熊果苷中間體單乙酰對苯二酚的制備[畢業(yè)設(shè)計+開題報告+文獻(xiàn)綜述]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　熊果苷中間體單乙酰對苯二酚的制備 </p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程 &l

2、t;/p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要: 由于熊果苷對黑色素合成酶酪氨酸酶有很好抑制效果，對人體肌膚有良好的美

3、白作用，因而在化妝品中得到廣泛作用。由于天然提取法工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、不能大規(guī)模生產(chǎn)，人工合成法是熊果苷的主要制備方法。本文綜述了熊果苷的合成與檢測方法的研究進(jìn)展，通過有機(jī)合成法 ，酶合成法和生物轉(zhuǎn)化法等3種合成熊果苷方法的比較，闡述有機(jī)合成法是制備熊果苷的主要方法 。</p><p>　　本論文擬在重復(fù)文獻(xiàn)報道的單乙酰對苯二酚制備方法的基礎(chǔ)上設(shè)計一條新的合成路線，避免文獻(xiàn)方法中選擇性差的缺點。</p&g

4、t;<p>　　關(guān)鍵詞: 熊果苷，單乙酰對苯二酚，合成</p><p>　　Abstract: Arbutin is widely used a cosmetic additives since its inhibiting effect on human tyrosinase and skin whitening properties. However , artificial synthesi

5、s becomes the dominantmeans of arbutin because of the complicated procedures and the high cost of extracting from natural plant . The developments of both arbutin synthesis and determination method were in troduced here.

6、 It was found that organic synthesis was the main method for preparation of arbutin by comparing the three ap -proach</p><p>　　To avoid the literature method selectivity shortcomings, this thesis intends to

7、design a new synthetic route based on the reported method for preparation of朗讀 single-acetyl hydroquinone. </p><p>　　Keywords: arbutin; Single-acetyl hydroquinone; synthesis顯示對應(yīng)的拉丁字符的拼音</p><p>&

8、lt;b>　　字典</b></p><p><b>　　名詞 </b></p><p><b>　　化驗</b></p><p><b>　　試金</b></p><p><b>　　動詞 </b></p><p>

9、;<b>　　檢察</b></p><p>　　朗讀顯示對應(yīng)的 字名詞 化驗</p><p><b>　　試金</b></p><p><b>　　動詞 </b></p><p><b>　　檢察</b></p><p>

10、<b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要…………………………………………………………………………………………………… Ⅰ </p><p>　　Abstract……………………………………………………………………………………………… Ⅱ</p><p><b>　　1 緒論1</b></p

11、><p>　　1.1 選題的背景和意義1</p><p>　　1.2 相關(guān)研究的最新成果及動態(tài)1</p><p>　　1.2.1 天然產(chǎn)物提取法1</p><p>　　1.2.2 植物組織培養(yǎng)法2</p><p>　　1.2.3 酶轉(zhuǎn)化法3</p><p>　　1.2.4 化學(xué)合成法4&

12、lt;/p><p><b>　　2 實驗部分5</b></p><p>　　2.1 合成路線5</p><p>　　2.1.1 直接制備法5</p><p>　　2.1.2 間接制備法5</p><p>　　2.2 單乙酰對苯二酚的制備過程5</p><p>　　

13、2.2.1 單芐基對苯二酚6</p><p>　　2.2.2 單芐基乙酰對苯二酚6</p><p>　　2.2.3 單乙酰對苯二酚6</p><p>　　3 結(jié)果與分析7</p><p>　　3.1 實驗結(jié)果7</p><p>　　3.2 實驗分析7</p><p><b

14、>　　4 結(jié)論8</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)9</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 選題的背景和意義</p><p>　　熊果苷作為一種

15、天然存在的化學(xué)物質(zhì)，首次發(fā)現(xiàn)于熊果屬的植株葉子中。該屬植物主要分布于西歐、北美一帶，國內(nèi)未有其分布的報道。以后的研究發(fā)現(xiàn)，在杜鵑花科、薔薇科以及虎耳草科等不同屬種的植株中也發(fā)現(xiàn)有熊果苷的存在。</p><p>　　熊果苷化學(xué)名稱為對羥基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子結(jié)構(gòu)如圖l所示。</p><p>　　其藥理活性報道有利尿、抗菌并與可待因(codeine)具有等效的鎮(zhèn)咳效果[1,2]。自

16、20世紀(jì)90年代以來，研究者發(fā)現(xiàn)熊果苷作為酪氨酸酶的抑制劑，能阻斷多巴以及多巴醌的合成，從而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且對皮膚沒有刺激性，毒副作用小[3]。熊果苷作為美白劑廣泛應(yīng)用于化妝品中，國內(nèi)外市場需求十分巨大，是美白祛斑類化妝品的首選主要原料。</p><p>　　熊果苷與其他傳統(tǒng)性美白劑(如汞鹽。壬二酸、對丞二酸、對丞二酸草丞醚)相比較祛斑效果高，安全無毒，使用方便等優(yōu)點，它呈集“綠色植物”安

17、全可靠。配伍性好，高效脫色</p><p>　　二者合一于體的皮膚美白劑。是本世紀(jì)末新興起來的新型的距世紀(jì)產(chǎn)品．頗有時代的特色。</p><p>　　1.2 相關(guān)研究的最新成果及動態(tài) </p><p>　　熊果苷在護(hù)膚用品和發(fā)用制品方面有廣泛的用途[4]。 近幾年來, 國內(nèi)熊果苷的生產(chǎn)和相關(guān)化妝品的開發(fā)有了迅速的發(fā)展, 國外對熊果苷的研究和開發(fā)更為深入, 并取得了許

18、多進(jìn)展。這些進(jìn)展包括: ①作用機(jī)理的研究; ②化妝品處方中與熊果苷配伍的其他活性物質(zhì); ③治療作用; ④衍生物; ⑤熊果苷的來源和制備方法。這里主要介紹制備方法的進(jìn)展。</p><p>　　1.2.1 天然產(chǎn)物提取法</p><p>　　主要利用鉛鹽法[5]。其一般步驟是：含熊果苷的植物葉子采集加工→用乙醇或水作萃取→將萃取液過濾，并將過濾物洗滌，合并濾液→將濾液用飽和的中性乙酸鉛水溶液處

19、理，沉淀其中的有機(jī)酸、酚酸、鞣酸、黃酮類等成分，生成不溶性鉛鹽沉淀→濾出沉淀，濾液用堿性鉛水溶液使熊果苷生成非水溶性鉛鹽沉淀→濾出沉淀，懸浮于蒸餾水中，向懸浮液通入硫化氫氣體，生成膠態(tài)的硫化鉛沉淀，調(diào)節(jié)pH，防止熊果苷水解→將硫化鉛膠狀沉淀用抽濾法抽出，濾物水洗，合并濾液→將濾液減壓濃縮，即可離析出滿足化妝品之需的熊果苷晶體。1996年，Matsuda等從六種熊果葉中得50%乙醇提取物[6]，進(jìn)一步分離后得到熊果苷粗品，占熊果葉干重的5

20、%左右。</p><p>　　也可采用柱層析法。利用大孔吸附樹脂分離等現(xiàn)代分離手段，從萃取液中得到熊果苷。但是這方面的研究未見報道。</p><p>　　熊果苷在熊果葉中的含量低，分離步驟繁多，提取物中熊果苷的純度不高，故經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價值不大。但是由于現(xiàn)代人追求純天然綠色化妝品的理念，仍然有廠家從植物葉子中提取天然熊果苷，作為高檔美白化妝品中的添加劑。</p><p>

21、　　由于含熊果苷的天然植物來源困難，近年來興起利用植物細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)熊果苷的研究。</p><p>　　1.2.2 植物組織培養(yǎng)法</p><p>　　該方法主要是利用植物細(xì)胞強大的糖基化能力，將外源氫醌轉(zhuǎn)化為熊果苷。</p><p>　　1992年，橫山峰幸[7]報道說，在長春花(Catharanthus roseus)植物細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中加入氫醌，可制得熊果苷。

22、該研究表明，細(xì)胞培養(yǎng)時間及添加氫醌的時機(jī)對產(chǎn)率的影響極大，該文獻(xiàn)所報道的熊果苷最高產(chǎn)率為9.2g/L。</p><p>　　林口能孝[8]等利用長春花細(xì)胞培養(yǎng)法合成熊果苷。該方法將長春花細(xì)胞在培養(yǎng)基中于暗處搖床培養(yǎng)8天，過濾，將收集的細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)四天，新培養(yǎng)基中加入濃度為22g/L的氫醌水溶液，可得到147mg熊果苷／g(細(xì)胞干重)。</p><p>　　在國內(nèi)，2001年趙明

23、強[9]等研究者報道了應(yīng)用人參毛狀根細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷的方法。該研究表明，培養(yǎng)22天的人參毛狀根細(xì)胞更換含氫醌底物的培養(yǎng)基后，氫醌濃度為2mmol/L，持續(xù)轉(zhuǎn)化24小時后，所合成的熊果苷占細(xì)胞干重的13%，轉(zhuǎn)化率可達(dá)89%。該方法采用人參毛狀根細(xì)胞合成熊果苷的優(yōu)點是，終產(chǎn)物只需進(jìn)行簡單的處理即可添加于化妝品中，因為人參細(xì)胞本身也含有多種活性物質(zhì)，如人參皂甙等，適應(yīng)化妝品的要求。以人參細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷為特色的丁家宣美白化妝品在市場上取得

24、很大的成功。</p><p>　　利用植物組織培養(yǎng)法生產(chǎn)天然藥物，是近來生物技術(shù)研究熱點之一。它的優(yōu)點是不受環(huán)境生態(tài)和氣候條件的限制，增殖速度比整個植株栽培快很多。目前，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)熊果苷，轉(zhuǎn)化率較高，主要存在的問題是生產(chǎn)周期過長，有用物質(zhì)含量較少，造成后續(xù)分離困難。對植物細(xì)胞生長的機(jī)理了解不夠深入，往往是憑經(jīng)驗控制氫醌的添加時機(jī)。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷是今后研究熱點之一。</p>&l

25、t;p>　　1.2.3 酶轉(zhuǎn)化法</p><p>　　該法主要以糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶作為催化劑，通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)或逆水解反應(yīng)合成熊果苷。</p><p>　　1.2.3.1 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)</p><p>　　Glycosyl-OR1+ R20H ? Glycosyl-OR2十H-OR</p><p>　　對于上述反應(yīng)而言，酶底物為雙糖或者多糖

26、，發(fā)生糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，離去基團(tuán)為糖基，反應(yīng)為動力學(xué)控制。水作為競爭性親核物質(zhì)，可發(fā)生水解副反應(yīng)。</p><p>　　糖基轉(zhuǎn)移酶能特異性地催化糖基從糖基供體如UDP衍生物轉(zhuǎn)移到目標(biāo)產(chǎn)物，該酶催化效率很高，但由于反應(yīng)所需的糖基供體十分昂貴，因此它們在體外的應(yīng)用很少。</p><p>　　1995年，Ping Wang等人報道[10]說，利用從牛肝中提取的葡萄糖苷酶，催化氫醌與對硝基苯葡萄糖苷之

27、間的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，生成熊果苷。該反應(yīng)能在8小時后使65%的氫醌轉(zhuǎn)化為熊果苷。轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)的效率很高，限制其大規(guī)模應(yīng)用的原因是活性糖苷中間體對硝基苯葡萄糖苷過于昂貴。</p><p>　　1.2.3.2 逆水解反應(yīng)</p><p>　　Glycosyl-OH+ R1OH?Glysoyl-OR1+ H2O</p><p>　　對于上述反應(yīng)而言，當(dāng)酶底物為單糖時，發(fā)生可逆水解

28、反應(yīng)。該反應(yīng)是熱力學(xué)控制。</p><p>　　β-葡萄糖苷酶能催化合成單一異構(gòu)體的糖苷。通過控制反應(yīng)條件，可在非水相中催化糖苷水解酶逆水解反應(yīng)合成糖苷，該方法是舍成且一葡萄糖苷特別有吸引力的方法。</p><p>　　1993年，下出綾子等人報道[11]說，30%(質(zhì)量／體積)的葡萄糖溶液和10%(質(zhì)量／體積)的氫醌溶液，用β-葡萄糖苷酶催化，在pH5以及40℃環(huán)境下保持72小時，得0.

29、 11%的熊果苷。</p><p>　　1994年，荒川博邦[12]等人利用商品纖維素酶Tamano將氫醌與纖維素轉(zhuǎn)化為熊果苷。據(jù)其報道，7%（質(zhì)量／體積）的氫醌和5%（質(zhì)量／體積）的濾紙粉，在該酶作用下，40℃培養(yǎng)96小時，得到8mg熊果苷與5mg氫醌-O-β-D纖維二糖。</p><p>　　總體來說，有關(guān)非水相中糖苷酶逆水解反應(yīng)合成熊果苷的相關(guān)文獻(xiàn)不是很多，所得熊果苷的產(chǎn)率也較低。這

30、可能是由于氫醌的對羥苯基的空間位阻效應(yīng)比較大，同時由于反應(yīng)物在有機(jī)溶劑中的溶解度比較小，阻礙了熊果苷的生成。</p><p>　　通過非水相中逆水解法酶法合成熊果苷只需要一步反應(yīng)，且能保持反應(yīng)物的立體構(gòu)型，不需要進(jìn)一步拆分，因此可以大大節(jié)省后續(xù)提取成本。該方法發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｕ业胶线m的酶源以及提高逆水解合成的收率是今后研究的重點。</p><p>　　1.2.4 化學(xué)合成法</p>

31、;<p>　　該法主要以葡萄糖與氫醌為原料，通過化學(xué)法合成熊果苷?；瘜W(xué)合成法采用經(jīng)典的Koenigs-Knorr反應(yīng)，即將葡萄糖乙?；俳?jīng)過溴取代后得到溴代四乙酰葡萄糖，然后再與單側(cè)鏈保護(hù)氫醌在堿性催化劑作用下縮合得到五乙酰葡萄糖，脫乙?；玫叫芄?。反應(yīng)過程如下圖所示：</p><p>　　最早關(guān)于熊果苷化學(xué)合成的報道[13]是應(yīng)用溴化銀，喹琳為催化劑，溴代四乙酰葡萄糖與氫醌單芐酯縮合，再經(jīng)脫乙酰

32、基和苯甲酰基制得熊果苷。該方法由于試劑較貴，反應(yīng)步驟較多，已不常用。</p><p>　　邵潁[14]等人報道了以三氯氧磷為催化劑，五乙酰葡萄糖與氫醌單芐基醚縮合，再經(jīng)脫乙醚基團(tuán)，芐基制得熊果苷。該方法由于其關(guān)鍵反應(yīng)試劑對苯甲氧基苯酚需自己合成，且產(chǎn)率不高，限制了該法的進(jìn)一步發(fā)展。</p><p>　　李雯等人報道用相轉(zhuǎn)移催化劑合成熊果苷[15]。該方法利用溴代四乙酰葡萄糖與單乙酰氫醌，經(jīng)

33、相轉(zhuǎn)移催化得到五乙酰熊果苷，再經(jīng)甲醇鈉一甲醇體系脫保護(hù)基后得到熊果苷。該方法的關(guān)鍵步驟是單乙酰氫醒的合成，控制反應(yīng)體系中氫醌與乙酸酐的物料比，是反應(yīng)成功的關(guān)鍵。另有應(yīng)用有機(jī)錫化合物脫乙酰保護(hù)基的報道。</p><p>　　化學(xué)法合成熊果苷都需要加保護(hù)基團(tuán)和脫保護(hù)基團(tuán)的步驟。但是利用化學(xué)法合成相對而言收率較高，成本較低，是市場上大部分熊果苷的來源。</p><p><b>　　2

34、 實驗部分</b></p><p>　　2.1 合成路線 </p><p>　　2.1.1 直接制備法</p><p>　　對苯二酚與乙酸酐直接反應(yīng)，選擇性地與其中一個羥基發(fā)生乙?；频脝我阴Ρ蕉印?lt;/p><p>　　圖2-1直接制備法合成單乙酰對苯二酚</p><p>　　在反應(yīng)瓶中加入2mol/

35、L NaOH水溶液20mL，對苯二酚3.3g（0.03mol），冰浴，劇烈攪拌，緩慢滴加乙酸酐2g（0.02mol），反應(yīng)1h，用氯仿提取，水洗至中性，干燥，減壓蒸干，用無水乙醇分步結(jié)晶，除去雙乙酰對苯二酚，蒸發(fā)得固體0.83g，收率18.1%，m.p. 61~62℃。</p><p>　　此方法合成路線短，但選擇性差，產(chǎn)物中大部分為雙乙?；a(chǎn)物，且兩種化合物較難分離。</p><p>　

36、　2.1.2 間接制備法</p><p>　　針對以上方法中的不足本論文設(shè)計了新的單乙酰對苯二酚制備方法——間接制備法。該方法使用芐基保護(hù)基對兩個酚羥基中的一個進(jìn)行保護(hù)，由于芐基體積較大，所以單芐基化選擇性高，基本不產(chǎn)生雙芐基化產(chǎn)物，然后再對另外一個位發(fā)生芐基化反應(yīng)的酚羥基進(jìn)行乙?；磻?yīng)，最后脫去芐基保護(hù)基，得到目標(biāo)產(chǎn)物單乙酰對苯二酚。該方法雖然路線長，但選擇性好，產(chǎn)品純度高，避免了多次分步重結(jié)晶的提純操作，與直

37、接制備法相比有一定地優(yōu)越性。</p><p>　　圖2-2 間接法制備單乙酰對苯二酚</p><p>　　2.2 單乙酰對苯二酚的制備過程</p><p>　　2.2.1 單芐基對苯二酚</p><p>　　取100ml三口瓶一只，配備溫度計、回流冷凝管、滴液漏斗。向其中依次加入1，4-苯二酚3.3g（0.03mol），乙醇11ml，氯芐3.

38、45ml（0.03mol），加熱至85℃使固體溶解。取1.4gNaOH放入50ml小燒杯中，加入3.3ml乙醇及3.3ml水，攪拌使溶解。將溶解好的溶液倒入滴液漏斗滴入三口瓶中（1滴/秒）。滴完后，88℃回流反應(yīng)1.5h。停止反應(yīng)，冷卻降溫。將放冷的反應(yīng)液倒入100ml冰水中，調(diào)節(jié)pH 3~4（稀HCl）。抽濾，取濾液放入250ml燒杯中。向燒杯中加入1mol/L NaOH 50ml，攪拌10min。抽濾，取濾液。用稀HCl將濾液pH調(diào)

39、至2。抽濾、水洗、取濾餅、干燥。乙醇重結(jié)晶，干燥得到類白色小葉狀晶體3.789g，收率63.2%，m.p. 119.9~120.4℃。</p><p>　　2.2.2 單芐基乙酰對苯二酚</p><p>　　在50ml帶有回流冷凝管，溫度計及玻璃塞的三口瓶中，加入單氫醌芐醚2.0g（0.01mol），1mol/L NaOH 15ml，攪拌溶解。將反應(yīng)液冷卻至0~5℃。用滴液漏斗滴加Ac2O

40、至上述反應(yīng)液中（注意，滴加速度控制t=0~5℃），滴畢0~5℃反應(yīng)1h，得白色懸濁液，抽濾，干燥后得白色粉末狀固體1.95g，產(chǎn)率：71.7%。</p><p>　　2.2.3 單乙酰對苯二酚</p><p>　　將4-芐氧基苯酚乙酯2.72g（0.01mol）溶于無水甲醇(20ml)，加入5％Pd-C(0.8g)，于60℃/3.5MPa 下氫化4h，濾除催化劑，減壓蒸干，殘余物溶于乙腈(

41、5ml)，回流攪拌下滴加乙酸乙酯至稍顯渾濁，降至室溫，冰箱放置過夜，過濾，濾餅用乙酸乙酯洗，干燥得白色固體單乙酰對苯二酚1.33g，產(chǎn)率87.5%。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 實驗結(jié)果 </p><p>　　本論文針對文獻(xiàn)路線的不足，使用芐基保護(hù)基對兩個酚羥基中的一個進(jìn)行保護(hù)，由于芐基

42、體積較大，所以單芐基化選擇性高，基本不產(chǎn)生雙芐基化產(chǎn)物，然后再對另外一個位發(fā)生芐基化反應(yīng)的酚羥基進(jìn)行以?；磻?yīng)，最后脫去芐基保護(hù)基，得到目標(biāo)產(chǎn)物單乙酰對苯二酚。該方法雖然路線長，但選擇性好，產(chǎn)品純度高，避免了多次分步重結(jié)晶的提純操作，與直接制備法相比有一定地優(yōu)越性。</p><p><b>　　3.2 實驗分析</b></p><p>　　1、經(jīng)過多次反應(yīng)，確定了重

43、結(jié)晶時乙醇的比例。由于反應(yīng)收率穩(wěn)定，以對苯二酚投料量確定重結(jié)晶乙醇用量為3.3g：8.75ml。</p><p>　　2、產(chǎn)物純度的定性分析</p><p>　　圖3-1是對苯二酚、氯芐與乙醇重結(jié)晶未分離產(chǎn)物溶液的薄板層析圖，用鉛筆在薄板上點出3個點，用毛細(xì)管從左往右點樣，依次是對苯二酚、氯芐、乙醇重結(jié)晶未分離產(chǎn)物溶液。展開劑是乙酸乙酯與石油醚（1：5）。從圖中產(chǎn)物溶液的層析點可以看出，溶

44、液中含有一部分產(chǎn)物和一部分雜質(zhì)（雙乙酰產(chǎn)物）。</p><p>　　圖3-2是乙醇重結(jié)晶后濾餅與濾液的薄板層析圖，用鉛筆在薄板上點出2個點，用毛細(xì)管從左往右點樣，依次是濾餅和濾液，展開劑是乙酸乙酯與石油醚（1：7）。從圖中層析點可以看出，濾液中仍含有一部分產(chǎn)物，同時根據(jù)濾液層析點中的小黑點，我們知道那是雜質(zhì)（雙乙酰產(chǎn)物）的層析點。.</p><p>　　另外由產(chǎn)物熔點與文獻(xiàn)相對照可知，產(chǎn)品

45、純度較高。</p><p>　　圖3-1 重結(jié)晶溶液層析圖 圖3-2 濾餅、濾液層析圖</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　1、本論文在重復(fù)文獻(xiàn)報道的單乙酰對苯二酚制備方法，收率為18.1%。</p><p>　　2、在此基礎(chǔ)上設(shè)計了單乙酰對苯二酚間接合成法：使用芐基保

46、護(hù)基對兩個酚羥基中的一個進(jìn)行保護(hù)，由于芐基體積較大，所以單芐基化選擇性高，基本不產(chǎn)生雙芐基化產(chǎn)物，然后再對另外一個位發(fā)生芐基化反應(yīng)的酚羥基進(jìn)行以?；磻?yīng)，最后脫去芐基保護(hù)基，得到目標(biāo)產(chǎn)物單乙酰對苯二酚，總收率為39.6%。該方法雖然路線長，但選擇性好，產(chǎn)品純度高，避免了多次分步重結(jié)晶的提純操作，與直接制備法相比有一定地優(yōu)越性。</p><p>　　3、得到一條選擇性高，成本低但收率偏低的單乙酰對苯二酚合成路線。&

47、lt;/p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Froluce D. Uinary disinfectant activity of bearberry lealf extacts [J]. Planta Med1969，18(1):1-25.</p><p>　　[2] Straprova A, Tohodar L,

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52、th antioxidants [P].日本公開專利 平3-259091</p><p>　　[9] 趙明強,丁家宣,劃峻,胡波.人參毛狀根生物合成熊果苷的研究[J].中國中藥雜志,2001,26(12):819-821</p><p>　　[10] PingWang, BrettD, Martin, Sangamitra Parida.Multienzymatic synthesis o

53、f Polyhydroquinon for use as a Redox Polymer [J].J.Am.Chem.Soc, 1995(17):12885-12886</p><p>　　[11] Noguchi N, Horichi T. Manufacture of arbutin with β-glucosidase from glucose and hydroquinone [P]. 日本公開專利 平5

54、-176785</p><p>　　[12] Shimode A. Phenol glycoside manufacture with maltose phosphoryla. [P] 日本公開專利 平8-173183</p><p>　　[13] Alexander R. J. Chem Soc[J], 1930,2729-2733</p><p>　　[14]

55、邵潁,汪霞,孔榮祖.熊果苷的合成[J].江蘇化工,1996, 24 (2): 24-25</p><p>　　[15] 李雯,劉宏民,章亞東,孟騰.熊果苷的相轉(zhuǎn)移催化合成法[J].鄭州工業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,20 (2):42-44</p><p>　　[16] 姚斌,陳萬生,吳秋業(yè). 熊果苷合成新工藝[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2005,(05):15-17.</p><

56、;p><b>　　文獻(xiàn)綜述</b></p><p>　　熊果苷中間體單乙酰對苯二酚的制備</p><p><b>　　1 熊果苷概論</b></p><p>　　熊果苷作為一種天然存在的化學(xué)物質(zhì)，首次發(fā)現(xiàn)于熊果屬的植株葉子中。該屬植物主要分布于西歐、北美一帶，國內(nèi)未有其分布的報道。以后的研究發(fā)現(xiàn)，在杜鵑花科、薔薇科以

57、及虎耳草科等不同屬種的植株中也發(fā)現(xiàn)有熊果苷的存在。</p><p>　　熊果苷化學(xué)名稱為對羥基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子結(jié)構(gòu)如圖l所示。</p><p>　　其藥理活性報道有利尿、抗菌并與可待因(codeine)具有等效的鎮(zhèn)咳效果[1,2]。自20世紀(jì)90年代以來，研究者發(fā)現(xiàn)熊果苷作為酪氨酸酶的抑制劑，能阻斷多巴以及多巴醌的合成，從而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且對皮膚沒有刺

58、激性，毒副作用小[3]。熊果苷作為美白劑廣泛應(yīng)用于化妝品中，國內(nèi)外市場需求十分巨大，是美白祛斑類化妝品的首選主要原料。</p><p>　　2 熊果苷的藥理作用</p><p>　　2.1 抑制黑素的生成</p><p>　　黑素是深色素類物質(zhì)的一種，能引起皮膚的著色，是在黑素細(xì)胞（Melanocyte）中由苯丙氨酸或酪氨酸經(jīng)氧化等一系列生化反應(yīng)生成的。熊果苷是酪氨

59、酸酶抑制劑，它阻斷多巴及多巴醌的合成，從而扼制黑素的生成。</p><p>　　1992年Daeda報道了人黑素細(xì)胞培養(yǎng)中熊果苷去色素作用的機(jī)理[4]。結(jié)果表明，熊果苷抑制了培養(yǎng)人黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性, 但該濃度下的熊果苷對細(xì)胞不呈現(xiàn)毒性。 熊果苷不影響酪氨酸酶的mRNA的表達(dá)。經(jīng)電子旋轉(zhuǎn)共振（ESR）光譜儀測定真黑素（Eumelanin）自由基，確認(rèn)熊果苷能有效地抑制黑素的生成。酪氨酸酶抑制動力學(xué)和機(jī)理的研究

60、表明， 熊果苷作為這種酶的競爭抑制劑具有可逆性。用L-酪氨酸和L-多巴作底物的研究顯示，這種機(jī)理涉及熊果苷與L-酪氨酸在酪氨酸酶活性部位的競爭。以上結(jié)果表明， 熊果苷在人體中去色素機(jī)理涉及到黑素體中酪氨酸酶活性的抑制，而不是酪氨酸酶的表達(dá)和合成。</p><p><b>　　2.2 臨床應(yīng)用</b></p><p>　?。?） 熊果苷具有利尿和抗菌活性</p&g

61、t;<p>　　日本將熊果葉作為生藥收入藥典，但純的熊果苷效果不佳。</p><p>　　（2） 熊果苷對免疫抗炎有協(xié)同作用 </p><p>　　所用熊果苷來自熊果葉，研究它與氫化潑尼松或地塞米松對類型IV變態(tài)反應(yīng)誘導(dǎo)的免疫抗炎協(xié)同作用。結(jié)果表明，熊果苷能增強氫化潑尼松或地塞米松對苦基氯和羊紅細(xì)胞延遲型過敏性的抑制作用[5]。</p><p>　　3

62、 熊果苷的植被方法</p><p>　　已報道的熊果苷的合成方法主要有天然產(chǎn)物提取法[6]、植物組織培養(yǎng)法[7]、酶轉(zhuǎn)化法[8]和化學(xué)合成法[9,10]。前三種方法由于產(chǎn)率低或者提取步驟復(fù)雜等原因在目前狀況下不適合工業(yè)化生產(chǎn)。現(xiàn)在市場上所供應(yīng)的熊果苷大多是通過化學(xué)合成法生成。</p><p>　　3.1 天然產(chǎn)物提取法</p><p>　　主要利用鉛鹽法[11]。其

63、一般步驟是：含熊果苷的植物葉子采集加工一用乙醇或水作萃取→將萃取液過濾，并將過濾物洗滌，合并濾液→將濾液用飽和的中性乙酸鉛水溶液處理，沉淀其中的有機(jī)酸、酚酸、鞣酸、黃酮類等成分，生成不溶性鉛鹽沉淀→濾出沉淀，濾液用堿性鉛水溶液使熊果苷生成非水溶性鉛鹽沉淀→濾出沉淀，懸浮于蒸餾水中，向懸浮液通入硫化氫氣體，生成膠態(tài)的硫化鉛沉淀，調(diào)節(jié)pH，防止熊果苷水解→將硫化鉛膠狀沉淀用抽濾法抽出，濾物水洗，合并濾液→將濾液減壓濃縮，即可離析出滿足化妝品

64、之需的熊果苷晶體。1996年，Matsuda等從六種熊果葉中得50%乙醇提取物[12]，進(jìn)一步分離后得到熊果苷粗品，占熊果葉干重的5%左右。</p><p>　　也可采用柱層析法。利用大孔吸附樹脂分離等現(xiàn)代分離手段，從萃取液中得到熊果苷。但是這方面的研究未見報道。</p><p>　　熊果苷在熊果葉中的含量低，分離步驟繁多，提取物中熊果苷的純度不高，故經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價值不大。但是由于現(xiàn)代人追求純

65、天然綠色化妝品的理念，仍然有廠家從植物葉子中提取天然熊果苷，作為高檔美白化妝品中的添加劑。</p><p>　　由于含熊果苷的天然植物來源困難，近年來興起利用植物細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)熊果苷的研究。</p><p>　　3.2 植物組織培養(yǎng)法</p><p>　　該方法主要是利用植物細(xì)胞強大的糖基化能力，將外源氫醌轉(zhuǎn)化為熊果苷。</p><p>　　

66、1992年，橫山峰幸[13]報道說，在長春花(Catharanthus roseus)植物細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中加入氫醌，可制得熊果苷。該研究表明，細(xì)胞培養(yǎng)時間及添加氫醌的時機(jī)對產(chǎn)率的影響極大，該文獻(xiàn)所報道的熊果苷最高產(chǎn)率為9.2g/L。</p><p>　　林口能孝[14]等利用長春花細(xì)胞培養(yǎng)法合成熊果苷。該方法將長春花細(xì)胞在培養(yǎng)基中于暗處搖床培養(yǎng)8天，過濾，將收集的細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)四天，新培養(yǎng)基中加入濃度為

67、22g/L的氫醌水溶液，可得到147mg熊果苷／g(細(xì)胞干重)。</p><p>　　在國內(nèi)，2001年趙明強[15]等研究者報道了應(yīng)用人參毛狀根細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷的方法。該研究表明，培養(yǎng)22天的人參毛狀根細(xì)胞更換含氫醌底物的培養(yǎng)基后，氫醌濃度為2mmol/L，持續(xù)轉(zhuǎn)化24小時后，所合成的熊果苷占細(xì)胞干重的13%，轉(zhuǎn)化率可達(dá)89%。該方法采用人參毛狀根細(xì)胞合成熊果苷的優(yōu)點是，終產(chǎn)物只需進(jìn)行簡單的處理即可添加于化妝

68、品中，因為人參細(xì)胞本身也含有多種活性物質(zhì)，如人參皂甙等，適應(yīng)化妝品的要求。以人參細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷為特色的丁家宣美白化妝品在市場上取得很大的成功。</p><p>　　利用植物組織培養(yǎng)法生產(chǎn)天然藥物，是近來生物技術(shù)研究熱點之一。它的優(yōu)點是不受環(huán)境生態(tài)和氣候條件的限制，增殖速度比整個植株栽培快很多。目前，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)熊果苷，轉(zhuǎn)化率較高，主要存在的問題是生產(chǎn)周期過長，有用物質(zhì)含量較少，造成后續(xù)分離困難。對植物

69、細(xì)胞生長的機(jī)理了解不夠深入，往往是憑經(jīng)驗控制氫醌的添加時機(jī)。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷是今后研究熱點之一。</p><p><b>　　3.3 酶轉(zhuǎn)化法</b></p><p>　　該法主要以糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶作為催化劑，通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)或逆水解反應(yīng)合成熊果苷。</p><p>　　3.3.1 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)</p><p>

70、　　Glycosyl-OR1+ R20H ? Glycosyl-OR2十H-OR</p><p>　　對于上述反應(yīng)而言，酶底物為雙糖或者多糖，發(fā)生糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，離去基團(tuán)為糖基，反應(yīng)為動力學(xué)控制。水作為競爭性親核物質(zhì)，可發(fā)生水解副反應(yīng)。</p><p>　　糖基轉(zhuǎn)移酶能特異性地催化糖基從糖基供體如UDP衍生物轉(zhuǎn)移到目標(biāo)產(chǎn)物，該酶催化效率很高，但由于反應(yīng)所需的糖基供體十分昂貴，因此它們在體外的

71、應(yīng)用很少。</p><p>　　1995年，Ping Wang等人報道[16]說，利用從牛肝中提取的葡萄糖苷酶，催化氫醌與對硝基苯葡萄糖苷之間的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，生成熊果苷。該反應(yīng)能在8小時后使65%的氫醌轉(zhuǎn)化為熊果苷。轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)的效率很高，限制其大規(guī)模應(yīng)用的原因是活性糖苷中間體對硝基苯葡萄糖苷過于昂貴。</p><p>　　3.3.2 逆水解反應(yīng)</p><p>　　G

72、lycosyl-OH+ R1OH?Glysoyl-OR1+ H20</p><p>　　對于上述反應(yīng)而言，當(dāng)酶底物為單糖時，發(fā)生可逆水解反應(yīng)。該反應(yīng)是熱力學(xué)控制。</p><p>　　β-葡萄糖苷酶能催化合成單一異構(gòu)體的糖苷。通過控制反應(yīng)條件，可在非水相中催化糖苷水解酶逆水解反應(yīng)合成糖苷，該方法是舍成且一葡萄糖苷特別有吸引力的方法。</p><p>　　1993年，

73、下出綾子等人報道[17]說，30%(質(zhì)量／體積)的葡萄糖溶液和10%(質(zhì)量／體積)的氫醌溶液，用β-葡萄糖苷酶催化，在pH5以及40℃環(huán)境下保持72小時，得0. 11%的熊果苷。</p><p>　　1994年，荒川博邦[18]等人利用商品纖維素酶Tamano將氫醌與纖維素轉(zhuǎn)化為熊果苷。據(jù)其報道，7%（質(zhì)量／體積）的氫醌和5%（質(zhì)量／體積）的濾紙粉，在該酶作用下，40℃培養(yǎng)96小時，得到8mg熊果苷與5mg氫醌-

74、O-β-D纖維二糖。</p><p>　　總體來說，有關(guān)非水相中糖苷酶逆水解反應(yīng)合成熊果苷的相關(guān)文獻(xiàn)不是很多，所得熊果苷的產(chǎn)率也較低。這可能是由于氫醌的對羥苯基的空間位阻效應(yīng)比較大，同時由于反應(yīng)物在有機(jī)溶劑中的溶解度比較小，阻礙了熊果苷的生成。</p><p>　　通過非水相中逆水解法酶法合成熊果苷只需要一步反應(yīng)，且能保持反應(yīng)物的立體構(gòu)型，不需要進(jìn)一步拆分，因此可以大大節(jié)省后續(xù)提取成本。該

75、方法發(fā)展?jié)摿薮?。找到合適的酶源以及提高逆水解合成的收率是今后研究的重點。</p><p><b>　　3.4 化學(xué)合成法</b></p><p>　　該法主要以葡萄糖與氫醌為原料，通過化學(xué)法合成熊果苷?；瘜W(xué)合成法采用經(jīng)典的Koenigs-Knorr反應(yīng)，即將葡萄糖乙酰化再經(jīng)過溴取代后得到溴代四乙酰葡萄糖，然后再與單側(cè)鏈保護(hù)氫醌在堿性催化劑作用下縮合得到五乙酰葡萄糖，

76、脫乙?；玫叫芄铡７磻?yīng)過程如下圖所示：</p><p>　　最早關(guān)于熊果苷化學(xué)合成的報道[19]是應(yīng)用溴化銀，喹琳為催化劑，溴代四乙酰葡萄糖與氫醌單芐酯縮合，再經(jīng)脫乙?；捅郊柞；频眯芄?。該方法由于試劑較貴，反應(yīng)步驟較多，已不常用。</p><p>　　邵潁[20]等人報道了以三氯氧磷為催化劑，五乙酰葡萄糖與氫醌單芐基醚縮合，再經(jīng)脫乙醚基團(tuán)，芐基制得熊果苷。該方法由于其關(guān)鍵反應(yīng)試劑對

77、苯甲氧基苯酚需自己合成，且產(chǎn)率不高，限制了該法的進(jìn)一步發(fā)展。</p><p>　　李雯等人報道用相轉(zhuǎn)移催化劑合成熊果苷[21]。該方法利用溴代四乙酰葡萄糖與單乙酰氫醌，經(jīng)相轉(zhuǎn)移催化得到五乙酰熊果苷，再經(jīng)甲醇鈉一甲醇體系脫保護(hù)基后得到熊果苷。該方法的關(guān)鍵步驟是單乙酰氫醒的合成，控制反應(yīng)體系中氫醌與乙酸酐的物料比，是反應(yīng)成功的關(guān)鍵。另有應(yīng)用有機(jī)錫化合物脫乙酰保護(hù)基的報道。</p><p>　　

78、化學(xué)法合成熊果苷都需要加保護(hù)基團(tuán)和脫保護(hù)基團(tuán)的步驟。但是利用化學(xué)法合成相對而言收率較高，成本較低，是市場上大部分熊果苷的來源。</p><p><b>　　4 結(jié)果和討論</b></p><p>　　我國對合成熊果替的研究報道不多，在熊果苷的合成與生產(chǎn)方面，與國外相比還存在一定的差距。然而，隨著人們生活水平的不斷提高，保健意識和審美意識的不斷提高，熊果苷的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒅?/p>

79、漸拓寬，社會對熊果苷的需求量也將不斷上升。這將有力的推動我國熊果苷及其衍生物合成方法的深入研究。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Froluce D. Uinary disinfectant activity of bearberry lealf extacts [J]. Planta Med1969，18(1):1-25.&

80、lt;/p><p>　　[2] Straprova A, Tohodar L, Nosalova G. Antissive effect of taibutic [J]. Pharmazine, 1991, 46(8):611-612.</p><p>　　[3] Meada K, Fukuda M.Arbutin: mechanism of its depigmenting action i

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86、Toshinori Ide . Hydroquinone glycosides from leaves of MYRSINE SEGUINII [J]. Phytochemistry 1998, 49(7):2149-2153</p><p>　　[12] Matsuda H, Higashino M, Nakai Y. Inhibitory effects of some Arctostaphyios plan

87、ts on melanin biosynthesis [J].Biol. Pharm.Bu11, 1996, 19(1):153-156</p><p>　　[13] Yokoyamo Manufacture of glycosides of phenols by plant tissue culture[P].日本公開專利 平4-131091</p><p>　　[14] Yokoyar

88、no. Manufacture of phenols glycosides by plant tissue culture with antioxidants [P].日本公開專利 平3-259091</p><p>　　[15] 趙明強,丁家宣,劃峻,胡波.人參毛狀根生物合成熊果苷的研究[J].中國中藥雜志,2001,26(12)819-821</p><p>　　[16] PingWa

89、ng, BrettD, Martin, Sangamitra Parida.Multienzymatic synthesis of Polyhydroquinon for use as a Redox Polymer [J].J.Am.Chem.Soc, 1995117, 12885-12886</p><p>　　[17] Noguchi N, Horichi T. Manufacture of arbutin

90、 with β-glucosidase from glucose and hydroquinone [P]. 日本公開專利 平5-176785</p><p>　　[18] Shimode A. Phenol glycoside manufacture with maltose phosphoryla. [P] 日本公開專利 平8-173183</p><p>　　[19] Alexand

91、er R. J. Chem Soc[J], 1930,2729-2733</p><p>　　[20] 邵潁,汪霞,孔榮祖.熊果苷的合成[J].江蘇化工,1996, 24 (2) 24-25</p><p>　　[21] 李雯,劉宏民,章亞東,孟騰.熊果苷的相轉(zhuǎn)移催化合成法[J].鄭州工業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,20 (2) 42-44</p><p><b>

92、;　　開題報告</b></p><p>　　熊果苷中間體單乙酰對苯二酚的制備</p><p>　　1 選題的背景和意義</p><p>　　熊果苷作為一種天然存在的化學(xué)物質(zhì)，首次發(fā)現(xiàn)于熊果屬的植株葉子中。該屬植物主要分布于西歐、北美一帶，國內(nèi)未有其分布的報道。以后的研究發(fā)現(xiàn)，在杜鵑花科、薔薇科以及虎耳草科等不同屬種的植株中也發(fā)現(xiàn)有熊果苷的存在。</

93、p><p>　　熊果苷化學(xué)名稱為對羥基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子結(jié)構(gòu)如圖l所示。</p><p>　　其藥理活性報道有利尿、抗菌并與可待因(codeine)具有等效的鎮(zhèn)咳效果[1,2]。自20世紀(jì)90年代以來，研究者發(fā)現(xiàn)熊果苷作為酪氨酸酶的抑制劑，能阻斷多巴以及多巴醌的合成，從而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且對皮膚沒有刺激性，毒副作用小[3]。熊果苷作為美白劑廣泛應(yīng)用于化妝品中

94、，國內(nèi)外市場需求十分巨大，是美白祛斑類化妝品的首選主要原料。</p><p>　　熊果苷與其他傳統(tǒng)性美白劑(如汞鹽。壬二酸、對丞二酸、對丞二酸草丞醚)相比較祛斑效果高，安全無毒，使用方便等優(yōu)點，它呈集“綠色植物”安全可靠。配伍性好，高效脫色</p><p>　　二者合一于體的皮膚美白劑。是本世紀(jì)末新興起來的新型的距世紀(jì)產(chǎn)品．頗有時代的特色。</p><p>　　2

95、相關(guān)研究的最新成果及動態(tài) </p><p>　　熊果苷在護(hù)膚用品和發(fā)用制品方面有廣泛的用途[4]。 近幾年來, 國內(nèi)熊果苷的生產(chǎn)和相關(guān)化妝品的開發(fā)有了迅速的發(fā)展, 國外對熊果苷的研究和開發(fā)更為深入, 并取得了許多進(jìn)展。這些進(jìn)展包括: ①作用機(jī)理的研究; ②化妝品處方中與熊果苷配伍的其他活性物質(zhì); ③治療作用; ④衍生物; ⑤熊果苷的來源和制備方法。這里主要介紹制備方法的進(jìn)展。</p><p&g

96、t;　　2.1 天然產(chǎn)物提取法</p><p>　　主要利用鉛鹽法[5]。其一般步驟是：含熊果苷的植物葉子采集加工→用乙醇或水作萃取→將萃取液過濾，并將過濾物洗滌，合并濾液→將濾液用飽和的中性乙酸鉛水溶液處理，沉淀其中的有機(jī)酸、酚酸、鞣酸、黃酮類等成分，生成不溶性鉛鹽沉淀→濾出沉淀，濾液用堿性鉛水溶液使熊果苷生成非水溶性鉛鹽沉淀→濾出沉淀，懸浮于蒸餾水中，向懸浮液通入硫化氫氣體，生成膠態(tài)的硫化鉛沉淀，調(diào)節(jié)pH，防

97、止熊果苷水解→將硫化鉛膠狀沉淀用抽濾法抽出，濾物水洗，合并濾液→將濾液減壓濃縮，即可離析出滿足化妝品之需的熊果苷晶體。1996年，Matsuda等從六種熊果葉中得50%乙醇提取物[6]，進(jìn)一步分離后得到熊果苷粗品，占熊果葉干重的5%左右。</p><p>　　也可采用柱層析法。利用大孔吸附樹脂分離等現(xiàn)代分離手段，從萃取液中得到熊果苷。但是這方面的研究未見報道。</p><p>　　熊果苷在

98、熊果葉中的含量低，分離步驟繁多，提取物中熊果苷的純度不高，故經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價值不大。但是由于現(xiàn)代人追求純天然綠色化妝品的理念，仍然有廠家從植物葉子中提取天然熊果苷，作為高檔美白化妝品中的添加劑。</p><p>　　由于含熊果苷的天然植物來源困難，近年來興起利用植物細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)熊果苷的研究。</p><p>　　2.2 植物組織培養(yǎng)法</p><p>　　該方法主要是利

99、用植物細(xì)胞強大的糖基化能力，將外源氫醌轉(zhuǎn)化為熊果苷。</p><p>　　1992年，橫山峰幸[7]報道說，在長春花(Catharanthus roseus)植物細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中加入氫醌，可制得熊果苷。該研究表明，細(xì)胞培養(yǎng)時間及添加氫醌的時機(jī)對產(chǎn)率的影響極大，該文獻(xiàn)所報道的熊果苷最高產(chǎn)率為9.2g/L。</p><p>　　林口能孝[8]等利用長春花細(xì)胞培養(yǎng)法合成熊果苷。該方法將長春花細(xì)胞

100、在培養(yǎng)基中于暗處搖床培養(yǎng)8天，過濾，將收集的細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)四天，新培養(yǎng)基中加入濃度為22g/L的氫醌水溶液，可得到147mg熊果苷／g(細(xì)胞干重)。</p><p>　　在國內(nèi)，2001年趙明強[9]等研究者報道了應(yīng)用人參毛狀根細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷的方法。該研究表明，培養(yǎng)22天的人參毛狀根細(xì)胞更換含氫醌底物的培養(yǎng)基后，氫醌濃度為2mmol/L，持續(xù)轉(zhuǎn)化24小時后，所合成的熊果苷占細(xì)胞干重的13%，轉(zhuǎn)化率可

101、達(dá)89%。該方法采用人參毛狀根細(xì)胞合成熊果苷的優(yōu)點是，終產(chǎn)物只需進(jìn)行簡單的處理即可添加于化妝品中，因為人參細(xì)胞本身也含有多種活性物質(zhì)，如人參皂甙等，適應(yīng)化妝品的要求。以人參細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷為特色的丁家宣美白化妝品在市場上取得很大的成功。</p><p>　　利用植物組織培養(yǎng)法生產(chǎn)天然藥物，是近來生物技術(shù)研究熱點之一。它的優(yōu)點是不受環(huán)境生態(tài)和氣候條件的限制，增殖速度比整個植株栽培快很多。目前，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)

102、熊果苷，轉(zhuǎn)化率較高，主要存在的問題是生產(chǎn)周期過長，有用物質(zhì)含量較少，造成后續(xù)分離困難。對植物細(xì)胞生長的機(jī)理了解不夠深入，往往是憑經(jīng)驗控制氫醌的添加時機(jī)。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)合成熊果苷是今后研究熱點之一。</p><p><b>　　2.3 酶轉(zhuǎn)化法</b></p><p>　　該法主要以糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶作為催化劑，通過轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)或逆水解反應(yīng)合成熊果苷。</p>

103、;<p>　　2.3.1 轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)</p><p>　　Glycosyl-OR1+ R20H ? Glycosyl-OR2十H-OR</p><p>　　對于上述反應(yīng)而言，酶底物為雙糖或者多糖，發(fā)生糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，離去基團(tuán)為糖基，反應(yīng)為動力學(xué)控制。水作為競爭性親核物質(zhì)，可發(fā)生水解副反應(yīng)。</p><p>　　糖基轉(zhuǎn)移酶能特異性地催化糖基從糖基供體如UD

104、P衍生物轉(zhuǎn)移到目標(biāo)產(chǎn)物，該酶催化效率很高，但由于反應(yīng)所需的糖基供體十分昂貴，因此它們在體外的應(yīng)用很少。</p><p>　　1995年，Ping Wang等人報道[10]說，利用從牛肝中提取的葡萄糖苷酶，催化氫醌與對硝基苯葡萄糖苷之間的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，生成熊果苷。該反應(yīng)能在8小時后使65%的氫醌轉(zhuǎn)化為熊果苷。轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)的效率很高，限制其大規(guī)模應(yīng)用的原因是活性糖苷中間體對硝基苯葡萄糖苷過于昂貴。</p>

105、<p>　　2.3.2 逆水解反應(yīng)</p><p>　　Glycosyl-OH+ R1OH?Glysoyl-OR1+ H2O</p><p>　　對于上述反應(yīng)而言，當(dāng)酶底物為單糖時，發(fā)生可逆水解反應(yīng)。該反應(yīng)是熱力學(xué)控制。</p><p>　　β-葡萄糖苷酶能催化合成單一異構(gòu)體的糖苷。通過控制反應(yīng)條件，可在非水相中催化糖苷水解酶逆水解反應(yīng)合成糖苷，該方法是舍

106、成且一葡萄糖苷特別有吸引力的方法。</p><p>　　1993年，下出綾子等人報道[11]說，30%(質(zhì)量／體積)的葡萄糖溶液和10%(質(zhì)量／體積)的氫醌溶液，用β-葡萄糖苷酶催化，在pH5以及40℃環(huán)境下保持72小時，得0. 11%的熊果苷。</p><p>　　1994年，荒川博邦[12]等人利用商品纖維素酶Tamano將氫醌與纖維素轉(zhuǎn)化為熊果苷。據(jù)其報道，7%（質(zhì)量／體積）的氫醌和

107、5%（質(zhì)量／體積）的濾紙粉，在該酶作用下，40℃培養(yǎng)96小時，得到8mg熊果苷與5mg氫醌-O-β-D纖維二糖。</p><p>　　總體來說，有關(guān)非水相中糖苷酶逆水解反應(yīng)合成熊果苷的相關(guān)文獻(xiàn)不是很多，所得熊果苷的產(chǎn)率也較低。這可能是由于氫醌的對羥苯基的空間位阻效應(yīng)比較大，同時由于反應(yīng)物在有機(jī)溶劑中的溶解度比較小，阻礙了熊果苷的生成。</p><p>　　通過非水相中逆水解法酶法合成熊果苷

108、只需要一步反應(yīng)，且能保持反應(yīng)物的立體構(gòu)型，不需要進(jìn)一步拆分，因此可以大大節(jié)省后續(xù)提取成本。該方法發(fā)展?jié)摿薮?。找到合適的酶源以及提高逆水解合成的收率是今后研究的重點。</p><p><b>　　2.4 化學(xué)合成法</b></p><p>　　該法主要以葡萄糖與氫醌為原料，通過化學(xué)法合成熊果苷?；瘜W(xué)合成法采用經(jīng)典的Koenigs-Knorr反應(yīng)，即將葡萄糖乙?；俳?jīng)過