海洋細(xì)菌分布特征、影響因素及計(jì)數(shù)方法研究【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　海洋細(xì)菌分布特征、影響因素及計(jì)數(shù)方法研究</p><p>　　摘要: 海洋是一個(gè)特殊環(huán)境，其所含細(xì)菌不同于陸地，特別是近年來(lái)人們對(duì)海洋細(xì)菌研究工作的日益重視，不斷發(fā)現(xiàn)了一些新的海洋細(xì)菌，并探索環(huán)境條件等

2、對(duì)海洋細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，以及一些先進(jìn)的浮游細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。 這對(duì)人們了解海洋細(xì)菌及日后開(kāi)展細(xì)菌的檢測(cè)將提供有力保障。近幾年，隨著人們對(duì)生存空間的關(guān)注、對(duì)生活質(zhì)量的保障，人們對(duì)海洋資源越來(lái)越關(guān)注，對(duì)海洋微生物的研究工作越來(lái)越受到重視，現(xiàn)將海洋細(xì)菌學(xué)方面的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。</p><p>　　關(guān)鍵詞：海洋；浮游細(xì)菌；環(huán)境因素；計(jì)數(shù)方法；</p><p>　　海洋環(huán)境中的細(xì)菌是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的

3、一個(gè)重要組成部分，它們?cè)诤Ｑ笊鷳B(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)、元素轉(zhuǎn)化、生態(tài)平衡及環(huán)境凈化等方面起著舉足輕重的作用。海洋浮游細(xì)菌(marine bacterioplankton)主要包括異養(yǎng)細(xì)(heterotrophic bacteria)和超微型光合原核生物(picoprokaryotes)藍(lán)細(xì)菌(Synechococcus，聚球菌屬，細(xì)胞粒徑為 0.5-1.5μm)及原綠球藻(Prochlorococcus，細(xì)胞粒徑為0.4-0.8μm

4、)，在全球碳循環(huán)中非常重要，已經(jīng)成為生物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究中的前沿領(lǐng)域之一。</p><p><b>　　1 海洋細(xì)菌分布</b></p><p>　　海洋細(xì)菌垂直分布的一般規(guī)律是由表面向下逐漸減少。但在溫帶和亞熱帶海區(qū)其密度的最大值是處于溫躍層(冷暖水層交界處)，因?yàn)槟抢镉胸S富的生物及微生物遺體并有較高濃度的有機(jī)懸浮顆粒能被微生物所利用。其在海洋中的水平分布，受大陸架的

5、強(qiáng)烈影響，在任何情況下近陸水域中的浮游細(xì)菌都比大洋水中為多。海洋細(xì)菌分布的另一特點(diǎn)是單個(gè)浮游的少，大部分是附著在懸浮的有機(jī)顆粒、浮游生物的體表及海產(chǎn)動(dòng)植物體上，尤其在海產(chǎn)動(dòng)物的消化道中有更多的微生物集聚。</p><p>　　2 海洋細(xì)菌的生理生化特性</p><p>　　遠(yuǎn)海與近海因生態(tài)環(huán)境有差異及受生活用水污染的程度不同同樣的海深(垂直深度相等)可有不同的海洋細(xì)菌。另外，隨著海浪海涌的

6、活動(dòng)和日照對(duì)海平面的溫度效應(yīng), 不同的海深(垂直深度不等)也會(huì)有不同的海洋微生物。</p><p>　　海洋細(xì)菌不同于陸地細(xì)菌，這是由于它的特殊性質(zhì)所決定。</p><p>　　喉冷性是海洋細(xì)菌主要生理特性之一。生活在海洋中的細(xì)菌大都適于在較低溫度下增殖的特性，而對(duì)高溫的感受性化較敏感。Morita多年來(lái)對(duì)海洋的喉冷菌作了調(diào)查研究，認(rèn)為絕大多數(shù)海洋細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度為10~25℃, 但有很

7、多種類(lèi)能在0℃時(shí)發(fā)育良好, 故有中溫細(xì)菌及低溫細(xì)菌之分。</p><p>　　海洋細(xì)菌都有嗜鹽的特性,海洋鹽的含量平均為3.5% ，鹽份中氯化鈉含量為77.8%，故大多數(shù)海洋細(xì)菌是嗜鹽性的，它們?cè)邴}濃度2.5% ~ 4% 時(shí)生長(zhǎng)良好。Larsen 按嗜鹽程度不同把海洋菌分為低嗜鹽(含鹽2% ~ 5%)，等嗜鹽(5% ~ 20%)，高嗜鹽(20% ~30% )，還有一些耐鹽菌，主要在近海岸處發(fā)現(xiàn)[1] 。</

8、p><p>　　嗜壓性和耐壓性也是海洋細(xì)菌的生理特征之一，特別是深海來(lái)源的菌株必須在高壓下生長(zhǎng)，故有喉壓菌之稱(chēng)。Kriss曾經(jīng)將4560米水深的菌株分別培養(yǎng)在常壓和5000大氣壓下，培養(yǎng)72小時(shí)后測(cè)定對(duì)葡萄糖的發(fā)酵力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者比前者的發(fā)酵力超出70%以上。ZoBell研究了淺海菌株與陸生菌株都有相擬的耐壓性，在200~400大氣壓下均被抑制, 在500~600大氣壓下則均死亡，所謂一些喉壓菌大都是來(lái)自水深1000

9、米以下的水中。</p><p>　　3 海洋細(xì)菌的影響因素</p><p>　　海水中細(xì)菌數(shù)量的影響因素很多，可歸納為以下兩大類(lèi)：一、非生物因素：包括光、溫度、海流、水團(tuán)、底質(zhì)、各種有機(jī)和無(wú)機(jī)的溶解物質(zhì)和懸浮物質(zhì)等等。</p><p>　　它們對(duì)海洋生物的分布、生長(zhǎng)、繁殖等方面有 重要的影響。二、生物因素：生物周?chē)耐N和異種的其他生物，各種生物互為環(huán)境中的生物因素

10、。主要是營(yíng)養(yǎng)、競(jìng)爭(zhēng)、共生等關(guān)系[2]。種類(lèi)的個(gè)體間相互聯(lián)系和相互影響決定著一個(gè)種的種群結(jié)構(gòu)、地盤(pán)及其資源利用的方法以集中的生活方式和繁殖[3]等。海水中的細(xì)菌數(shù)量的變化范圍一般在 103-106個(gè)/ml，最高值常常出現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的靠近海岸的地方。除了溫度變化會(huì)影響細(xì)菌的數(shù)量以外，生態(tài)系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在情況、浮游生物的作用、海水的物理化學(xué)變化也會(huì)對(duì)浮游細(xì)菌產(chǎn)生重大影響。</p><p>　　3.1溫度對(duì)浮游

11、細(xì)菌分布的影響</p><p>　　海水溫度直接影響海洋浮游細(xì)菌的代謝，對(duì)海洋細(xì)菌種群具有強(qiáng)烈的選擇作</p><p>　　用。隨著海水溫度的季節(jié)變化，細(xì)菌數(shù)量也出現(xiàn)季節(jié)分布，細(xì)菌數(shù)量的最高值和</p><p>　　最低值分別出現(xiàn)在夏季和冬季。水溫同時(shí)顯著影響海區(qū)的初級(jí)生產(chǎn)力，導(dǎo)致海區(qū)</p><p>　　DOM 含量發(fā)生改變，從而對(duì)細(xì)菌生產(chǎn)

12、力產(chǎn)生間接影響。Wright and Coffin[4]認(rèn)為溫度的作用是影響其他因素來(lái)決定浮游細(xì)菌的分布，這些因素是休眠、底質(zhì)供應(yīng)和捕食。</p><p>　　3.2營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)異養(yǎng)浮游細(xì)菌生產(chǎn)力的影響</p><p>　　海洋細(xì)菌可利用溶解性的無(wú)機(jī)氮(DIN)和溶解性的無(wú)機(jī)磷(DIP)作為 N 和 P 源[5-6]。Brett[7]等研究認(rèn)為在湖泊中浮游細(xì)菌和浮游植物的生長(zhǎng)受同樣的營(yíng)養(yǎng)鹽限制

13、，尤其是無(wú)機(jī)氮、磷。在海洋真光層中，不單單是浮游植物吸收銨鹽(NH4+)，同樣異養(yǎng)細(xì)菌也吸收利用了很大部分銨鹽[5,8]。</p><p>　　3.3浮游生物與海洋細(xì)菌的密切聯(lián)系</p><p>　　細(xì)菌與浮游植物之間的關(guān)系是相當(dāng)密切的[9]。許多學(xué)者的研究[10-15]表明，浮游植物的數(shù)量與細(xì)菌數(shù)有關(guān)，浮游植物的旺盛通常伴隨著浮游細(xì)菌的豐度、生產(chǎn)力、胞外酶及區(qū)系組成的顯著變化。細(xì)菌能夠吸

14、收浮游植物所產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)，促進(jìn)自身的生長(zhǎng)，同時(shí)為浮游植物的生長(zhǎng)提供必要的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，并調(diào)節(jié)浮游植物的微生長(zhǎng)環(huán)境。另外，細(xì)菌可以通過(guò)參與生物競(jìng)爭(zhēng)、分泌特殊物質(zhì)等途徑抑制浮游植物的細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至裂解其細(xì)胞[16]。</p><p><b>　　4 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法</b></p><p>　　估算細(xì)菌的數(shù)量和生物量對(duì)于研究生源要素在海洋地球化學(xué)過(guò)程中的變化規(guī)律是十分

15、重要的。長(zhǎng)期以來(lái)，人們多用涂布平板培養(yǎng)法(PC)和最大或然數(shù)法(MPN)來(lái)測(cè)定樣品中的活細(xì)菌數(shù)。但是由于受到培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物種類(lèi)、濃度及培養(yǎng)條件等限制，大多數(shù)在顯微鏡下觀察到的細(xì)菌不能在同一培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、繁殖而達(dá)到肉眼可見(jiàn)；海水中還有一些是不可培養(yǎng)細(xì)菌,致使自然樣品中所得活細(xì)菌計(jì)數(shù)值偏低[17]。自從熒光顯微計(jì)數(shù)法應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域，對(duì)于環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)及活細(xì)菌數(shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性有了很大提高。</p><p>　

16、　4.1染色直接計(jì)數(shù)法</p><p>　　直接計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)菌數(shù)量(direct count)，即通過(guò)顯微鏡直接觀察計(jì)數(shù)，由于不需要培養(yǎng)，一般能比間接計(jì)數(shù)法如平板計(jì)數(shù)法(plate count)計(jì)算的細(xì)菌數(shù)量高1 ～ 3 個(gè)數(shù)量級(jí)[18]?；诖耍苯佑?jì)數(shù)法逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的間接計(jì)數(shù)法，成為一種新的通用的細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)法。吖啶橙和DAPI是2 種常用于直接計(jì)數(shù)法的熒光染料。</p><p>　　

17、4.1.1吖啶橙染色直接計(jì)數(shù)法</p><p>　　Fransisco等最早應(yīng)用該方法計(jì)數(shù)自然水體中的細(xì)菌總數(shù)，從而確定了該方法的基本程序。后經(jīng)Zimmermann和Meyer-Reil、Daley以及Hobbie等的修改而成為目前較為通用的吖啶橙染色直接計(jì)數(shù)法(AODC)。</p><p>　　吖啶橙是一種熒光染料，它和細(xì)菌接觸以后，可以和細(xì)胞中的核酸物質(zhì)特異結(jié)合,然后在激發(fā)光的激發(fā)下產(chǎn)

18、生綠色或紅色的熒光。細(xì)菌產(chǎn)生的熒光顏色因其生理狀態(tài)的不同而改變。處于靜止期或不活動(dòng)狀態(tài)時(shí)將是綠色熒光，因?yàn)樗鼈兊暮怂嶂饕请p螺旋DNA。而死細(xì)菌細(xì)胞中的DNA則被破壞成單螺旋DNA，它與吖啶橙反應(yīng)呈現(xiàn)紅色的熒光。但在培養(yǎng)過(guò)程中,處于高速率生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中，由于其RNA占優(yōu)勢(shì)，因此也成紅色熒光。大多數(shù)自然界出現(xiàn)的細(xì)菌是綠色熒光，表明它們是活菌但生長(zhǎng)非常緩慢。當(dāng)紅色與綠色熒光混合在一起時(shí)，眼睛看到的是黃色熒光。</p><

19、;p>　　其步驟是取一定濃度的吖啶橙溶液對(duì)一定量的樣品進(jìn)行染色以后，在負(fù)壓狀態(tài)下把樣品過(guò)濾到無(wú)自發(fā)熒光的黑色濾膜上，沖洗后將濾膜置于載玻片上，滴上一滴無(wú)熒光的香柏油，蓋上蓋玻片，然后置于落射熒光顯微鏡(100倍油鏡)下觀察并計(jì)數(shù)有細(xì)菌形態(tài)、呈現(xiàn)亮綠色或紅色熒光的細(xì)菌數(shù),最后換算成單位樣品中細(xì)菌數(shù)。這種計(jì)數(shù)方法，既簡(jiǎn)單方便，又快速準(zhǔn)確，節(jié)約了很多時(shí)間，適合用于測(cè)定水環(huán)境細(xì)菌總數(shù)。它的不足在于非細(xì)菌熒光顆粒對(duì)計(jì)數(shù)有干擾,細(xì)菌在濾膜表面

20、的分散情況、染色步驟、樣品過(guò)濾體積的差異、不同的熒光顯微鏡以及研究者的主觀因素等均可造成計(jì)數(shù)偏差。盡管存在不足之處，AODC法仍廣泛應(yīng)用于各種水環(huán)境細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定，國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局已將AODC法作為海洋細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。</p><p>　　4.1.2DAPI 染色計(jì)數(shù)法</p><p>　　相對(duì)于吖啶橙計(jì)數(shù)法不易區(qū)分出細(xì)菌和黏土、膠體、碎石等非生命的顆粒物，具有更好特異性的

21、DAPI 能與細(xì)菌 DNA結(jié)合時(shí)發(fā)藍(lán)光，結(jié)合到無(wú)DNA 的物質(zhì)時(shí)發(fā)出淡黃光，因此 DAPI 熒光染色計(jì)數(shù)法更適合于沉積物環(huán)境的計(jì)數(shù)[19]。然而，環(huán)境中仍有一些非生命物質(zhì)能被 DAPI 染色劑所染色而造成細(xì)菌計(jì)數(shù)的誤差。沉積物的復(fù)雜環(huán)境加劇這類(lèi)非特定性染色所造成的細(xì)菌計(jì)數(shù)誤差[20-21]。首先是沉積物的質(zhì)地不均一影響計(jì)數(shù)效果，細(xì)菌容易附著在沉積物中而不易分散，因此需要通過(guò)稀釋、超聲實(shí)驗(yàn)將沉積物均質(zhì)化，并將細(xì)菌從沉積物中分離。其次，DA

22、PI 操作步驟影響染色效果，包括 DAPI 染色劑的濃度和染色時(shí)間。染色不充分會(huì)低估細(xì)菌的數(shù)量，而過(guò)量的染色將使背景色過(guò)高而造成計(jì)數(shù)不便[22]。第三是細(xì)菌和雜質(zhì)的含量也會(huì)影響計(jì)數(shù)效果，一些形態(tài)大小與細(xì)菌相似的無(wú)機(jī)質(zhì)和有機(jī)質(zhì)會(huì)影響 DAPI 正確染色效果[23-24]，而Zweifel 等[18]在傳統(tǒng)的 DAPI 染色步驟的基礎(chǔ)上加了異丙醇褪色步驟，把加入褪色步驟計(jì)算出的細(xì)菌數(shù)量(nucleoid-containing cells，N

23、UCCs)視為有明顯代謝活性的細(xì)菌</p><p>　　具有感潮性質(zhì)的河段是河流和海洋的過(guò)渡地帶，由于潮汐的漲落使物質(zhì)的傳輸不僅存在著水平運(yùn)動(dòng)，也存在著垂直混合運(yùn)動(dòng)，因此它對(duì)物質(zhì)的分布具有重要影響[29]，其理化環(huán)境的復(fù)雜性也使其具有比普通河流及海洋更復(fù)雜的生物環(huán)境[30]。本實(shí)驗(yàn)以具有感潮特性的珠江廣州河段為研究對(duì)象，該河段長(zhǎng)期受工業(yè)和生活的雙重污染，因此它兼有河口和城市河流的特點(diǎn)。本研究將分析這一河段中有機(jī)質(zhì)

24、、粒徑組成等對(duì)DAPI 染色計(jì)數(shù)法染色效果的影響，以期為下一步測(cè)定分析珠江廣州河段沉積物中細(xì)菌種類(lèi)和活性的垂向分布提供依據(jù)。</p><p>　　DAPI染色實(shí)驗(yàn)包括DAPI濃度及染色時(shí)間。在DAPI濃度為 5μg·mL-1時(shí)，細(xì)菌顯色不清晰，細(xì)菌數(shù)量偏少；DAPI濃度為10μg·mL-1時(shí)，細(xì)菌與背景色能較好分辨；DAPI濃度為15μg·mL-1時(shí)，大量雜質(zhì)被染色，造成細(xì)菌計(jì)數(shù)困難

25、。染色時(shí)間對(duì)DAPI計(jì)數(shù)法效果影響不大，染色30 min 以上足以達(dá)到要求。DAPI染色劑的濃度決定染色細(xì)菌的清晰程度及雜質(zhì)被染色的程度。盡管Schallenberg 等[31]指出5μg·mL-1的 DAPI濃度能適應(yīng)含水率含量為 64% ～99% 的沉積物的細(xì)菌染色，但由于沉積物質(zhì)地和細(xì)菌數(shù)量的不同，因此最佳 DAPI濃度也有所改變。</p><p>　　4.2活菌直接計(jì)數(shù)法(DVC)</p&

26、gt;<p>　　Kogure等將熒光顯微技術(shù)與培養(yǎng)法結(jié)合起來(lái),設(shè)計(jì)出了活菌直接計(jì)數(shù)法(DVC)。這種方法可以在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)活的海洋細(xì)菌。這種方法包括兩個(gè)步驟。第一步是向海水水樣中加入微量的酵母膏及萘啶酮酸(Nalidixic acid)后，進(jìn)行一段時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)。萘啶酮酸是一種特殊的DNA合成抑制劑，它可以阻礙革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞分裂，而其它合成作用代謝途徑則照常進(jìn)行，這就導(dǎo)致形成大型絲狀細(xì)胞，而這些增大了的細(xì)胞，在顯

27、微鏡下是比較容易計(jì)數(shù)的。第二步，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的水樣中的細(xì)菌再用吖啶橙染色，然后在落射熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。視野中伸長(zhǎng)、變粗、發(fā)橙紅色熒光的菌體被認(rèn)為是活菌。</p><p>　　DVC與AODC染色法相比,這種方法受染料干擾比較小,背景更清晰,使染色的效果更加專(zhuān)一,應(yīng)用也比較廣泛,但適合用于水環(huán)境中活細(xì)菌的計(jì)數(shù)。</p><p>　　4.3免疫熒光顯微鏡法</p><p&

28、gt;　　1979年Stanley等首先使用了免疫熒光顯微鏡法直接測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。這種方法是利用抗原和抗體相互作用的原理及熒光物質(zhì)(如FITC)與微生物細(xì)胞相互作用，通過(guò)對(duì)顯微鏡視野下進(jìn)行熒光數(shù)量的測(cè)定就可得到樣品中細(xì)菌數(shù)量。但是這種方法受到細(xì)菌本身抗原是否表達(dá)的限制(即細(xì)菌需要在一定的條件下才能表達(dá)抗原)[32]；同時(shí)抗體的專(zhuān)一性比較強(qiáng)，自然水樣中細(xì)菌并不是都能與之相結(jié)合，故其不太適合測(cè)定自然水樣(含有多個(gè)細(xì)菌菌群)中細(xì)菌的總數(shù)。&l

29、t;/p><p>　　熒光顯微計(jì)數(shù)法在海洋微生物資源調(diào)查中的應(yīng)用，大大提高了海洋細(xì)菌監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,減少了監(jiān)測(cè)過(guò)程中的大量勞動(dòng)，縮短了監(jiān)測(cè)時(shí)間，促進(jìn)了人們對(duì)海洋資源的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和利用。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 郁慶福. 衛(wèi)生微生物學(xué)[M] . 第2 版. 北京: 人民出版社, 1992. 13.1

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