魚類肌肉生長抑制素基因的進化分析【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　魚類肌肉生長抑制素基因進化分析</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p&g

2、t;　　肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的肌細胞負向生長調(diào)控因子，又稱生長分化因子-8（Growth diferentiation factor 8，GDF-8），屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）家族成員，是體內(nèi)廣泛表達的一種糖蛋白。</p><p>　　MSTN是在1997年美國John Hopking大學醫(yī)學院的研究

3、小組發(fā)現(xiàn)的。該因子具有TGF-8共有的結(jié)構(gòu)特征，在脊椎動物體內(nèi)是高度保守的，氨基酸序列有家族特征。目前國內(nèi)外對小鼠、豬、牛、雞、鴨以及鵝的MSTN基因做了大量研究，一致認為該基因多態(tài)與生長發(fā)育相關(guān)，且是負調(diào)控肌細胞生長發(fā)育，這些哺乳動物中的MSTN主要在骨骼肌中表達。而通過對多種魚類的研究發(fā)現(xiàn)，魚類MSTN產(chǎn)物在身體中的分布比哺乳動物MSTN在體內(nèi)的分布更廣泛，除了在骨骼肌表達以外，還可以在多個組織中表達，如腦、腸、鰓、腎、性腺等等。魚

4、類與哺乳動物的MSTN有不同的分布、表達方式，暗示其可能有不同于哺乳動物MSTN的功能；除抑制肌肉生長外，可能還影響其他組織如神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。如在MSTN缺失動物模型中除了影響骨骼肌發(fā)育外，還對脂肪沉積起抑制作用；以及近來研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因還與肌肉萎縮癥、愛滋病等與肌肉有關(guān)的疾病有關(guān)。</p><p>　　MSTN一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就受到了生物學家、醫(yī)學、育種學界等科學工作者的廣泛重視，很快地就成為了分子生物領(lǐng)域的一個研

5、究熱點，并且逐步向應用型轉(zhuǎn)化。目前已有幾十種魚類MSTN基因被克隆和報道：斑馬魚（Danio rerio）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鮭（Salmo salar）、莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）、白鱸（Morone americana）、條紋石鮨（M．saxatilis）、金頭鯛（Sparus aurata）、斑點叉尾鲴（Ictalurus punctatus）、波紋短須石首

6、魚（Umbrina cirrosa）、花鱸（Lateolabrax japonicus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、鯉（Cyprinus carpio）、加州鱸（Micropterus salmoides）、眼斑擬石首魚（Sciaenops ocellatus）和幾種鲆蝶魚類等。MSTN在魚類生長發(fā)育、免疫和系統(tǒng)進化中的作用受到越來越多重視。目前MSTN基因已經(jīng)廣泛用于哺乳動物系統(tǒng)進化分析，但將其用于魚類系統(tǒng)

7、進化研究的報道</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　1．通過在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov／)的Nucleotide中檢索各種魚類的MSTN基因的核苷酸序列。</p><p>　　2．對各種魚類的MSTN基因利用生物信息學軟件進行分析：</p><p>　　（1）

8、通過Clustal W程序?qū)Ω鞣N魚類的MSTN基因序列進行同源性比對。 </p><p>　?。?）通過MEGA 4.1軟件對各種魚類的MSTN基因序列進行氨基酸替換分析及親緣進化樹的構(gòu)建。</p><p>　　3．分析討論魚類MSTN基因的進化特性，并對其在分子生物領(lǐng)域上的應用進行展望。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><

9、;p><b>　　1．研究方法：</b></p><p>　　1）序列檢索：通過在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov／)的Nucleotide中檢索各種魚類的MSTN基因的核苷酸序列。</p><p>　　2）同源序列檢索：用檢索到的魚類MSTN基因序列通過Clustal W程序?qū)ζ溥M行同源性比對。</p><p

10、>　　3）氨基酸替換分析：通過Clustal W程序?qū)Ω鞣N魚類的MSTN基因序列進行氨基酸替換分析。</p><p>　　4）進化樹構(gòu)建：使用MEGA 4.1軟件的NJ法構(gòu)建各種魚類的MSTN基因的親緣進化樹。 </p><p>　　5）對得出的數(shù)據(jù)進行進化特性的分析。</p><p><b>　　2．技術(shù)路線：</b></p&g

11、t;<p>　　在NCBI中檢索待用魚類的MSTN基因的核苷酸序列</p><p><b>　　建立FASTA格式</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010年10月到2010年11月：</p><p>　　查閱文獻、資料，熟悉實驗中要用的各種生物信息學軟件<

12、/p><p>　　2010年12月到2011年2月：</p><p>　　進行網(wǎng)上實驗和外文文獻的翻譯。</p><p>　　2011年3月到2011年4月：</p><p><b>　　完成畢業(yè)論文。</b></p><p><b>　　2011年5月：</b></p&g

13、t;<p><b>　　準備畢業(yè)論文答辯。</b></p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] Alexandra C Mcpherron, Ann M Lawler, Lee S J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new T

14、GF-β superfamily member[J]. Nature, 1997, 387(6628): 83-90 </p><p>　　[2] 岳志剛, 楊福合, 邢秀梅, 宋興超. 肌肉生長抑制素的研究新進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2010, 6: 31-33</p><p>　　[3] 徐良梅, 等. 肌肉生成抑制素一MSTN一基因及其在畜牧業(yè)上的應用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報

15、, 2008, 39(6): 141-144</p><p>　　[4] Gonzalez—Cadavid N F, Taylor W E, Yarasheski K, et a1. Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Pro

16、c Natl Acad Sci USA, 1998, 95(25): 14938-14941</p><p>　　[5] 薛良義, 李婷, 楊巧一, 肖章奎. 眼斑擬石首魚肌肉生長抑制素基因克隆及組織表達分析[J]. 海洋學報(中文版), 2008, 30(03): 95-99 </p><p>　　[6] Alexandra C Mcpherron, Thanh V Huynh, Se-

17、jin Lee. Redundancy of myostatin and growth/ differentiation factor 11 function[J]. BMC, 2009</p><p>　　[7] 馬現(xiàn)永, 施振旦. 雞、鵝肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版), 2004, 25(2): 85-88</p><p>　　[8] 張增

18、榮, 朱慶. 肌肉生長抑制素（MSTN）基因的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2007, 1: 19-21</p><p>　　[9] Sharma M, Kambadur R, Matthews KG et al. Myostatin, a transforming growth factor-beta superfamily member, is expressed in heart muscle and

19、 is up regulated in cardiomyocytes after infarct[J]. Cell Physiol, 1999, 180: 1-9</p><p>　　[10] 徐建勇, 陳松林. 牙鲆肌肉生長抑制素(MSTN)基因克隆[J]. 水產(chǎn)學報, 2008, 32(04): 497-504 </p><p>　　[11] 葉寒青,陳松林. 真鯛肌肉生長抑素(MST

20、N)基因的克隆及表達分析[J]. 高技術(shù)通訊, 2006, 29(07): 13-18 </p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　肌肉生長抑制素基因（MSTN）的研究及進展</p><p>　　摘 要：肌生成抑制素（MS

21、TN）是肌肉生長的一種負調(diào)控因子，隸屬于TGF-β超家族，具有TGF-β超家族所有特點。本文主要闡述了MSTN的結(jié)構(gòu)，遺傳效應、組織特異性和同源性以及作用機制，并對其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)學領(lǐng)域的發(fā)展趨勢和應用前景等進行了展望。</p><p>　　關(guān)鍵詞：肌肉生長抑制素　</p><p>　　肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）又稱生長分化因子-8（Growth diferentiat

22、ion factor 8，GDF-8），屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）家族成員，是體內(nèi)廣泛表達的一種糖蛋白。MSTN是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的肌細胞負向生長調(diào)控因子，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就受到了生物學家、醫(yī)學、育種學界等科學工作者的廣泛重視，很快地就成為了分子生物領(lǐng)域的一個研究熱點，并且逐步向應用型轉(zhuǎn)化。</p><p><b>　　1 MSTN的概況<

23、;/b></p><p>　　1.1 MSTN的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特征</p><p>　　Mcpherron等[1] 根據(jù)TGF-β超家族的保守區(qū)設(shè)計一對簡并引物，PCR擴增出一個約280 bp的新產(chǎn)物。以此為探針篩選小鼠的骨骼肌cDNA文庫，得到全長的cDNA序列。分析表明，該cDNA 中只有一個可讀框（opening reading frame，ORF），可編碼376個氨基酸，它的結(jié)構(gòu)

24、具有TGF-β超家族的典型特征：N端疏水的信號肽序列，可籍以跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，起分泌信號的作用；前區(qū)有一個糖基化位點；緊挨著生物活性區(qū)由4個氨基酸（RSRR：Arg—Ser—Arg—Arg）組成一個蛋白酶加工位點；C端包含9個保守的半胱氨酸的生物活性區(qū)，靠分子間的二硫鍵形成二聚體，即所謂的“Cys Knot”的結(jié)構(gòu)[2，3]。</p><p>　　Gonzalez-Cadavid等于1998證實人的MSTN基因，其全

25、長為7.7kb，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，內(nèi)含子1和內(nèi)含子2分別為1.8和2.4kb，3個外顯子編碼的氨基酸長度分別為125、124、126個氨基酸[4]。而歐陽紅生等于2001研究表明：豬的MSTN起始密碼子位于308 bp處，外顯子1編碼第l~124個氨基酸及第125個氨基酸殘基的密碼子的第1個堿基；外顯子2為371 bp，編碼第125氨基酸殘基的密碼子的第2、3個堿基及第126~249氨基酸；外顯子3編碼第250~375氨基酸

26、；終止密碼子位于外顯子3內(nèi)[5]。</p><p>　　1.2 MSTN的遺傳效應、組織特異性及同源性分析</p><p>　　1997年McPherron等[1]通過基因敲除技術(shù)使小鼠的GDF-8基因的C端生物活性區(qū)缺失得到缺失突變純合體小鼠，比對照組肌肉量大2~3倍而且可以存活能夠生育：肩部、臀部的肌肉明顯肥大，整個身體的骨骼肌都比對照組的小鼠大得多，對照組小鼠骨骼肌肌纖維的數(shù)目比野生

27、小鼠高出86％（P<0.01），DNA的量高出約50％（P<0.05），表明突變小鼠的肌肉肥大的原因既有肌細胞的增生（hyperplasia），也有肌纖維的肥大。2009年Mexandra C Mcpherron等再次通過敲除基因技術(shù)將MSTN和GdfⅡ基因敲除，對冗余的MSTN和GdfⅡ功能研究，證實其豐余性功能，主要是對骨骼肌的發(fā)育，更主要是調(diào)節(jié)骨骼肌的尺寸[6]。</p><p>　　Mcphe

28、rron等以小鼠的MSTN保守C末端的cDNA序列作為探針篩選不同動物的骨骼肌cDNA文庫時，克隆了大鼠、人、豬、雞、牛、綿羊、狒狒和斑馬魚的cDNA序列；序列分析表明，MSTN和TGF-β超家族其他成員一樣，在不同物種之間高度保守：就C一端而言，小鼠、大鼠、人、豬、雞和火雞的同源性為100%，狒狒、牛和綿羊比較僅有1～3個堿基的區(qū)別。斑馬魚與上述其他動物的同源性為88% [1]。</p><p>　　MSTN基

29、因在家禽動物中的研究較晚，馬現(xiàn)永[7]等最近研究發(fā)現(xiàn)雞與鵝核苷酸序列的同源性為94.6％ ，雞、鵝的MSTN核苷酸序列轉(zhuǎn)換為相應的氨基酸序列的同源性高達97.9％ 。顯然，在哺乳動物中具有高度的保守性[8]。</p><p>　　經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，并不是動物所有組織中都表達肌肉生長抑制素。最初通過對小鼠MSTN基因mRNA分子雜交分析（Northern Blot Analysis）發(fā)現(xiàn)，鼠的MSTN基因mRNA僅存在于

30、胚胎生長發(fā)育時期和成體小鼠的骨骼肌中，而在其他組織（肺、胸腺、腦、腎、胰腺、腸、脾、睪丸、肝、卵巢等）中均檢測不到MSTN基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[1]。在最近研究中現(xiàn)，MSTN不僅在骨骼肌中表達，而且也存在于其他組織中。Sharma等發(fā)現(xiàn)在羊和牛的心臟組織中有MSTN基因的表達[9]。JI S等發(fā)現(xiàn)在豬的乳腺中也表達MSTN基因mRNA，其可能起調(diào)節(jié)初生豬生長的作用[10]。Rodgers從Brook Trout中獲得了2種MSTN的異構(gòu)體，兩

31、者在核酸水平上的同源性為92%，其中一種存在于肌肉和大腦中，另一種存在于卵巢中[11]。Rescan等的研究也證實了上述結(jié)果，從Trout中克隆了2種MSTN基因，其中MSTN -1在各種組織中均表達,而MSTN -2僅限于在腦組織中表達[12]。而通過對多種魚類的研究發(fā)現(xiàn)，肌肉生長抑制素基因在魚類中的表達更廣泛，該基因在羅非魚、大馬哈魚的骨骼肌、眼、腮、腸、大腦、舌、性</p><p>　　2 MSTN的作用機

32、制</p><p>　　目前的研究結(jié)果證實，MSTN是肌肉生長的負性調(diào)控因子，通過抑制成肌細胞的增殖而發(fā)揮作用[14]。從國內(nèi)外對MSTN的研究情況來看，MSTN如何調(diào)控肌細胞發(fā)育的分子機理還不清楚。但我們已知道，作為TGF-β超家族成員是通過與其細胞表面受體相結(jié)合引起受體自身磷酸化或誘導下一步級聯(lián)放大反應來發(fā)揮它們在細胞內(nèi)的生物學作用。目前，人們主要從信號傳遞、細胞周期等方面對MSTN的作用機理進行深入研究，已

33、取得了一定的進展。</p><p>　　2.1 通過調(diào)控細胞周期抑制成肌細胞生長</p><p>　　許多生長因子、細胞因子、激素及癌基因產(chǎn)物對自身細胞及其他細胞的DNA代謝的調(diào)節(jié)，都是通過信號轉(zhuǎn)導途徑最終影響細胞周期實現(xiàn)的。研究表明，MSTN控制成肌細胞生長的途徑正是通過調(diào)控細胞周期進程來抑制成肌細胞增殖與分化的。而成肌細胞的分化與生長是通過生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）（MyoD、Myf5、

34、MyoG）和P21的表達來可逆地調(diào)控。</p><p>　　細胞周期受細胞周期素（Cyclin）、細胞周期素依賴性蛋白激酶（Cdks）、細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（CKIs）的共同作用。Cdks作為細胞周期循環(huán)的必需因子，幫助細胞完成細胞周期循環(huán)，促進肌管的生成。CKIs包括2個家族，P16和P21家族通過調(diào)控Cdks的活性來阻斷細胞周期，抑制成肌細胞的增殖。P16家族可抑制Cdk4和Cdk6，而P21家族

35、則抑制所有參與G1／S期轉(zhuǎn)化的Cdks。肌肉生長抑制素基因在G1期表達量最高[15] ，可下調(diào)Cdk2的活性和表達水平，降低了cyclin E和Cdk2復合物的形成。肌肉生長抑制素也可上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物CKIs活性和水平[15，16]，抑制了Cdk2、Cdk4的活性，降低了cyclin E和Cdk2及cyclin D和Cdk4復合物的形成。從而阻礙了MyoD絲氨酸／蘇氨酸殘基的磷酸化，使其穩(wěn)定不能釋放G1期向S期進行的基本

36、轉(zhuǎn)錄因子E2F，導致G1期不能向S期推進，抑制成肌細胞的遷移、增殖、形成的肌纖維數(shù)減少，阻礙了肌肉的生成。</p><p>　　2.2 通過受體介導抑制肌肉生長</p><p>　　目前，公認的MSTN的信號傳導途徑是MSTN-ActRⅡB型受體（蛋白激酶受體）-Smad蛋白信號傳導通路。其中涉及3類Smad蛋白：受體激活型Smad蛋白（R-Smad）-Smad3、協(xié)同型Smad 蛋白（C

37、o-Smad）-Smad4 和抑制型Smad 蛋白（I-Smad）-Smad7。</p><p>　　MSTN在信號轉(zhuǎn)導中需要I型（TpR I）和Ⅱ型（TpR II）受體的異二聚體復合物。MSTN Ｃ端的半胱氨酸二聚體先與Ⅱ型受體結(jié)合，然后再與I型受體結(jié)合，在細胞表面形成一個異源聚合體，通過Ⅱ型受體的激酶活性，導致I型受體GS區(qū)域的磷酸化。活化的I型受體可與胞漿內(nèi)Smad2/ 3分子的MH2暫時結(jié)合，并使Smad

38、3的Ｃ端SSXS（Ser465 、Ser467 ）區(qū)的絲氨酸殘基磷酸化而激活[17] 。激活后的Smad2／3與Smad4形成復合體，復合體進入細胞核，與基因的調(diào)控序列結(jié)合促進或者抑制相應基因的轉(zhuǎn)錄。MSTN信號通過Smad2／3、Smad4復合體和靶基因如MyoD調(diào)控序列上的SBE（Smad結(jié)合因子）結(jié)合，抑制靶基因如MyoD的轉(zhuǎn)錄，從而抑制MyoD介導的肌肉發(fā)生和發(fā)育過程，抑制肌肉生長。但Smad2／3，Smad4復合體和Smad7

39、調(diào)控序列上的SBE結(jié)合后，促進Smad7的表達；而Smad7抑制Smad2／3的磷酸化。抑制Smad2／3和Smad4復合體的形成，抑制MSTN誘導的轉(zhuǎn)錄，形成負反饋調(diào)節(jié)。</p><p>　　3 MSTN的應用發(fā)展</p><p>　　MSTN作為一種肌肉生長的負性調(diào)控因子，通過對其基因結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控和作用機理的深入了解不僅能使人們加深對肌肉分化、發(fā)育和生長的科學認識，還在農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、畜

40、牧業(yè)和醫(yī)藥等很多方面都有廣泛的應用前景和商業(yè)價值。</p><p>　　3.1 MSTN在畜牧上的應用</p><p>　　目前在畜牧生產(chǎn)中，MSTN主要在動物應用研究上?？蓮膸讉€方面入手：（1）利用MSTN分子標記技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的數(shù)量育種選培肉質(zhì)性狀優(yōu)良的畜禽；（2）開發(fā)MSTN基因的抗體或抑制劑，使之與MSTN基因表達蛋白結(jié)合從而降低或滅活其功能；（3）利用基因同源重組技術(shù)（基因敲除技術(shù)

41、）獲得MSTN基因缺失的動物。（4）利用RNAi技術(shù)干擾MSTNmRNA的表達，從而解除或緩解MSTN基因?qū)∪饧毎囊种谱饔谩?lt;/p><p>　　這就可以通過分子輔助育種技術(shù)。選育生長迅速、肌肉產(chǎn)量高的優(yōu)良種群，提高肉類生產(chǎn)；還可以進行轉(zhuǎn)基因動物育種。如MSTN基因修飾的魚，這種魚將具有肌肉生產(chǎn)量大、脂肪含量少的優(yōu)良特點；還可通過建立轉(zhuǎn)MSTN反義RNA基因的動物，培育轉(zhuǎn)基因新品種。</p>&

42、lt;p>　　3.2 MSTN在醫(yī)療醫(yī)藥上的應用 </p><p>　　MSTN基因在醫(yī)療醫(yī)藥業(yè)研究領(lǐng)域也十分活躍。Gonzalez-Cadavid等[4]發(fā)現(xiàn)，在感染HIV并伴有肌消耗綜合癥患者血清中MSTN免疫反應性蛋白質(zhì)顯著高于正常人。Zimmers等將重組人MSTN蛋白載體肌注于裸鼠后腿，發(fā)現(xiàn)裸鼠逐漸開始出現(xiàn)全身骨骼肌的進行性消瘦，但也發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的白色脂肪幾乎全部消失，同時出現(xiàn)進行性加重的低血糖狀態(tài)

43、，這一結(jié)果表明，MSTN可能參與機體內(nèi)的糖、脂代謝[18]。這就有助于在HIV 感染、腫瘤等消耗性病及與機體的糖代謝相關(guān)性疾病提供了一條新的途徑。</p><p>　　最近臨床研究表明，MSTN抑制劑能夠提高骨骼肌的質(zhì)量，防止骨骼肌退變[19]，MSTN基因與一些肌萎縮性疾病如癌癥、AIDS、肌營養(yǎng)不良，代謝紊亂癥如肥胖癥和II型糖尿病等疾病相關(guān)。通過阻斷MSTN對治療因慢性疾病引起的肌肉萎縮或許是一種新的治療策

44、略[20]，MSTN 的深入研究為治療這些疾病提供了部分理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)， 并為研發(fā)治療這類疾病的藥物提供了技術(shù)支持，蘊涵著巨大的經(jīng)濟價值。</p><p>　　在畜牧生產(chǎn)中，雖然分子輔助育種技術(shù)和基因敲除技術(shù)較傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳育種有較多的優(yōu)點，但是還仍然存在著不足，例如需要較大的群體、投入多、耗時等等。再加上MSTN基因在醫(yī)學上藥用價值，使得研制MSTN抗體或抑制劑、和運用RNAi技術(shù)進行分子水平的干擾這兩種技

45、術(shù)成為了當今研究MSTN領(lǐng)域最具有挑戰(zhàn)性的研究方向。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1] Alexandra C Mcpherron, Ann M Lawler, Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily membe

46、r[J]. Nature, 1997, 387(6628): 83-90 </p><p>　　[2] 岳志剛, 楊福合, 邢秀梅, 宋興超. 肌肉生長抑制素的研究新進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2010, 6: 31-33</p><p>　　[3] 徐良梅, 等. 肌肉生成抑制素-MSTN-基因及其在畜牧業(yè)上的應用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2008, 39(6): 141-144

47、</p><p>　　[4] Gonzalez-Cadavid NF, Taylor WE, Yarasheski K, et a1. Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV—infected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci USA, 199

48、8, 95(25): 14938-14941</p><p>　　[5] 歐陽紅生, 孫燕. 豬肌生成抑制素基因的克隆和序列測定[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2001, 21(5): 479-481</p><p>　　[6] Alexandra C Mcpherron, Thanh V Huynh, Se-jin Lee. Redundancy of myostatin and growth

49、/ differentiation factor 11 function[J]. BMC, 2009</p><p>　　[7] 馬現(xiàn)永, 施振旦. 雞、鵝肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版), 2004, 25(2): 85-88</p><p>　　[8] 張增榮, 朱慶. 肌肉生長抑制素（MSTN）基因的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 20

50、07, 1: 19-21</p><p>　　[9] Sharma M, Kambadur R, Matthews KG et al. Myostatin, a transforming growth factor-beta superfamily member, is expressed in heart muscle and is up regulated in cardiomyocytes after in

51、farct[J]. Cell Physiol, 1999, 180: 1-9</p><p>　　[10] Ji S, Losinski RL, Cornelius SC, el a1. Myostatin expression in porcine tissues: tissue specifity and developmental and posmatal regulation. Am J PhysM, 1

52、998, 275: 1265-1273</p><p>　　[11] Rodgersb D, Weberg M. Sequence conservation among fish myostatin orthologues and the characterization of two additional cDNA clones from Morone saxatilis and Morone american

53、a[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2001, 129: 597-603</p><p>　　[12] Rescanp Y, Jutel I, Ralliere C. Two myostatin genes are differentially expressed in myotomal muscles of the trout (Oncorhynchus

54、 mykiss)[J]. J Exp Biol, 2001, 204: 3523-3529</p><p>　　[13] 王娜, 石新輝, 胡蘭, 鄭穎. 肌肉生長抑制素的研究進展及應用現(xiàn)狀[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2005, 37(10): 55-58</p><p>　　[14] 戴曄, 候水生, 劉小林. Myostatin基因研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2005, 24(6):

55、 12-14</p><p>　　[15] Thomas M, Langley B, Berry C, et a1. Myostatin, a negative regulatot of muscle growth，functions by inhibiting myoblast proliferation[J]. J Biol Chem, 2000, 275: 40235-40243</p>&l

56、t;p>　　[16] Joulia D, Bernardi H, Garandel V. Mechanisms involved in the inhibition of myoblast proliferation and diferentiation by myostatin[J]. Experimental Cell Research, 2003, 286(2): 263-275</p><p>　　

57、[17] Kambadur R, Sharma M, Smith TP, et a1. Mutations in myostatin(GDF-8) in double muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle[J]. Genome Research, 1997, 7(9): 910-916 </p><p>　　[18] Zimmers TA, Davies MV,

58、Koniaris LG et al. Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin[J]. Science, 2002, 296(5572): 1486-1488</p><p>　　[19] Tsuchida K. Myostatin inhibition by follistatin derived pepfide a

59、meliorates the pathophysiology of muscular dystrophymodelmice[J]. Acta Myol, 2008, 1(27): 14-18</p><p>　　[20] Zamora E, Galfin A, SimoR, et a1. Role of Myostatin in wasting syndrome assciater with chronic di

60、seases [J]. Med Clin(Barc), 2008, 131(15): 585-590</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　魚類肌肉生長抑制素基因的進化分析</p><p><b>　　目

61、錄</b></p><p>　　摘要………………………………………………………………………………………….…………………........1</p><p>　　關(guān)鍵詞…….. .………………………………………………………………………………….………………........1</p><p>　　ABSTRACT……………………………………………………………

62、.…………………………………………...1</p><p>　　KEY………………………………………………………………………………………… ………………………2</p><p>　　引言…………………………………………………………………………………………...……………………..3</p><p>　　1 材料與方法…………………………………………………………………

63、…………………………………….3</p><p>　　1.1 不同物種MSTN基因序列檢索…………………………………………………….……………………….3</p><p>　　1.2 序列分析方法……………………………………………………………………….. ……………………...5</p><p>　　2 結(jié)果與分析……………………………………………………………………

64、…………………..…...……........5</p><p>　　2.1 MSTN基因的同源性分析………………………………………………………………………………........5</p><p>　　2.2 MSTN氨基酸替換分析..…………………………………………………………………………….. .. …..10</p><p>　　2.3不同物種MSTN基因的進

65、化分析………………………………………………………………………….10</p><p>　　3 討論……………………………………………………………………………………………………..……….11</p><p>　　致謝……………………………………………………………………………………………………….………..13</p><p>　　參考文獻……………………………………

66、…………………………………………………………….………..14</p><p>　　摘要：肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）基因?qū)∪馍L起負調(diào)控作用。本研究報道了魚類與哺乳類、鳥類以及各種魚類之間MSTN基因的同源性和位于MSTN基因序列C端區(qū)域上的堿基替換情況，同時還通過構(gòu)建NJ進化樹分析了各種魚類間的系統(tǒng)進化關(guān)系。利用ClustalW多重序列比對，發(fā)現(xiàn)MSTN基因上的C端生物活性區(qū)在魚類還是哺乳

67、類或是鳥類，都具有很強的保守性，且在C端都具有一個保守的蛋白酶加工位點RXXR及9個Cys殘基。同時在保守性強C端區(qū)域內(nèi)僅有幾處存在堿基的替換，其中在堿基數(shù)分別為36 bp和19 bp的兩個高度保守片段上，36 bp的氨基酸片段，除了大黃魚有一處R替換G，鳥類和哺乳類有一處D替換A外，所有魚類都是相同的。19 bp的氨基酸片段，除了溪紅點鮭有一處T替換A，大西洋鮭有一處I替換V外，從魚類到哺乳類都是相同的。在Clustal W的基礎(chǔ)上通

68、過MEGA 4.1軟件以35種脊椎動物MSTN氨基酸序列構(gòu)建的進化樹上分析得到，鱸形總目的魚類（大黃魚、花鱸、羅非魚、石鼓魚、美國紅魚和青鳉）之間相似性高達88%~99%，同時鱸形總目魚類與其它兩種（鯡形總目和鯉形總目）之間的相</p><p>　　關(guān)鍵詞：魚類；肌肉生長抑制素基因；同源性；進化分析</p><p>　　Abstract: The gene of Myostatin is

69、a negative regulator of skeletal muscle growth. This study reported the homology of MSTN gene between teleost and mammals , avian and different teleost, as well as the base substitution that located in the C-terminal are

70、a. At the same time, evolutionary tree of all kinds of teleost were built by using the neighbor joining method of phylogenetic analysis. After ClustalW multiple sequence alignment, strong conservatism in the C-terminal

71、biological activity area </p><p>　　Keywords: Teleost; Myostatin; homology; evolution analysis</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　骨骼肌發(fā)育過程中的生長分化一直是人們感興趣的的熱點問題之一。它由生肌決定因子（MDFs，myo

72、genic determinating factors）家族基因調(diào)控 [1]。二十世紀九十年代發(fā)現(xiàn)的肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN），又稱生長分化因子-8（Growth and differential factor-8）對生長具有負調(diào)控作用，是體內(nèi)廣泛表達的一種糖蛋白。</p><p>　　Mcpherron等[2] 發(fā)現(xiàn)MSTN基因的cDNA中只有一個可讀框（Opening reading fr

73、ame，ORF），可編碼376個氨基酸，它的結(jié)構(gòu)具有TGF-β超家族的典型特征：N端疏水的信號肽序列，可籍以跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，起分泌信號的作用；前區(qū)有一個糖基化位點；緊挨著生物活性區(qū)由4個氨基酸（RSRR：Arg—Ser—Arg—Arg）組成一個蛋白酶加工位點；C一端包含9個保守的半胱氨酸的生物活性區(qū)，靠分子間的二硫鍵形成二聚體，即所謂的“Cys Knot”的結(jié)構(gòu)[3，4]。MSTN敲除的小鼠，其骨骼肌重量明顯增加，是正常野生型小鼠的2-3

74、倍左右。隨后，MSTN的功能在雙肌牛品種比利時藍牛（Belgian Blue）和皮爾蒙特牛（Piedmontese）得到進一步證明[2]。之后，MSTN的重要性以及其在動物育種中的潛在應用前景日益得到動物育種學家的關(guān)注，可以通過抑制MSTN的活性，提高養(yǎng)殖品種的肌肉含量，促進養(yǎng)殖品種的生長。以及近來研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因還對脂肪沉積起抑制作用，與肌肉萎縮癥、愛滋病等與肌肉有關(guān)的疾病相關(guān)[5，6]。</p><p>

75、　　而通過對多種魚類的研究發(fā)現(xiàn)，魚類MSTN產(chǎn)物在身體中的分布比哺乳動物MSTN在體內(nèi)的分布更廣泛，除了在骨骼肌表達以外，還可以在多個組織中表達，如腦、腸、鰓、腎、性腺等等[7]。魚類與哺乳動物的MSTN有不同的分布、表達方式，暗示其可能有不同于哺乳動物MSTN的功能。由于魚類在系統(tǒng)發(fā)生過程中，有基因重復現(xiàn)象發(fā)生，從而導致MSTN產(chǎn)生兩種基因型[8]。目前，對魚類MSTNⅠ的研究較為深入，已在多種魚類中克隆到MSTNⅠ，并對該基因的特征

76、進行了一些分析，如斑馬魚（Danio rerio）[9，10]、溪紅點鮭（Salvelinm fontinalis）[11，12]，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[13]、大西洋鮭（Salmo salar）[14]、金頭鯛（Sparus aurata）[15，16]、莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）[17]、白鱸（Morone chryops）[17]、斑點叉尾鲴（Ictalurus pu

77、nctatus）[18]、白石鮨（Morone americana）[19]、條紋石鮨（Morone saxatilis）[</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 不同物種MSTN基因序列檢索</p><p>　　通過NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank中

78、讀取魚類、鳥類、哺乳類各物種的MSTN基因。見表1。</p><p>　　表1 進行序列分析的物種</p><p><b>　　1.2 分析方法</b></p><p>　　采用Clustal W（http://www.ebi.ac.uk/Tools）程序?qū)Σ溉轭?、鳥類和魚類之間以及各種魚類之間MSTN基因進行多序列的同源性比對，并用手工校正。

79、進行比對的物種見表2。</p><p>　　系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建使用MEGA 4.0中的Neighbor-Joining方法[25]，自展值為1000。進行構(gòu)建進化樹的物種見表1。</p><p>　　表2 進行同源性比對的物種</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1 MSTN基因的同

80、源性分析</p><p>　　通過多重序列比對結(jié)果顯示，不管是在核酸水平還是在氨基酸水平上，都有很高的相似性。而且無論是哺乳動物的人（Homo sapiens），羊（Ovis aries）及家鼠（Mus musculus），還是鳥類或是多種魚類的MSTN基因，在其C端生物活性區(qū)都具有很高的保守性，同時在C端都具有一個保守的蛋白酶加工位點RXXR及9個Cys位點，這一現(xiàn)象在所有的TGF-β超家族成員中普遍存在（圖1

81、）[4]。</p><p>　　P.crocea ---MHLSQIVLYLSLLIVLGPVALSD--------QETHQQ---------PSATSPEDTDQ 40</p><p>　　U.cirrosa ---MHLSQIVLYLSLLIVLGPVVLSD--------QETHQQ---------PSATSPEDTEQ 40</p&

82、gt;<p>　　S.aurata ---MHPSQIVLYLSLLIVLGPVVLSE--------QETQQQQQQQQQQQQPSATSPEDTEL 49</p><p>　　E.coioides ---MHLSQIVLYLGLLIALGPVVLSD--------QETHQQ---------PSATSPEDTEQ 40</p><p&g

83、t;　　S.schlegelii ---MHLSHIVLYLSLLVALGPVVLSD--------QETHQQP--------PSAASPGETEQ 41</p><p>　　T.rubripes ---MQLSPSMLHFSLMISLSLVVLSG--------QETHQQ---------PPVGSPEDTEQ 40</p><p>　　O.latipe

84、s ---MDLPRLLFYLSLLTALGPVVLGD--------QETQQQ---------PSATSAADAEQ 40</p><p>　　O.mykiss ---MHLTQVLIYLSFMVAFGPVGLGD--------QTAHHQ-----------PPATDDGEQ 38</p><p>　　S.salar_1a --

85、-MHLTQVLIYLSFMVAFGPVGLGD--------QTAHHQ-----------PPATDDGEQ 38</p><p>　　S.salar_1b ---MHVMQVLISLSFMVAFGSMGLGD--------QTAHHQ-----------SPATDDGEQ 38</p><p>　　S.alpinus ---MHVTQVLIYLS

86、FMVAFGPLGLGD--------QTAHHQ-----------TPATDDGEQ 38</p><p>　　D.rerio ---MHFTQVLISLSVLIACGPVGYGD--------ITAHQQ----------PSTATEESEL 39</p><p>　　C.idella ---MHFTQVLISLSVLIACGPVGNGD

87、--------ITAHQQ----------PSTATEESEQ 39</p><p>　　P.rabaudiy ---MHFTQVLISLSVVIACGSVGHGD--------ITAHQQ----------PSTATEESEQ 39</p><p>　　P.fulvidraco ---MHLAQVVISLGFVVAFAPIARTDTGAPEHQQQQQH

88、QQQ--------PTAVTEEREAQ 49</p><p>　　H.sapiens -MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNE---------NSEQK------------ENVEKEGL 38</p><p>　　R.norvegicus MIQKPQMYVYIYLFVLIAAGPVDLNE---------DSERE----------

89、--ANVEKEGL 39</p><p>　　O.aries -MQKLQIFVYIYLFMLLVAGPVDLNE---------NSEQK------------ENVEKKGL 38</p><p>　　M.gallopavo --------------MQILVHPVALDG---------SSQPT------------ENAEKDGL 2

90、5</p><p>　　C.coturnix -MQKIVVYVYIYLFVQISVDPVALDG---------SSQPT------------ENTEKDGL 38</p><p>　　. : .</p><p>　　P.crocea C---ATCEVRQQIKTMRLNAIKSQILS

91、KLRMKEAPNISRDIVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 97</p><p>　　U.cirrosa C---ATCEVRQQIKTMRLNAIKSQILSKLRMKEAPNISRXIVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 97</p><p>　　S.aurata C---ATCEVRQQIKTMRLNAIKSQILSKLRMKEAPNISR

92、DIVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 106</p><p>　　E.coioides C---ATCEVRQQIKTMRLNAIKSQILSKLRMKEAPNISRDIVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 97</p><p>　　S.schlegelii C---ATCEVRQQIKTMRLNAIKSQILSKLRMKEAPNISRDIVKQLLPKAP

93、PLQQLLDQYD 98</p><p>　　T.rubripes C---VTCDVRQHIKTMRLNAIKPQILSKLRMKEAPNISRDTVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 97</p><p>　　O.latipes C---ATCEVRQHIKTMRLNAIKSQILSKLRMREAPNISRDTVNQLLPKAPPLQQLLDQYD 9

94、7</p><p>　　O.mykiss C---STCEVRQQIKNMRLHAIKSQILSKLRLKQAPNISRDVVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 95</p><p>　　S.salar_1a C---PTCEVRQQIKNMRLHAIKSQILSKLRLKQAPNISRDVVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 95</p>

95、<p>　　S.salar_1b C---STCEVRQQIKNMRLHAIKSQILSKLRLKHAPNISRDVVKQLLPKAPPLQKLLDQYD 95</p><p>　　S.alpinus C---STCEIRQQIKNMRLHAIKSQILSKLRLKHAPNISRDVVKQLLPKAPPLQKLLDQYD 95</p><p>　　

96、D.rerio C---STCEFRQHSKLMRLHAIKSQILSKLRLKQAPNISRDVVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 96</p><p>　　C.idella C---STCEFRQHSKLMRLHAIKSQILSKLRLKQAPNISRDVVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 96</p><p>　　P.rabaudiy

97、 C---STCEFRQHSKLMRLHAIKSQILSKLRLKQAPNISRDVVKQLLPKAPPLQQLLDQYD 96</p><p>　　P.fulvidraco CSAASACAFRQHSKQLRLQAIKSQILSKLRLKHAPNVSRDVVKQLLPKAPPVQQLLDLYD 109</p><p>　　H.sapiens C---N

98、ACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYD 95</p><p>　　R.norvegicus C---NACAWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPRAPPLRELIDQYD 96</p><p>　　O.aries C---NACLWRQNNKSSR

99、LEAIKIQILSKLRLETAPNISKDAIRQLLPKAPPLRELIDQYD 95</p><p>　　M.gallopavo C---NACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLEQAPNISRDVIKQLLPKAPPLQELIDQYD 82</p><p>　　C.coturnix C---NACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKL

100、RLEQAPNISRDVIKQLLPKAPPLQELIDQYD 95</p><p>　　* :* **: : *:.*** *******:. ***:*: :.****:***:::*:* ** </p><p>　　P.crocea VLGDDNRD-----VVMEEDDEHAITETIMMMATEPESVVQVDEEPKCCFFSFTQKFQAN

101、R 152</p><p>　　U.cirrosa VLGDDNRD-----VVMEEDDEHAITETIMMMATEPESIVQVDEEPKCCFFSFTQKFQANR 152</p><p>　　S.aurata VLGDDNRD-----VVMEEDDEHAITETIMMMATEPEPVVQVDGEPRCCFFSFTQKIQANR 161</

102、p><p>　　E.coioides VLGDDNKD-----VVMEEDDEHATTETIMMMATEPESVVQADGEPKCCLFSFTQKFQANR 152</p><p>　　S.schlegelii VLGDDNKD-----VVMEEDDEHATTETVMMMATEPASIVQVAEEPKCCFFSFSPKFQASR 153</p><

103、;p>　　T.rubripes VLGDDNRD-----VVTEEDDEHAITETIMMMATEPASVVQVNGEPKCCHFSFTQKFQVSR 152</p><p>　　O.latipes VLADDSMD-----AVAEEDDEHASTETIMLMATEPDSDVQVDGEPKCCLFSFAQKFYASR 152</p><p>　　O.

104、mykiss VLGDDNKD-----GLMEEDDEHAITETIMTMATEPESIVQVDRKPKCCLFSFSSKIQVNR 150</p><p>　　S.salar_1a VLGDDNKD-----GVMEEDDEHAITETIMTMATEPQSIVQVDRKPKCCLFSFSSKIQVNR 150</p><p>　　S.salar_1b