分應(yīng)具備以下條件，具有揮發(fā)性、沸騰期間與水長(zhǎng)時(shí)間共存而不發(fā)生化學(xué)變化、難溶或不溶于水。顯而易見(jiàn)上述傳統(tǒng)方法具有許多缺點(diǎn):</p><p>　　1.大量使用有機(jī)溶劑產(chǎn)生的廢液廢渣嚴(yán)重污染環(huán)境且不可避免的溶劑殘留會(huì)影響產(chǎn)物的質(zhì)量和穩(wěn)定性。</p><p>

27、;　　2.提取效率低，步驟多，選擇性差，較難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化或聯(lián)用提取。</p><p>　　3.溫度高，時(shí)間長(zhǎng),。使得能耗大且易造成熱敏性成分分解和揮發(fā)性成分損失。因此，發(fā)展快速、高效、盡量不用或少用有害試劑、將環(huán)境污染減到最低限度的綠色樣品處理技術(shù)已成為該領(lǐng)域科學(xué)工作者追求的目標(biāo)。</p><p>　　超臨界流體萃取法是近二、三十年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)[42]。目前，在我國(guó)主要用于天然

28、產(chǎn)物中有效成分的提取。超臨界流體是指處于臨界溫度和臨界壓力以上的既非氣態(tài)又非液態(tài)的物質(zhì)，它兼有液體和氣體的優(yōu)點(diǎn)。其密度與液體接近，而密度與溶解能力基本成正比，所以它和液體一樣，很容易溶解其它物質(zhì)。同時(shí)，它的粘度和表面張力很小，只是略高于氣體。這使得溶質(zhì)在其中的擴(kuò)散系數(shù)要比在液體中大得多，在臨界點(diǎn)附近超臨界流體的溫度和壓力發(fā)生微小變化即可導(dǎo)致溶質(zhì)的溶解度發(fā)生幾個(gè)數(shù)量級(jí)的變化。根據(jù)這一特性9可通過(guò)控制體系的溫度和壓力，使各種待萃取組分按它們

29、在超臨界流體中的溶解度大小先后提取出來(lái)。并得到初步分離最常用的超臨界流體。它的化學(xué)性質(zhì)不活潑、無(wú)毒無(wú)味、價(jià)格適中且具有較低的臨界溫度和臨界壓力，是萃取小分子、低極性、親脂性物質(zhì)的理想溶劑。但對(duì)于糖苷，多萜等極性或大分子化合物則顯得無(wú)能為力。加入極性改性劑可使CO2的溶解性和選擇性得以改善。但如何將超臨界流體萃取的應(yīng)用范圍擴(kuò)大到極性甚至離子型物質(zhì)仍是該技術(shù)今后發(fā)展的重要方向之一[42]。</p><p>　　在對(duì)紫

30、穗槐果實(shí)里化學(xué)成分進(jìn)行提取和分離時(shí)，一般采用硅膠柱層析，高速逆流色譜法等方法對(duì)紫穗槐種子的乙酸乙酯提取物進(jìn)行分離，并對(duì)提取化合物進(jìn)行殺菌活性測(cè)定。有研究結(jié)果是從紫穗槐種子的乙酸乙酯提取物中分離得到7個(gè)化合物．分別為5-羥基-7,4-二甲氧基異黃酮、2-羥基-4，4-二甲氧基查耳酮、4一二甲氧基異黃酮、魚(yú)藤酮、2一羥基灰葉素、異灰毛豆酚、異灰葉素。其中魚(yú)藤酮、11一羥基灰葉素、異灰毛豆酚、異灰葉素對(duì)黃瓜霜霉活性較好。 發(fā)現(xiàn)紫穗槐內(nèi)大多數(shù)黃

31、酮類化合物為抗菌性化合物。</p><p>　　超聲波輔助乙醇溶液浸提法和索氏提取法提取新疆地方植物藥材紫穗槐中黃酮化合物并進(jìn)行含量測(cè)定。以蘆丁為對(duì)照品，NaNO2-Al(NO3)3-Na0H體系為顯色劑，利用分光光度法在510nm處測(cè)定提取物中的總黃酮的含量。校準(zhǔn)曲線為A=11．825C-0.0139。r=0.9992。超聲提取法所得總黃酮的含量以蘆丁計(jì)算為2．3562％，索氏提取法所得總黃酮的含量以蘆丁計(jì)算為

32、2．6375％．平均回收率分別為102．16％和96．53％。索氏提取法的提取優(yōu)于超聲波輔助乙醇浸提法，該法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可用于新疆紫穗槐果實(shí)總黃酮的測(cè)定。</p><p>　　在研究紫羅蘭花辯類黃酮化合物的最佳提取工藝時(shí)。有方法是采用顏色反應(yīng)法和紫外一可見(jiàn)光譜法分析紫羅蘭白色品種“艾達(dá)”(Aida)、紅色品種“弗朗西絲克”(Francesco)的花瓣色素，并采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定2種顏色紫羅蘭花瓣類黃酮化合

33、物的最佳提取工藝。 在對(duì)紫穗槐進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化時(shí)，就和紫羅蘭花瓣的提取有不同之處。先硅膠層析，在通過(guò)高速逆流色譜法對(duì)層析后的粗組分進(jìn)行色譜法分離。 </p><p>　　1.2 天然活性產(chǎn)物的分析方法</p><p>　　目前國(guó)際過(guò)內(nèi)對(duì)于從植物等中提取分離的天然活性產(chǎn)物分析方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法、硅膠層析法、和液相色譜法等，其中液相色譜法又包括固液吸附色譜法、液液分配色譜法、離子交換色譜

34、法、凝膠滲透色譜法、離子色譜法等。</p><p>　　1.2.1 液質(zhì)聯(lián)用法</p><p>　　液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度

35、及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。</p><p>　　液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀是以液相色譜為進(jìn)樣分離系統(tǒng)并通過(guò)一定的接口與質(zhì)譜儀耦合到儀器的分析儀器。樣品經(jīng)過(guò)色譜分離后經(jīng)離子源離子化產(chǎn)生帶有一定電荷、質(zhì)量數(shù)的離子，采用不同的質(zhì)量分析器把電離子按質(zhì)荷比（m/z）分開(kāi),得到依質(zhì)量順序排列的質(zhì)譜圖。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜圖的分析處理，進(jìn)行定性、定量分析。液相色譜

36、－質(zhì)譜聯(lián)用儀主要由液相色譜、離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器、真空系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)等幾部分組成。</p><p>　　色譜的優(yōu)勢(shì)在于分離，為混合物的分離提供了最有效的選擇，但其難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)比來(lái)判斷未知物，對(duì)無(wú)紫外吸收化合物的檢測(cè)還要通過(guò)其它途徑進(jìn)行分析。質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進(jìn)行純化，具有一定的純度之后才可以直接進(jìn)行分析。因此，人們期望將色譜與質(zhì)譜聯(lián)接起

37、來(lái)使用以彌補(bǔ)這兩種儀器各自的缺點(diǎn)。 </p><p>　　據(jù)統(tǒng)計(jì)，已知化合物中約80%的化合物是親水性強(qiáng)、揮發(fā)性低的有機(jī)物，熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子，這些化合物的分析不適宜用氣相色譜分析，只能依靠液相色譜。如果能成功地將液相與質(zhì)譜聯(lián)接使用，這一技術(shù)將在生物、醫(yī)藥、化工和環(huán)境等領(lǐng)域大有應(yīng)用前景。為達(dá)到這一目的需要一個(gè)起“接口”作用的裝置將液相與質(zhì)譜聯(lián)接起來(lái)。</p><p>　　這個(gè)接口要

38、解決三個(gè)主要的問(wèn)題：</p><p>　　（1）液相色譜中使用的流速較大，而質(zhì)譜需要一個(gè)高真空環(huán)境工作；</p><p>　?。?）要從流動(dòng)相中提供足夠的離子供質(zhì)譜分析；</p><p>　　（3）去除流動(dòng)相中雜質(zhì)對(duì)質(zhì)譜可能造成的污染。</p><p>　　近年來(lái)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用在技術(shù)及應(yīng)用方面取得了很大進(jìn)展，在環(huán)境、醫(yī)藥研究的各領(lǐng)域應(yīng)用

39、越來(lái)越廣泛，且隨著現(xiàn)代化高新技術(shù)的不斷發(fā)展及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)自身的優(yōu)點(diǎn)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)必將在未來(lái)幾年不斷發(fā)展且發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。</p><p>　　HPLC-MS除了可以分析氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）所不能分析的強(qiáng)極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)： </p><p>　?、俜治龇秶鷱V，MS幾乎可以檢測(cè)所有的化合物，比較容易地解決了分析熱不穩(wěn)定

40、化合物的難題；</p><p>　?、诜蛛x能力強(qiáng)，即使被分析混合物在色譜上沒(méi)有完全分離開(kāi)，但通過(guò)MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別給出它們各自的色譜圖來(lái)進(jìn)行定性定量；</p><p>　?、鄱ㄐ苑治鼋Y(jié)果可靠，可以同時(shí)給出每一個(gè)組分的分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；</p><p>　?、軝z測(cè)限低，MS具備高靈敏度，通過(guò)選擇離子檢測(cè)（SIM）方式，其檢測(cè)能力還可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)

41、以上；</p><p>　?、莘治鰰r(shí)間快，HPLC-MS使用的液相色譜柱為窄徑柱，縮短了分析時(shí)間，提高了分離效果；</p><p>　　⑥自動(dòng)化程度高，HPLC-MS具有高度的自動(dòng)化。</p><p>　　1.2.2 硅膠層析法</p><p>　　硅膠層析是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而使物質(zhì)分離， 一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極

42、性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過(guò)程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過(guò)程。硅膠層析主要用于石油產(chǎn)品的精制，脫除芳烴物質(zhì)或用于中草藥有效成分的分離提純， 硅膠柱層析慣用方法為：</p><p>　?。?）稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。</p><p>　　

43、（2）攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說(shuō)明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預(yù)先用無(wú)水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無(wú)水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對(duì)酸敏感，不能用氯仿體系過(guò)柱。</p><p>　?。?）裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入

44、約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開(kāi)柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降，會(huì)有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi)，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。</p><p>　?。?）壓實(shí)。沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無(wú)論走常壓柱或加壓柱，都應(yīng)進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過(guò)柱時(shí)由于柱床萎縮產(chǎn)生開(kāi)裂。</p><p>　?。?

45、）上樣。干法濕法都可以。海沙是沒(méi)必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團(tuán)脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會(huì)沖壞硅膠表面。</p><p>　?。?）過(guò)柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴(kuò)散和分離之間的權(quán)衡，太低的洗脫強(qiáng)度并不好，推薦用梯度洗脫。例如：10mg試樣量，1g硅膠H，0.5ml餾分；1~2g試樣量，50g硅膠（200-300），20-50ml餾分。</p><p&

46、gt;　　(7）檢測(cè)。要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會(huì)損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。</p><p>　?。?）送譜。收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結(jié)晶。如果樣品太少或?yàn)橐后w，可過(guò)一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。</p><p>　　1.2.3 液相色譜法</p><p>　

47、　液相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)果，而必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照定性。 </p><p>　　當(dāng)無(wú)純物質(zhì)對(duì)照時(shí)，定性鑒定就很困難，這時(shí)需借助質(zhì)譜、紅外和化學(xué)法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析，此缺點(diǎn)可高效液相色譜法來(lái)克服。</p><p>　　液相色譜法的分離機(jī)理是基于混合物中各組分對(duì)兩相親和力的差別。根據(jù)固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜

48、。應(yīng)用最廣的是以硅膠為填料的液固色譜和以微硅膠為基質(zhì)的鍵合相色譜。根據(jù)固定相的形式，液相色譜法可以分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。近年來(lái)，在液相柱色譜系統(tǒng)中加上高壓液流系統(tǒng)，使流動(dòng)相在高壓下快速流動(dòng)，以提高分離效果，因此出現(xiàn)了高效（又稱高壓）液相色譜法：</p><p><b>　　液固吸附色譜</b></p>

49、<p>　　(1)高效液相色譜中的一種，是基于物質(zhì)吸附作用的不同而實(shí)現(xiàn)分離。其固定相是一些具有吸附活性的物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。</p><p>　　(2）液液分配色譜法</p><p>　　基于被測(cè)物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度的差異，通過(guò)溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配以實(shí)現(xiàn)分離。根據(jù)固定相與流動(dòng)相的極性不同，分為正相色譜和反相色譜。前者是用硅膠或極性鍵合相為固定相

50、，非極性溶劑為流動(dòng)相；后者是硅膠為基質(zhì)的烷基鍵合相為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相，適用于非極性化合物的分離。</p><p>　　（3）離子交換色譜法</p><p>　　基于離子交換樹(shù)脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子對(duì)離子交換基具有不同的親和力而實(shí)現(xiàn)分離。薄殼型離子交換樹(shù)脂柱效高，主要用來(lái)分離簡(jiǎn)單的混合物；多孔性樹(shù)脂進(jìn)樣容量大，主要用來(lái)分離復(fù)雜混合物

51、。</p><p>　?。?）凝膠滲透色譜法</p><p>　　又稱為尺寸排阻色譜法 。1959年首先用于生物化學(xué)領(lǐng)域。以溶劑為流動(dòng)相，多孔填料（如多孔硅膠、多孔玻璃）或多孔交聯(lián)高分子凝膠為分離介質(zhì)的液相色譜法。當(dāng)混合物溶液入凝膠色譜柱后，流經(jīng)多孔凝膠時(shí)，體積比多孔凝膠孔隙大的分子不能滲透到凝膠孔隙里去而從凝膠顆粒間隙中流過(guò)，較早地被沖洗出柱外，而小分子可滲透到凝膠孔隙里面去，較晚地被沖

52、洗出來(lái)，混合物經(jīng)過(guò)凝膠色譜柱后就按其分子大小順序先后由柱中流出達(dá)到分離的目的。用凝膠滲透色譜的優(yōu)點(diǎn)是：分離不需要梯度沖洗裝置 ；同樣大小的柱能接受比通常液相色譜大得多的試樣量；試樣在柱中稀釋少，因而容易檢測(cè)；組分的保留時(shí)間可提供分子尺寸信息；色譜柱壽命長(zhǎng)。它的缺點(diǎn)是：不能分離分子尺寸相同的混合物，色譜柱的分離度低；峰容量小；可能有其他保留機(jī)理起作用時(shí)引起干擾。凝膠滲透色譜法為測(cè)定高聚物分子量和分子量分布提供了一個(gè)有效的方法，此外還可用來(lái)

53、分離齊聚物、單體和聚合物添加劑等。</p><p><b>　?。?）離子色譜法</b></p><p>　　采用柱色譜技術(shù)的一種高效液相色譜法，樣品展開(kāi)方式采用洗脫法。根據(jù)不同的分離方式，離子色譜可以分為高效離子色譜 、離子排斥色譜和流動(dòng)相離子色譜3類。高效離子色譜法使用低容量的離子交換樹(shù)脂，分離機(jī)理主要是離子交換。離子排斥色譜法用高容量的樹(shù)脂，分離機(jī)理主要是利用離

54、子排斥原理。流動(dòng)相離子色譜用不含離子交換基團(tuán)的多孔樹(shù)脂，分離機(jī)理主要是基于吸附和離子對(duì)的形成。 </p><p>　　離子色譜儀由淋洗液貯存器 、泵 、進(jìn)樣閥 、分離柱 、抑制柱、電導(dǎo)檢導(dǎo)器和數(shù)據(jù)處理單元等組成。離子色譜儀最重要的部件是分離柱，裝有離子交換樹(shù)脂。抑制柱是抑制型離子色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將淋洗液轉(zhuǎn)變成低電導(dǎo)部分，以降低來(lái)自淋洗液的背景電導(dǎo)，同時(shí)將樣品離子轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的酸或堿，以增加其電導(dǎo)。分離陰

55、離子，抑制柱填充強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；分離陽(yáng)離子，抑制柱填充強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。檢測(cè)器分通用型檢測(cè)器與專用型檢測(cè)器。前者如電導(dǎo)檢測(cè)器，對(duì)檢測(cè)池中所有離子都有響應(yīng)；后者如紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，對(duì)離子具有選擇性響應(yīng)。</p><p>　　1.3 紫穗槐果實(shí)化學(xué)成分和Amorfrutin的研究現(xiàn)狀</p><p>　　紫穗槐原產(chǎn)于美國(guó)、加拿大和墨西哥。這種新的抗糖尿病物質(zhì)因此被命名為Amorf

56、rutin。研究人員利用糖尿病小鼠證實(shí)Amorfrutin不僅具有降低血糖的特性，還具有抗炎效應(yīng)。此外，它們還可以預(yù)防脂肪肝-一種因過(guò)量高脂營(yíng)養(yǎng)引起的常見(jiàn)病[40]?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)紫穗槐果實(shí)等物質(zhì)里所含有的天然活性物質(zhì)具有簡(jiǎn)單的化學(xué)結(jié)構(gòu)。</p><p>　　研究證實(shí)，經(jīng)過(guò)硅膠柱層析、薄層制備色譜、高效制備色譜等分離手段，從紫穗槐果實(shí)的石油醚和醋酸乙酯提取物中分離得到15個(gè)單體化合物。利用理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法，鑒定

57、了其中的12個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)芪類化合物，9個(gè)黃酮類化合物，1個(gè)三萜類化合物和1個(gè)高級(jí)脂肪醇。分別為3,5-二羥基-4-牻牛兒基聯(lián)芐(1)、5,7-二羥基-8-牻牛兒基雙氫黃酮(2)、6a,12a-去氫魚(yú)藤素(3)、6a,12a-去氫-α-毒灰葉酚(4)、灰葉素(5)、去氫色蒙酮(6)、7,4-二甲氧基異黃酮(7)、5-羥基-7,4-二甲氧基異黃酮(8)、7，2，4，5-四甲氧基異黃酮(9)、2-羥基-4，4-二甲氧基查耳酮(

58、10)、β-谷甾醇(11)、正三十碳醇(12)。其中化合物6為一個(gè)新的天然產(chǎn)物，化合物1為首次從豆科植物中分離得到的已知化合物，化合物8、10、11、12為首次從紫穗槐屬中分離得到的已知化合物，化合物2、3、4、5、7、9為首次從中國(guó)產(chǎn)的紫穗槐果實(shí)中分離得到的已知化合物。研究人員利用糖尿病小鼠證實(shí)Amorfrutins不僅具有降低血糖的特性，還具有抗炎效應(yīng)。此外，它們還可以預(yù)防脂肪肝-一種因過(guò)量高脂</p><p&g

59、t;　　沈陽(yáng)化工研究院焦嬌等研究員從植物形態(tài)、果實(shí)性狀、顯微特征、化學(xué)成分等方面對(duì)紫穗槐果實(shí)進(jìn)行了生藥學(xué)研究。通過(guò)硅膠柱層析、薄層制備色譜、高效制備色譜等分離手段，從紫穗槐果實(shí)的石油醚和醋酸乙酯提取物中分離得到15個(gè)單體化合物。利用理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法，鑒定了其中的12個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)芪類化合物，9個(gè)黃酮類化合物，1個(gè)三萜類化合物和1個(gè)高級(jí)脂肪醇。分別為3,5-二羥基-4-牻牛兒基聯(lián)芐(1)、5,7-二羥基-8-牻牛兒基雙氫

60、黃酮(2)、6a;12a-去氫魚(yú)藤素(3)、6a,12a-去氫-α-毒灰葉酚(4)、灰葉素(5)、去氫色蒙酮(6)、7,4-二甲氧基異黃酮(7)、5-羥基-7,4-二甲氧基異黃酮(8)，2,4,5-四甲氧基異黃酮(9)、2-羥基-4，4-二甲氧基查耳酮(10)、β-谷甾醇(11)、正三十碳醇(12)。其中化合物6為一個(gè)新的天然產(chǎn)物，化合物1為首次從豆科植物中分離得到的已知化合物，化合物8、10、11、12為首次從紫穗槐屬中分離得到的已知

61、化合物，化合物2、3、4、5、7、9為首次從中國(guó)產(chǎn)的紫穗槐果實(shí)中分離得到的已知化合物[10]。</p><p>　　1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x</p><p>　　對(duì)于原產(chǎn)于美國(guó)的甘草和紫穗槐果實(shí)中含有的Amorfrutin的抗性研究對(duì)醫(yī)學(xué)有巨大的意義，如果證實(shí)了紫穗槐的果實(shí)中確實(shí)含有Amorfrutin且能通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到最優(yōu)的提取分離方法，那將具有不可估量的價(jià)值。</p>&l

62、t;p>　　本實(shí)驗(yàn)主要目的就是分離鑒定紫穗槐果實(shí)里是否含有Amorfrutin，然后優(yōu)化鑒定和提取工藝。由于Amorfrutin有著抗癌、抗菌等藥物活性，所以對(duì)Amorfrutin的提取對(duì)研研究發(fā)明新的藥物便有了實(shí)際的意義。因此，就需要我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到可行的提取方法，完善提取工藝，以便從國(guó)內(nèi)栽培的紫穗槐果實(shí)里得到更多更純的Amorfrutin，繼而得到高產(chǎn)率的Amorfrutin，最終希望能將研究結(jié)果投入生產(chǎn)，獲得大量高效的Amo

63、rfrutin抗性藥物， </p><p>　　第2章 紫穗槐果實(shí)里Amorfrutin的提取 </p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)儀器裝置和試劑</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用儀器見(jiàn)表2-1，</p><p>　　表2-1主要儀器一覽表</p><p>　

64、　2.1.2 實(shí)驗(yàn)裝置</p><p>　　圖2-1 提取紫穗槐果實(shí)里的Amorfrutin裝置圖</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　　表2-2 主要試劑一覽表</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)原理</b></p><p>　　本

65、實(shí)驗(yàn)采用溶劑萃取法對(duì)紫穗槐果實(shí)里的Amorfrutin進(jìn)行提取。采取的溶劑是無(wú)水乙醇，由于乙醇的揮發(fā)性比較大，因此采用水浴加熱回流。根據(jù)溶劑的互不相溶的性質(zhì)，對(duì)分層后的含Amorfrutin的組分進(jìn)行后處理，用液相質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)提取液里的成分進(jìn)行鑒定。</p><p>　　為優(yōu)化提取工藝，此實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)方案進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。分別為用沒(méi)有粉碎過(guò)的紫穗槐種子，和粉碎過(guò)的紫穗槐種子來(lái)進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。以及采用不同的萃取溶劑，分別

66、對(duì)其提取后的產(chǎn)物的大致的量的比較，以得出紫穗槐果實(shí)里Amorfrutin提取的最佳工藝。 </p><p><b>　　2.4 實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　　方案一：稱取500g紫穗槐種子（種子為顆粒未經(jīng)粉碎），與1000ml乙醇混合于三口燒瓶里，按如圖2-1的裝置圖，在攪拌的條件下水浴83攝氏度加熱并攪拌48小時(shí)（過(guò)程中需定時(shí)的向水浴鍋中填充水，防止水浴

67、鍋因干涸而影響提取溫度）。</p><p>　　冷卻到室溫后，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行抽濾，得到乙醇提取物。然后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到深紅色粘稠液體（在旋蒸的過(guò)程中要注意防止爆沸，加入的提取液不能超過(guò)圓底燒瓶的一半），靜置與燒瓶中，用封口膠封好以防止溶液揮發(fā)。并將乙醇回收利用。對(duì)得到的深紅色粘稠液體再進(jìn)行液相——質(zhì)譜連用分析，觀察進(jìn)樣前和進(jìn)樣后的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度的變化，并做好記錄以備分析。流程圖如圖2-3：</

68、p><p>　　圖2-3 方案一流程圖</p><p>　　方案二：取2000g紫穗槐種子，粉碎后烘干。稱取500g紫穗槐種子粉末（其余留下備用），與1000ml乙醇混合于三口燒瓶里，按圖2-1的裝置進(jìn)行水浴83攝氏度加熱，攪拌48小時(shí)。</p><p>　　冷卻到室溫后，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行抽濾，得到乙醇提取物。然后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到深紅色粘稠液體（在旋蒸的過(guò)程中

69、要注意防止爆沸，加入的提取液不能超過(guò)圓底燒瓶的一半），靜置與燒瓶中，用封口膠封好以防止溶液揮發(fā)。并將乙醇回收利用。對(duì)得到的深紅色粘稠液體再進(jìn)行液相——質(zhì)譜連用分析，觀察進(jìn)樣前和進(jìn)樣后的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度的變化，并做好記錄以備分析。如流程圖2-4：</p><p>　　圖2-4 方案二流程圖</p><p>　　方案三：稱取粉碎過(guò)的500g紫穗槐種子粉末，與1000 ml乙醇混合于三口燒瓶里，

70、按圖2-1的裝置圖，水浴83攝氏度加熱，反應(yīng)48小時(shí)（此方案未進(jìn)行攪拌）。</p><p>　　冷卻到室溫，抽濾，得到乙醇提取物，然后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，后得到深紅色粘稠液體（在旋蒸的過(guò)程中要注意防止爆沸，加入的提取液不能超過(guò)圓底燒瓶的一半），并將乙醇回收利用。</p><p>　　將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的粘稠液體濃縮后分配于5%的鹽酸（HCL）和氯仿（CHCl3 ）溶液，分液漏斗萃取出氯仿層，經(jīng)無(wú)水

71、硫酸鈉(Na2SO4)干燥，抽濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出一定量的氯仿，回收利用（氯仿為毒性有機(jī)物在萃取以及旋蒸的過(guò)程中要注意自我保護(hù)不要大量吸入），得到暗色具有生物活性的油狀液體。將此油狀液體分配于90%的甲醇和石油醚的混合溶液中。用封口膠封好以防止溶液揮發(fā)。對(duì)得到甲醇相進(jìn)行液相——質(zhì)譜連用分析，觀察進(jìn)樣前和進(jìn)樣后的質(zhì)荷比和相對(duì)豐度的變化，并做好記錄以備分析。流程圖如圖2-5。</p><p>　　圖2-5 方案三流程

72、圖</p><p>　　液相質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定過(guò)程：</p><p>　?。?）開(kāi)空氣泵、液相色譜和質(zhì)譜儀電源開(kāi)關(guān)，開(kāi)PC、機(jī)后使其聯(lián)機(jī)成功，之后打開(kāi)真空泵閥門(mén)。</p><p>　?。?）真空度達(dá)到2╳10-5 Pa后，通過(guò)調(diào)諧系統(tǒng)檢查質(zhì)譜運(yùn)行情況。</p><p>　　(3)定液相色譜和質(zhì)譜參數(shù): 選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相，設(shè)置梯度程序及柱

73、溫。選擇離子源模式，設(shè)置質(zhì)譜參數(shù)。數(shù)據(jù)采集的范圍及條件設(shè)置。</p><p>　　(4)按設(shè)定的色譜條件運(yùn)行一遍空程序以檢查基線和本底，若發(fā)現(xiàn)柱子不干凈則應(yīng)沖洗柱子和質(zhì)譜儀，直至基線平穩(wěn)無(wú)峰為止。</p><p>　　(5)PC機(jī)上運(yùn)行設(shè)置好的程序。待工作站顯示儀器狀態(tài)為“Ready”時(shí)，設(shè)置樣品信息，進(jìn)樣。按“Start”鍵，PC機(jī)自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。</p><p>

74、　　(6)運(yùn)行好樣品后，沖洗色譜柱，流動(dòng)相中如含有揮發(fā)性緩沖鹽，用5甲醇沖洗排出流路中可能有的緩沖液。</p><p>　　(7)放真空，再關(guān)液相色譜、質(zhì)譜和PC機(jī)電源。</p><p>　　(8)調(diào)出譜圖，根據(jù)定性及定量分析的需要，分別打開(kāi)離子色譜圖和質(zhì)譜圖，進(jìn)行分析。</p><p><b>　　第3章 結(jié)果與討論</b></p>

75、;<p>　　對(duì)紫穗槐果實(shí)中化合物提取的研究，方案一為直接將購(gòu)進(jìn)的紫穗槐果實(shí)加乙醇溶劑進(jìn)行萃??；方案二為物理對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將紫穗槐果實(shí)經(jīng)粉碎處理后做相同的乙醇萃取處理；方案三再改變萃取條件，對(duì)粉碎處理的紫穗槐果實(shí)用5%的鹽酸和氯仿萃取，再用甲醇萃取處理，最后對(duì)比三種提取方法處理下得到的提取物成分及產(chǎn)量，得到結(jié)論如下：</p><p>　　3.1 為粉碎的紫穗槐果實(shí)的乙醇萃取結(jié)果</p>&

76、lt;p>　　方案一得到如圖3-1、3-2的液相質(zhì)譜圖：</p><p>　　圖3-1未粉碎紫穗槐果實(shí)提取物的乙醇溶液液相譜圖（48h）</p><p>　　圖3-2未粉碎紫穗槐提取物的乙醇溶液質(zhì)譜圖（48h）</p><p>　　圖3-1紫穗槐提取物的乙醇溶液（48h）為以甲醇為流動(dòng)相，ESI源的液相色譜圖，由于使用甲醇為流動(dòng)相，甲醇極性很大，在很短時(shí)間內(nèi)把

77、紫穗槐提取物的乙醇溶液中大部分的有機(jī)成分都洗脫出來(lái)，由此可得一個(gè)總量的大峰，第一幅圖為洗脫出的總的成分的量為紅色曲線；第二幅圖為在相同的時(shí)間進(jìn)度下，Amorfrutin的量的曲線圖，通過(guò)對(duì)比可以看出在總的乙醇所含成的中，Amorfrutin所占的比重可達(dá)70~80%。第二幅圖中的相對(duì)分子質(zhì)量339為Amorfrutin的碳的同位素的化合物。</p><p>　　從圖3-2紫穗槐提取物的乙醇溶液質(zhì)譜圖（48h）可以

78、看出，由原來(lái)未進(jìn)樣前的質(zhì)荷比(m/z)為：301.0，310.9，313.0，319.7，350.1，369.0，變?yōu)閳D上的309.0，315.1，326.1，339.0，341.1，342.1，在所測(cè)樣進(jìn)入色譜儀中之后，大約半分鐘內(nèi)質(zhì)荷比為質(zhì)荷比(m/z)為339.0以及質(zhì)荷比340的峰逐漸增高，之后的一段時(shí)間內(nèi)340的相對(duì)豐度與其他峰的比值接近10:1。其中質(zhì)荷比(m/z)為339.0為Amorfrutin裂解掉一個(gè)H自由基所得質(zhì)荷

79、比，340為Amorfrutin未裂解的質(zhì)荷比，兩者的相對(duì)豐度與其他峰比較相差巨大，有力的證明了在我們本土生長(zhǎng)的紫穗槐種子中，含有一定量的Amorfrutin，而具體的 Amorfrutin A、Amorfrutin B的分類則有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的分析。</p><p>　　3.2 粉碎處理的紫穗槐果實(shí)的乙醇萃取結(jié)果</p><p>　　方案二得到如圖3-3、3-4的液相質(zhì)譜圖：</p&

80、gt;<p>　　圖3-3粉碎紫穗槐提取物的乙醇溶液液相譜圖(48h)</p><p>　　圖3-4粉碎紫穗槐提取物的乙醇溶液質(zhì)譜圖（48h）</p><p>　　圖3-3紫穗槐提取物的乙醇溶液（48h）為以甲醇為流動(dòng)相，ESI源的液相色譜圖，由于使用甲醇為流動(dòng)相，甲醇極性很大，在很短時(shí)間內(nèi)把紫穗槐提取物的乙醇溶液中大部分的有機(jī)成分都洗脫出來(lái)，由此可得一個(gè)總量的大峰，第一幅圖

81、為洗脫出的總的成分的量為紅色曲線；在相同反應(yīng)量以及相同反應(yīng)條件的情況下，由圖3-3的液相色譜圖可以看出最高峰值要比未粉碎的種子提取物高10 G Counts，可以說(shuō)明種子經(jīng)過(guò)粉碎之后提取效果明顯好于未粉碎的。</p><p>　　從圖3-4紫穗槐提取物的乙醇溶液質(zhì)譜圖（48h）可以看出，由原來(lái)未進(jìn)樣前的質(zhì)荷比(m/z)為：301.0，313.0，310.9，319.0，324.0，339.0，350.1，369.

82、0（其中339.0為上一個(gè)樣中殘留的待測(cè)物的峰值）逐漸變?yōu)?39.0、350.1直到最后完全為質(zhì)荷比(m/z)為339.0，340.0的峰，圖2-5可以看出以質(zhì)荷比(m/z)為339.0與其他峰相比相對(duì)豐度比值接近10：1，有力的證明了在我們本土生長(zhǎng)的紫穗槐種子中，含有一定量的Amorfrutin。</p><p>　　3.3 粉碎處理的紫穗槐果實(shí)甲醇萃取結(jié)果</p><p>　　由方案三

83、得到3-5和3-6的質(zhì)譜圖：</p><p>　　方案三得到3-5和3-6兩個(gè)質(zhì)譜圖。</p><p>　　圖3-5 粉碎紫穗槐提取物的甲醇溶液液相譜圖(48h)</p><p>　　圖3-6粉碎紫穗槐提取物的甲醇溶液質(zhì)譜圖（48h）</p><p>　　圖3-5粉碎后的紫穗槐種子提取物的甲醇溶液（48h）是以甲醇為流動(dòng)相，ESI源的液相色譜

84、圖，由于使用甲醇為流動(dòng)相，甲醇極性很大，在很短時(shí)間內(nèi)把紫穗槐提取物的甲溶液中大部分的有機(jī)成分都洗脫出來(lái)，由此可得一個(gè)總量的大峰，第一幅圖為洗脫出的總的成分的量為紅色曲線；第二幅圖為在相同的時(shí)間進(jìn)度下，Amorfrutin的量的曲線圖，通過(guò)對(duì)比可以看出在總的甲醇中所含成的Amorfrutin所占的比重約60~70%，由此可知在甲醇的萃取液中含有大多數(shù)的Amorfrutin，證明萃取步驟正確活性物質(zhì)在甲醇相。</p><

85、p>　　從圖3-6粉碎后的紫穗槐種子提取物的乙醇溶液質(zhì)譜圖（48h）可以看出，由原來(lái)未進(jìn)樣前的質(zhì)荷比(m/z)：301.0、311.0、313.0、339.0、350.1、369.0（其中339.0為上一個(gè)樣中殘留的待測(cè)物的峰值）變?yōu)閳D上的324.1、338.2、339.0、340.0、363.1，在所測(cè)樣進(jìn)入色譜儀中之后，大約半分鐘內(nèi)質(zhì)荷比為339.0以及質(zhì)荷比340的峰逐漸增高，之后的一段時(shí)間內(nèi)質(zhì)荷比(m/z)為339的相對(duì)豐

86、度與其他峰的比值接近20:1。其中339.0為Amorfrutin裂解掉一個(gè)H自由基所得質(zhì)荷比，質(zhì)荷比(m/z)為340為Amorfrutin未裂解的質(zhì)荷比，兩者的相對(duì)豐度與其他峰比較相差巨大，有力的證明了在萃取后的甲醇溶液中，含有一定量的Amorfrutin，由此證明萃取方法的正確性，而具體的 Amorfrutin A、Amorfrutin B的分類則有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的分析。</p><p>　　而對(duì)于甲醇萃取液

87、的進(jìn)一步處理，在本文中沒(méi)有提及。下一階段的具體實(shí)驗(yàn)將對(duì)甲醇萃取液進(jìn)行進(jìn)一步處理。將甲醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸出一定量的甲醇，控制剩余溶液的量，以便過(guò)硅膠柱。通過(guò)過(guò)柱分出含有Amorfrutin范圍的幾個(gè)點(diǎn)，在進(jìn)一步過(guò)柱洗脫出Amorfrutin，但目前存在一個(gè)問(wèn)題我們沒(méi)有Amorfrutin純產(chǎn)品，所以無(wú)法對(duì)紫穗槐種子中Amorfrutin的含量進(jìn)行定量分析，過(guò)柱分離也存在一定難度（因無(wú)法對(duì)其極性進(jìn)行判斷，導(dǎo)致薄層色譜分析無(wú)法確定產(chǎn)物），現(xiàn)在

88、一方面尋求得到Amorfrutin純品，另一方面對(duì)其洗脫出的各種物質(zhì)進(jìn)行鑒定，來(lái)判斷何種產(chǎn)物為Amorfrutin。</p><p><b>　　3.4 總結(jié)</b></p><p>　　通過(guò)以上三步不同條件下的實(shí)驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，可以初步確定紫穗槐種子里含有Amorfrutin并且其含量遠(yuǎn)大于前期預(yù)測(cè)值。通過(guò)第一步和第二步進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)粉碎后的紫穗槐種子提

89、取出來(lái)的目標(biāo)產(chǎn)物要多于未粉碎過(guò)的紫穗槐種子。由于粉碎后的紫穗槐種子粉末在燒瓶里顆粒較小，粘性比較大，導(dǎo)致不易攪拌，而且影響到實(shí)驗(yàn)裝置的氣密性，導(dǎo)致乙醇的大量揮發(fā)。為解決此問(wèn)題，在第三步實(shí)驗(yàn)里面通過(guò)采用不攪拌進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，提取紫穗槐種子里的Amorfrutin。由圖3-5和圖3-6里面產(chǎn)物的相對(duì)豐度可以看出，不攪拌和攪拌的反應(yīng)結(jié)果提取物產(chǎn)量相差不大，且Amorfrutin大多數(shù)存在于甲醇相中，對(duì)紫穗槐種子中Amorfrutin的進(jìn)一步提取

90、提供了有效的數(shù)據(jù)。</p><p><b>　　第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)論</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)是與Amorfrutin的合成工作同時(shí)進(jìn)行的，而Amorfrutin的提取成功能很大的促進(jìn)Amorfrutin的合成工作，具有很大的實(shí)際意義。而本次實(shí)驗(yàn)只是做了定性的研究，證實(shí)了紫穗槐果實(shí)中確實(shí)含有Amorfrutin，且將紫穗槐果實(shí)粉碎處理后得到的產(chǎn)率更高，用5%鹽

91、酸及二氯亞砜和甲醇萃取處理的紫穗槐果實(shí)中提取到更多的Amorfrutin，證明經(jīng)粉碎處理，用甲醇萃取的提取方法更為高效可行。但是至此也只做了定性的研究，后期更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)則是希望能能對(duì)相關(guān)方法及提取產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，從紫穗槐的果實(shí)中定量提取大量的Amorfrutin產(chǎn)物且提取工藝方法成熟高效。</p><p><b>　　具體實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：</b></p><p>　

92、　（1）國(guó)內(nèi)栽培的紫穗槐果實(shí)里也含有活性物質(zhì)Amorfrutin。</p><p>　?。?）提取紫穗槐果實(shí)里的Amorfrutin時(shí)，把果實(shí)粉碎后，效果更好，而且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不必?cái)嚢?，更方便?shí)驗(yàn)操作。</p><p>　　（3）用溶劑萃取法對(duì)紫穗槐果實(shí)里的Amorfrutin進(jìn)行提取時(shí)可用乙醇做溶劑。經(jīng)鹽酸和氯仿萃取后，再用甲醇和石油醚進(jìn)行萃取，在甲醇相里可得到所要提取的Amorfrut

93、in。</p><p><b>　　致謝 </b></p><p>　　經(jīng)過(guò)三個(gè)月的實(shí)驗(yàn)和論文寫(xiě)作時(shí)間，畢業(yè)論文即將告一段落，也意味著四年大學(xué)生活即將結(jié)束。在這里要感謝一直在幫助著我的老師和同學(xué)。這篇論文是在我的導(dǎo)師王超教授的多次指導(dǎo)下完成的。從論文的選題到結(jié)構(gòu)安排，從內(nèi)容到文字潤(rùn)飾，都凝聚了他大量的心血。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周一次大型的組會(huì)，耐心的給我們解決實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

94、遇到的問(wèn)題，與我們討論實(shí)驗(yàn)方法，給我提出切實(shí)可行的指導(dǎo)性建議，并細(xì)心全面地修改了我的論文。王老這種一絲不茍的負(fù)責(zé)精神，使我深受感動(dòng)。 在此，請(qǐng)?jiān)试S我向尊敬的王超老師表示真摯的謝意！ </p><p>　　在這里要特別感謝幫我校正文字和排版的孔雅俊學(xué)姐，謝謝你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中帶給我無(wú)限多的幫助。尤其是在寫(xiě)畢業(yè)論文的時(shí)候，因?yàn)槲业牟ㄆ辗治鲆獜拈_(kāi)始學(xué)習(xí)，遇到了很多困難的時(shí)候，謝謝你耐心地幫我講解波普書(shū)上我不懂的知識(shí)。這

95、篇論文能夠按時(shí)完成，與您有著重大的關(guān)系。謝謝你為了我可以盡快地完成論文事宜犧牲了自己的寶貴休息時(shí)間，熬夜加班的幫著我分析圖譜。</p><p>　　感謝我的伙伴 ，柴曉麗同學(xué)。感謝你反復(fù)的幫我檢查論文格式，幫我排版，是你在我失意時(shí)給我鼓勵(lì)，在我失落時(shí)給我支持，感謝你和我一路走來(lái)，我們不僅是實(shí)驗(yàn)的伙伴，也是同學(xué)，朋友。你是最棒的！</p><p>　　最后，再次感謝為我們默默地?zé)o私奉獻(xiàn)自己的

96、各位老師，老師們辛苦了！ </p><p>　　衷心祝愿母校師大的明天更加美好！ </p><p><b>　　參考文獻(xiàn) </b></p><p>　　[1] A Concise Synthesis of (+)-SCH351448 Soltani, Omid; De Brabander, Jef K.Department</p&g

97、t;<p>　　of Biochemistry, The University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas Dallas，</p><p>　　USA 75390-9038</p><p>　　[2] Total synthesis of amorfrutin A via a palladium-cataly

98、zed migratory prenylation–</p><p>　　aromatization sequence Sylvain Laclef, Katie Anderson, Andrew J. P. White, Anthony </p><p>　　G. M. Barrett Department of Chemistry, Imperial College, London

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103、shi Nakatab</p><p>　　and Fumio Sugawaraa,</p><p>　　[7] 紫穗槐種子殺菌活性成分的提取、分離與鑒定 焦姣，孫慧，蘭杰，沈麗紅，黃成田，王遠(yuǎn)，胥維昌，沈陽(yáng)化工研究院有限公司，沈陽(yáng)110021</p><p>　　[8] 李儀奎．中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991,5,13．</p>

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