石油降解菌的篩選及其環(huán)己酮代謝途徑研究.pdf

1、近年來，我國(guó)土壤石油污染問題日益凸現(xiàn)。在石油的開采、加工、運(yùn)輸過程中，大量的石油及其加工品進(jìn)入土壤，造成土壤的石油污染，給人類乃至整個(gè)生物圈帶來巨大的危害，已成為世界性的環(huán)境問題。在對(duì)石油污染治理的研究中，生物修復(fù)作為一項(xiàng)潛在的高效、低成本的清潔技術(shù)正日益受到重視。近十余年來，國(guó)際上對(duì)生物修復(fù)的研究十分活躍，有些國(guó)家已將此技術(shù)用于污染土壤的實(shí)際修復(fù)，并取得了顯著的成果。
　　 本研究從勝利油田長(zhǎng)期開采的油井附近土壤中篩選到3株高

2、效降解菌株DH-5、DH-8和DH-9，培養(yǎng)7d后，對(duì)原油的降解率分別為42.39％、40.42％和43.30％;通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株DH-5、DH-8和DH-9分別屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter sp.）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）。并以常見石油產(chǎn)品和石油中典型烷烴類和芳香烴類化合物為唯一碳源，對(duì)3株菌底物利用能力進(jìn)行

3、了研究，發(fā)現(xiàn)菌株DH-5在長(zhǎng)鏈烷烴和環(huán)烷烴中生長(zhǎng)較好，DH-8在多環(huán)芳烴中生長(zhǎng)較好，而DH-9在低鏈烷烴和環(huán)烷烴中生長(zhǎng)較好，3株高效石油降解菌對(duì)原油組分的利用的廣譜性依次是DH-5＞DH-9＞DH-8。
　　 以利用烷烴類化合物效果較好的菌株DH-5和DH-9進(jìn)一步做降解條件的優(yōu)化試驗(yàn)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化后，菌株DH-5的最優(yōu)降解條件為初始原油濃度0.5％、氮源濃度500 mg·L-1、磷源濃度50 mg·L-1、精氨酸濃度15

4、mg·L-1、溫度30℃及初始pH7.0，此時(shí)原油降解率最高為63.40％;菌株DH-9的最優(yōu)降解條件為初始原油濃度0.3％、氮源濃度400 mg·L-1、磷源濃度150 mg·L-1、天冬氨酸濃度5 mg·L-1、溫度30℃及初始pH7.0，此時(shí)原油降解率最高為63.77％，顯著提高了兩株菌株的降油能力。
　　 通過柱層析法分析了正交優(yōu)化前后原油四組分（飽和烴，芳香烴，膠質(zhì)和瀝青質(zhì)）的降解效果，發(fā)現(xiàn)在扣除自然降解率后，優(yōu)化前，

5、菌株DH-9對(duì)膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的降解率顯著高于菌株DH-5。優(yōu)化后，菌株DH-5對(duì)原油四組分的降解率明顯提高，分別為62.01％、58.86％、46.62％及9.33％;菌株DH-9對(duì)四種組分的降解率也有所提高，分別為63.97％、62.03％、37.16％及14.67％，降解能力排序均為:飽和烴＞芳香烴＞膠質(zhì)＞瀝青質(zhì)。
　　 為了能夠系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)微生物對(duì)石油的代謝過程，通過氣相色譜法分析了原油代謝產(chǎn)物中的脂肪酸含量。結(jié)果表明:發(fā)酵液

6、中主要的小分子有機(jī)酸是乙酸，菌株DH-5和DH-8的發(fā)酵液中還含有C8～C18的長(zhǎng)鏈脂肪酸，菌株DH-9的發(fā)酵液中含有C8～C24的長(zhǎng)鏈脂肪酸，主要是烷酸和烯酸，所以推測(cè)菌株DH-5、DH-8和DH-9的代謝原油的方式可能是單末端氧化和直接脫氫途徑。
　　 測(cè)定三株能利用環(huán)己酮的菌株DH-5、DH-9和A-1（本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株）的環(huán)己酮降解率，3 d后降解率分別為94.84％，93.60％和94.39％。并通過TLC、FT-IR

7、及GC/MS分析，探討了菌株降解環(huán)己酮的中間代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了環(huán)己醇、己內(nèi)酯、鄰苯二甲酸和己二酸，這證實(shí)了菌株很可能是在環(huán)己酮單加氧酶的作用下，將環(huán)己酮氧化成ε-己內(nèi)酯，ε-己內(nèi)酯在酯酶及脫氫酶的作用下再形成己二酸，隨后己二酸進(jìn)入脂肪酸的β-氧化途徑。而菌株DH-5代謝產(chǎn)物中還有2，5-二氫呋喃的產(chǎn)生，這預(yù)示著一種新型的環(huán)己酮代謝途徑。此外，還成功克隆了菌株DH-5的環(huán)己酮單加氧酶基因（chnB）的片段，為環(huán)己酮單加氧酶功能及石油代謝過程