銅綠微囊藻氣囊蛋白GvpF的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa PCC7806是一種單細(xì)胞的浮游藍(lán)藻，它可在淡水水體表面季節(jié)性聚集暴發(fā)水華。例如，我國(guó)的太湖和巢湖近年常暴發(fā)藍(lán)藻水華，而銅綠微囊藻就是形成水華的最優(yōu)勢(shì)藻種。銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)能大量產(chǎn)生一種亞細(xì)胞器，叫做氣囊。氣囊是一種中空、充滿(mǎn)氣體的惰性結(jié)構(gòu)，它完全僅由蛋白質(zhì)組成。氣囊的作用就是可以通過(guò)降低藻細(xì)胞的密度為其提供浮力，這樣藍(lán)藻可以自行調(diào)節(jié)在自然水體中的垂直位置，它們可以漂浮到水體中氧氣

2、和光照都適宜的位置以利于自身的生長(zhǎng)和后續(xù)的生境殖民化。所以氣囊的存在是銅綠微囊藻能成為優(yōu)勢(shì)藻種的重要原因之一。研究氣囊的特性對(duì)治理藍(lán)藻水華暴發(fā)有一定的理論指導(dǎo)意義。
　　目前研究已證實(shí)氣囊的合成涉及8-14個(gè)不同的氣囊蛋白Gvp(gas vesicleproteins)，這些Gvp蛋白是由gvp基因簇編碼的，而gvp基因簇被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于產(chǎn)氣囊的細(xì)菌和古細(xì)菌中。現(xiàn)已鑒定銅綠微囊藻M.aeruginosa PCC7806氣囊合成基因

3、簇大小是8.7kb，包含有12個(gè)gvp基因。其中的10個(gè)基因分別組成兩個(gè)操縱子，它們是gvpAⅠAⅡAⅢCNJX和gvpKFG。剩下的兩個(gè)基因gvpV和gvpW是獨(dú)自表達(dá)的。GvpA和GvpC被廣泛研究，它們是氣囊的主要結(jié)構(gòu)組成蛋白。分子量較小(7-8 kDa)且疏水很強(qiáng)的蛋白GvpA構(gòu)成氣囊壁上的棱紋結(jié)構(gòu)，它是氣囊的最主要結(jié)構(gòu)蛋白。而分子量較大的、較親水的次要結(jié)構(gòu)組分蛋白GvpC則是位于氣囊壁的最外表面，通過(guò)與GvpA相互作用來(lái)穩(wěn)定氣

4、囊的結(jié)構(gòu)。除了gvpA和gvpC編碼的兩個(gè)蛋白GvpA和GvpC是氣囊的結(jié)構(gòu)組成蛋白外，藍(lán)藻中其它的gvp基因和Gvp蛋白也可能涉及參與氣囊的合成。
　　本研究中，我們通過(guò)單波長(zhǎng)散射法解析了銅綠微囊藻M.aeruginosa PCC7806中氣囊基因gvpF編碼的氣囊蛋白GvpF的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率是2.7(A)。這是第一個(gè)被解析的氣囊蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)。分析GvpF的三維結(jié)構(gòu)可得知，GvpF是由結(jié)構(gòu)上完全不同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別

5、命名為N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的整體折疊類(lèi)型都屬于α+β家族。其中，將N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與α+β家族的其它蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，可看出N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)折疊模式與其它蛋白都不一樣，它采取的是一個(gè)新的折疊方式。而C端結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)改變了的鐵氧還蛋白折疊的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，與正常的鐵氧還蛋白折疊的結(jié)構(gòu)相比，C端結(jié)構(gòu)域一個(gè)明顯的變化就是多了一個(gè)由三股連續(xù)螺旋構(gòu)成的一個(gè)延伸結(jié)構(gòu)。N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域彼此相對(duì)排列，GvpF的C末端的“尾巴”結(jié)構(gòu)通過(guò)

6、分別與N、C端結(jié)構(gòu)域相互作用來(lái)穩(wěn)定GvpF的整體結(jié)構(gòu)。同時(shí)，我們將GvpF的整體結(jié)構(gòu)做Dali搜索，與PDB中的其它結(jié)構(gòu)做結(jié)構(gòu)比對(duì)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同源結(jié)構(gòu)。由這幾個(gè)方面，我們認(rèn)為GvpF的三維結(jié)構(gòu)是一個(gè)新穎的結(jié)構(gòu)。
　　同時(shí)，我們純化出銅綠微囊藻M.aeruginosa PCC7806的氣囊，負(fù)染電鏡觀察氣囊的結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)圓柱體狀。氣囊的直徑都是相似的，大概120 nm，長(zhǎng)度從500 nm到1500nm不等。氣囊壁的外表面也可以觀察到等

7、距相間排列的棱紋結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE凝膠電泳和質(zhì)譜都只檢測(cè)到純化的氣囊中的結(jié)構(gòu)蛋白GvpC的存在。而蛋白質(zhì)印跡法和免疫膠體金實(shí)驗(yàn)以及基于免疫膠體金的斷層成像技術(shù)均證明GvpF是氣囊的一個(gè)結(jié)構(gòu)組成蛋白，而且是定位在氣囊壁的內(nèi)表面即朝向氣體的一面。
　　為了獲取其它Gvp蛋白的結(jié)構(gòu)和功能信息，我們也一一表達(dá)純化了其它Gvp蛋白。除了GvpA是包涵體表達(dá)外，其它Gvp蛋白均有上清表達(dá)。通過(guò)純化結(jié)晶摸索，我們獲得了GvpC和GvpW的晶