復(fù)旦生物制藥的講義發(fā)酵罐及滅菌方法

1、第三節(jié) 發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌,,典型發(fā)酵設(shè)備,種子制備設(shè)備、主發(fā)酵設(shè)備、輔助設(shè)備(無(wú)菌空氣和培養(yǎng)基的制備)，發(fā)酵液預(yù)處理設(shè)備，粗產(chǎn)品的提取設(shè)備、產(chǎn)品精制與干燥設(shè)備、流出物回收、利用和處理設(shè)備等。,一 發(fā)酵設(shè)備概述,發(fā)酵主要設(shè)備為發(fā)酵罐和種子罐，它們各自都附有原料(培養(yǎng)基)調(diào)制、蒸煮、滅菌和冷卻設(shè)備，通氣調(diào)節(jié)和除菌設(shè)備，以及攪拌器等。 種子罐：以確保發(fā)酵罐培養(yǎng)所必需的菌體量為目的。發(fā)酵罐：承擔(dān)產(chǎn)物的生產(chǎn)任務(wù)。它必須能夠提供微生物生

2、命活動(dòng)和代謝所要求的條件，并便于操作和控制，保證工藝條件的實(shí)現(xiàn)，從而獲得高產(chǎn)。,(一)發(fā)酵罐,發(fā)酵罐的定義：是為一個(gè)特定生物化學(xué)過(guò)程的操作提供良好而滿意的環(huán)境的容器。對(duì)于某些工藝來(lái)說(shuō)，發(fā)酵罐是個(gè)密閉容器，同時(shí)附帶精密控制系統(tǒng)；而對(duì)于另一些簡(jiǎn)單的工藝來(lái)說(shuō)，發(fā)酵罐只是個(gè)開(kāi)口容器，有時(shí)甚至簡(jiǎn)單到只要有一個(gè)開(kāi)口的坑。,發(fā)酵罐系統(tǒng),一個(gè)優(yōu)良的發(fā)酵罐裝置和組成（1）應(yīng)具有嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)（2）良好的液體混合特性（3）好的傳質(zhì)、傳熱速率（4）具有配

3、套而又可靠的檢測(cè)、控制儀表,發(fā)酵罐的特點(diǎn),（1）發(fā)酵罐對(duì)純種培養(yǎng)的要求高。因此，發(fā)酵罐的嚴(yán)密性，運(yùn)行的高度可靠性是發(fā)酵工業(yè)的顯著特點(diǎn)。（2）發(fā)酵罐更加趨向大型化和自動(dòng)化發(fā)展。 自動(dòng)化方面，如pH電極、溶解氧電極、溶解二氧化碳電極等的在線檢測(cè)在國(guó)外巳相當(dāng)成熟。國(guó)內(nèi)目前尚處于起步階段，發(fā)酵檢測(cè)參數(shù)還只限于溫度、壓力、空氣流量等一些最常規(guī)的參數(shù)。,發(fā)酵罐基本類(lèi)型,(1）攪拌釜反應(yīng)器（stirred tank reactor）(2）氣

4、泡柱式反應(yīng)器（bubble column)(3) 氣升式生物反應(yīng)器 （airlift reactor) 內(nèi)管型；外管型,發(fā)酵罐工藝操作條件,1．溫度：25～40℃。2．壓力：0～1 kg／cm3(表壓)。3．滅菌條件；溫度100～140℃，壓力0～3 kg／cm3 (表壓).4．pH：2～11。5．需氧量：0．05～0.3 kmo1／m3·h。6．通氣量：0.3～2 VVM。

5、7．功率消耗：0.5～4kW／m3。8. 發(fā)酵熱量：5 000～20 000 kcal／m3．h。,發(fā)酵設(shè)備及檢測(cè)控制系統(tǒng)?? B|Braun公司,,發(fā)酵罐：Biostat系列參數(shù)檢測(cè)多級(jí)控制：,Biostat B2,Biostat ED10,Pilot Biostat UD50,國(guó)內(nèi)、外發(fā)酵設(shè)備公司,德國(guó)貝朗 占中國(guó)80%以上的市場(chǎng)瑞士比歐美國(guó)NBS韓國(guó)日本華東理工大學(xué)江蘇理工大學(xué),一般認(rèn)為500L以

6、下的是實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐；500-5000L是中試發(fā)酵罐；5000L以上是生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵罐。,發(fā)酵罐按容積分類(lèi),現(xiàn)代發(fā)酵工程規(guī)模,低值工業(yè)品大型化 以規(guī)模來(lái)取勝（幾十?dāng)?shù)百?lài)崳?。如味精、氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、飼料、食品工業(yè)用產(chǎn)品等；高價(jià)值轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品小型化（幾十?dāng)?shù)百升）?；蚬こ檀竽c桿菌、酵母菌高密度培養(yǎng)；動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞培養(yǎng)；研究中心智能化、全能性。,(二)發(fā)酵輔助設(shè)備,發(fā)酵輔助設(shè)備主要包括：無(wú)菌空氣系統(tǒng)，培養(yǎng)基配制和滅菌系統(tǒng)、發(fā)酵

7、車(chē)間的管道及閥門(mén)等。,1、無(wú)菌空氣系統(tǒng),好氣性發(fā)酵過(guò)程中需要大量的無(wú)菌空氣，空氣要作到 絕對(duì)無(wú)菌在目前是不可能的，也是不經(jīng)濟(jì)的。發(fā)酵對(duì)無(wú)菌空氣的要求是 ：無(wú)菌，無(wú)灰塵，無(wú)雜質(zhì)，無(wú)水，無(wú)油，正壓等幾項(xiàng)指標(biāo)；發(fā)酵對(duì)無(wú)菌空氣的無(wú)菌程度要求是：只要在發(fā)酵過(guò)程中不因無(wú)菌空氣染菌，而造成損失即可。在工程設(shè)計(jì)中一般要求1000次使用周期中只允許有一個(gè)菌通過(guò)，即經(jīng)過(guò)濾后空氣的無(wú)菌程度為N=10-3,發(fā)酵生產(chǎn)中制備無(wú)菌空氣的大致過(guò)程,高空取氣管,高

8、空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米的管子。一般而言，地面附近空氣中所含的 微生物和灰塵等均比高空空氣中含的多，據(jù)資料介紹，每升高10米，空氣中雜菌可降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。,油水分離器,其內(nèi)部同時(shí)采用直接攔截，慣性碰撞，布朗擴(kuò)散及凝聚等機(jī)理，能有效地去除空氣中的水、油霧、塵埃，內(nèi)部不銹鋼絲網(wǎng)可清洗，使用壽命長(zhǎng)。,兩級(jí)分離、冷卻、加熱的空氣除菌流程,１——粗過(guò)濾器?。病獕嚎s機(jī)　 ?。场A罐４——冷卻器

9、５——絲網(wǎng)分離器　 ６——過(guò)濾器,高效前置過(guò)濾除菌流程,１——高效前置過(guò)濾器?。病獕嚎s機(jī)?。场A罐?。础鋮s器　 ５——絲網(wǎng)分離器　?。丁訜崞鳌。贰^(guò)濾器,空氣凈化的流程,吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過(guò)壓縮前的過(guò)濾進(jìn)入空氣壓縮機(jī)（120-150度）冷卻（20-25度），除去油、水，再加熱至30-35度。最后通過(guò)總過(guò)濾器和分過(guò)濾器除菌，獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合要求的無(wú)菌空氣。,空氣壓縮機(jī)：目前常用的是往復(fù)式空壓機(jī)

10、過(guò)濾器：空氣過(guò)濾器的類(lèi)型很多，有棉花活性炭過(guò)濾器、管式過(guò)濾器和接送式過(guò)濾器等。過(guò)濾介質(zhì)：空氣除菌用的過(guò)濾介質(zhì)有：棉花、活性炭玻璃纖維，超細(xì)玻璃纖維紙，石棉濾板、燒結(jié)材料、聚乙烯醇(PVA)等多孔合成樹(shù)脂、素?zé)沾赏埠途厶妓狨サ取?培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（culture medium)是人工配制的適合于不同微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。碳源氮源無(wú)機(jī)鹽及微量元素前體、促進(jìn)劑與抑制劑,培養(yǎng)基的類(lèi)型,孢子培養(yǎng)基：供菌種繁殖孢子，

11、常用固體培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：提供大量?jī)?yōu)質(zhì)的菌體，其配方上應(yīng)適合于菌體生長(zhǎng)于繁殖發(fā)酵培養(yǎng)基：使微生物積累代謝產(chǎn)物，既要有利于生長(zhǎng)繁殖，防止菌體過(guò)早衰老，又要有利于產(chǎn)物的大量合成。,2、培養(yǎng)基的滅菌,1）空罐滅菌 空罐滅菌也稱(chēng)空消。無(wú)論是種子罐、發(fā)酵罐、還是尿素（或液氨）罐、消泡罐，當(dāng)培養(yǎng)基（或物料）尚未進(jìn)罐前對(duì)罐進(jìn)行預(yù)先滅菌，為空罐滅菌。為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢，空罐滅菌要求溫度較高，滅菌時(shí)間較長(zhǎng)，只有這樣才能殺死設(shè)備中

12、各死角殘存的雜菌或芽孢。,,2）實(shí)罐滅菌 將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌溫度后，維持一定時(shí)間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種發(fā)酵，這叫做實(shí)罐滅菌，又稱(chēng)分批滅菌。 操作要點(diǎn)： 三路進(jìn)汽：直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn)入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時(shí)間。這就是所謂的“三路進(jìn)氣”。,3）連消,加熱設(shè)備：在配料罐里培養(yǎng)基被加熱到70℃，然后，用泵送到加熱設(shè)備，在20秒的時(shí)間內(nèi)繼續(xù)加熱到130～140℃。常用的加熱

13、設(shè)備有塔式和噴射式兩種。塔式加熱設(shè)備又稱(chēng)連消塔，塔的有效高度2～3m，料液在塔中的流速是0.1m／s，因此料液在塔內(nèi)的滯留時(shí)間為2～30s。噴射式加熱器有一噴嘴，蒸汽由噴嘴噴出，料液從側(cè)面進(jìn)入加熱器而被蒸汽加熱。,,℃,維持設(shè)備維持設(shè)備使加熱后的培養(yǎng)基保溫—定的時(shí)間，從而達(dá)到滅菌的目的。維持設(shè)備有兩種：罐式和管式。罐式的是一個(gè)帶有上下開(kāi)口用于進(jìn)出料的立式密封容器；管式的是用無(wú)縫鋼管焊成，管內(nèi)流速可取0.3～0.6m／s。,冷卻

14、設(shè)備 ①?lài)娏芾鋮s器 ②套管冷卻器 ③板式換熱器 ④螺旋板換熱器,4）影響培養(yǎng)基滅菌的因素,pH值的影響 pH值對(duì)微生物的耐熱性影響很大，pH為6.0~8.0時(shí)微生物最不易死亡， pH <6.0時(shí)氫離子易滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)。,,培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基的成分中，油脂、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)都是傳熱的不良介質(zhì)，會(huì)增加微生物的耐熱性，使滅菌困難。濃度較高的培養(yǎng)基相對(duì)需要較高溫度和較長(zhǎng)時(shí)間滅菌。高濃度的鹽類(lèi)，色素

15、則削弱其耐熱性，故較易滅菌。,,培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì) 培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)大，滅菌困難，反之，滅菌容易。一般說(shuō)來(lái)，含有顆粒對(duì)培養(yǎng)基滅菌影響不大，但在培養(yǎng)基混有較大顆粒，特別是存在凝結(jié)成團(tuán)的膠體時(shí)，會(huì)影響滅菌效果，必須過(guò)濾除去。,5）高溫對(duì)培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止,消除高溫有害影響的措施,（1）采用特殊加熱滅菌法 （2）對(duì)易破壞的含糖培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（3）對(duì)含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽

16、先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（4）對(duì)含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進(jìn)行低壓滅菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下滅菌15分鐘）或間歇滅菌；（5）在大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)中，可采用連續(xù)加壓滅菌法進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌,3、管道及閥門(mén),管道 ：與發(fā)酵罐連接的管道有水管、料管、空氣管和蒸汽管; 發(fā)酵罐內(nèi)的冷卻蛇管與發(fā)酵罐內(nèi)直接相連的料管等，最好采用不銹鋼管。管徑選取的流速是：上水管1～2m／s；

17、料管0.5～1.0m／s；空氣管10～15m／s；蒸汽15～20m／s。,閥門(mén)：閥門(mén)是發(fā)酵罐的重要組成，它被用于調(diào)節(jié)控制氣體和液體的流量。閥門(mén)的選取應(yīng)考慮：①用于什么目的；②閥門(mén)的材料是否耐溫、耐壓等；③連接方式；④經(jīng)濟(jì)成本；⑤操作方式。,第二部分：消毒與滅菌,消毒(disinfection)：殺死物體上病原微生物的方法，并不一定能殺死含芽胞的細(xì)菌或非病原微生物。用以消毒的藥品稱(chēng)為消毒劑(disinfectant)。滅菌(

18、sterilization)：殺滅物體上所有微生物的方法。滅菌比消毒要求高，包括殺滅細(xì)菌芽胞在內(nèi)的全部病原微生物和非病原微生物。抑菌(bacteriostasis)：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。常用的抑菌劑為各種抗生素。防腐(antisepsis)：防止或抑制體外細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的方法。細(xì)菌一般不死亡。無(wú)菌(asepsis)：不存在活菌。,熱力滅菌法輻射殺菌法濾過(guò)除菌法超聲波殺菌法干燥與低溫抑菌法,第一節(jié) 物理消毒滅菌法,

19、干熱滅菌法— 焚燒：廢棄物、尸體 灼燒：接種環(huán)、試管口 干烤：玻璃器皿 紅外線：醫(yī)療器械濕熱滅菌法（moist heat sterilization)— 巴氏消毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7℃15-30s,主要用于牛乳消毒。 煮沸法；流動(dòng)蒸汽消

20、毒法 間歇蒸汽消毒法； 高壓蒸汽滅菌法,一. 熱力滅菌法,紫外線 波長(zhǎng)200-300nm的紫外線具有殺菌作用。 其主要作用于DNA，使一條DNA鏈上相鄰的兩個(gè)胸腺嘧 啶共價(jià)結(jié)合形成二聚體，導(dǎo)致細(xì)菌變異和死亡。電離輻射 高速電子、X射線、γ射線微波 波長(zhǎng)1mm~1m,二. 輻射殺菌法,賽氏濾器玻璃濾器薄膜濾器,三. 濾過(guò)除菌法,是一種機(jī)械的作用因素

21、，每秒超過(guò)2萬(wàn)次振動(dòng)的聲波即為超聲波。常用的超聲波發(fā)生器能產(chǎn)生20-100千赫的聲波，可使細(xì)菌細(xì)胞壁裂解而死亡。,四. 超聲波殺菌法,干燥法 低溫法：低溫可使細(xì)菌的新陳代謝減慢，常用作保存細(xì)菌菌種。冷凍真空干燥法是目前保存菌種的最好方法。,五. 干燥低溫抑菌法,消毒劑的種類(lèi)：酚類(lèi)、醇類(lèi)、重金屬鹽類(lèi)、氧化劑、表面活性劑、烷化劑。消毒劑的應(yīng)用：病人排泄物與分泌物、皮膚、粘膜、飲水、廁所、空氣、手。,第二節(jié) 化學(xué)消毒滅菌法,消毒劑的

22、性質(zhì)、濃度與作用時(shí)間微生物的種類(lèi)與數(shù)量溫度酸堿度有機(jī)物,第三節(jié) 影響消毒滅菌效果的因素,人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書(shū)，廣泛閱讀，古人說(shuō)“書(shū)中自有黃金屋?！蓖ㄟ^(guò)閱讀科技書(shū)籍，我們能豐富知識(shí)，培養(yǎng)邏輯思維能力；通過(guò)閱讀文學(xué)作品，我們能提高文學(xué)鑒賞水平，培養(yǎng)文學(xué)情趣；通過(guò)閱讀報(bào)刊，我們能增長(zhǎng)見(jiàn)識(shí)，擴(kuò)大自己的知識(shí)面。有許多書(shū)籍還能培養(yǎng)我們的道德情操，給我們巨大的精神力量，鼓