實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離浙科版選修

1、浙科版生物選修（1）生物技術(shù)實(shí)踐IB模塊,1-1什么是生物技術(shù),生物技術(shù)=生物工程 應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)原理，以微生物體、動(dòng)物體、植物體或其組成部分作為生物反應(yīng)器將物料進(jìn)行加工，以提供產(chǎn)品來(lái)為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)。,1-2 傳統(tǒng)生物技術(shù),傳統(tǒng)生物技術(shù)指主要通過(guò)微生物的發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)商品.如:醬、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等,1-3 現(xiàn)代生物技術(shù),一般而言，現(xiàn)代生物技術(shù)可以分成以下五種：一、細(xì)胞工程二、發(fā)酵工程三、蛋白質(zhì)工程

2、四、酶工程五、基因工程,現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)生物技術(shù)的本質(zhì)區(qū)別是現(xiàn)代生物技術(shù)中用到了基因工程。,一、細(xì)胞工程,按照人們的需要和科學(xué)設(shè)計(jì)改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，并通過(guò)細(xì)胞(組織)培養(yǎng)，細(xì)胞雜交(融合)，核移植和胚胎移植等技術(shù)，重組細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。,二、發(fā)酵工程,微生物的無(wú)氧呼吸叫發(fā)酵1.定義：利用DNA重組技術(shù)對(duì)不同生物的遺傳基因，根據(jù)人們的意愿，進(jìn)行基因的

3、切割、拼接及重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類(lèi)型。,蛋白質(zhì)工程主要包括了解合成蛋白質(zhì)的DNA編碼序列、蛋白質(zhì)的分離純化、蛋白質(zhì)的序列分析和結(jié)構(gòu)功能分析、蛋白質(zhì)結(jié)晶和結(jié)構(gòu)力學(xué)分析等。,三、蛋白質(zhì)工程,酶工程即利用基因工程等手段，改變酶或蛋白質(zhì)的折疊方式、空間結(jié)構(gòu)、催化活性和穩(wěn)定性等,四、酶工程,選修1需學(xué)習(xí)的實(shí)驗(yàn),（微生物的利用） 實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離 （酶的應(yīng)用）

4、 實(shí)驗(yàn)4 果汁中的果膠和果膠酶 實(shí)驗(yàn)5 加酶洗衣粉的使用條件和效果 實(shí)驗(yàn)6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè) （生物工程在食品加工中的應(yīng)用） 實(shí)驗(yàn)8 果酒及果醋的制作實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)10 泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測(cè)定（淺嘗現(xiàn)代生物工程） 實(shí)驗(yàn)11 植物的組織培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)1 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離,第一部分 :微生物的利用,一、基礎(chǔ)知識(shí),1微生物,2培養(yǎng)基,3無(wú)菌技術(shù),二、實(shí)驗(yàn)操作,2微生物的接種技術(shù),1操作步驟,,微

5、生物包括哪五類(lèi)：,病毒細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌放線(xiàn)菌真菌原生動(dòng)植物,特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu).,,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,,,一基礎(chǔ)知識(shí),（一）微生物,1放線(xiàn)菌,1、結(jié)構(gòu)：?jiǎn)渭?xì)胞原核分支狀的菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）,鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素,微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線(xiàn)菌產(chǎn)生的,應(yīng)用:,2病毒的結(jié)構(gòu)

6、,朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）,病毒的增殖：,3真菌,,如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu),酵母菌和霉菌,青霉,4細(xì)菌的外形與大小,細(xì)菌：?jiǎn)渭?xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色（革蘭氏染色）后顯微鏡觀察,圖1-1 常見(jiàn)的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌 B.桿菌 C.弧菌,,,,細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、 擬核，細(xì)胞質(zhì)中又有液

7、泡、儲(chǔ)存性顆粒、核質(zhì)等。,細(xì)菌的構(gòu)造,圖 細(xì)菌的結(jié)構(gòu),細(xì)胞膜,擬核,*細(xì)胞壁,成分：肽聚糖細(xì)胞壁有哪些功能？ ①固定細(xì)胞外形；,②保護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷；,,③阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞；,④使細(xì)胞具有致病性及對(duì)噬菌體的敏感性。,傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素,芽孢,有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又

8、小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌.,菌落：,單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,菌落,細(xì)菌的菌落特征因種而異,5細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),碳源 有機(jī) 、無(wú)機(jī)氮源 有機(jī) 、無(wú)機(jī)水無(wú)機(jī)鹽生長(zhǎng)因子 即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶,根據(jù)

9、細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同將細(xì)菌分為兩大營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型。自養(yǎng)菌:異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌 大部分病原菌,細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型,,光能自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌,大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌,（二）培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專(zhuān)供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。,（1）按物理狀態(tài)來(lái)分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等，而液體

10、培養(yǎng)基一般用于工業(yè)生產(chǎn)。（2）按功能來(lái)分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按化學(xué)成分來(lái)分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,1.培養(yǎng)基的類(lèi)型和用途,液體培養(yǎng)基：,表面生長(zhǎng),均勻混濁生長(zhǎng),沉淀生長(zhǎng),按物理狀態(tài)來(lái)分,固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔,按物理狀態(tài)來(lái)分,半固體培養(yǎng)基：,無(wú)動(dòng)力 有動(dòng)力(彌散),,,觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、厭氧菌的分離和菌種鑒定,按物理狀態(tài)來(lái)分,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、

11、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞,按功能來(lái)分,鑒別培養(yǎng)基,伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基,按功能來(lái)分,當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)細(xì)菌帶正電荷被染成紅色，再與美藍(lán)結(jié)合形成紫黑色菌落，并帶有綠色金屬光

12、澤。常用的伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基，可用來(lái)鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌,天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限;成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;,天然培養(yǎng)基：,按化學(xué)成分來(lái)分,根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

13、 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定;成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿(mǎn)足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。,合成培養(yǎng)基:,按化學(xué)成分來(lái)分,血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子； ③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分,人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,按化學(xué)成分來(lái)分,3.培養(yǎng)

14、基內(nèi)所含的基本物質(zhì),一般營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)無(wú)機(jī)鹽其他物質(zhì) pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,2.不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方 .,(2)碳源,可作為碳源的物質(zhì)有:含碳無(wú)機(jī)物: 、 、含碳有機(jī)物：,蛋白質(zhì),脂肪

15、酸,,碳酸鹽,碳酸氫鹽,糖類(lèi)（主要）葡萄糖 乳糖,二氧化碳,不同微生物所利用的碳源不同異養(yǎng)型微生物的碳源為自養(yǎng)型微生物的碳源為,含碳有機(jī)物（有機(jī)碳）,含碳無(wú)機(jī)物（無(wú)機(jī)碳）,(3)氮源,可作為氮源的物質(zhì)有:含氮無(wú)機(jī)物： 、 、 、含氮有機(jī)物：,蛋白胨,牛肉膏,尿素,,固氮微生物所利用的氮源是,氮?dú)?氨氣,硝酸鹽,氨鹽,氮?dú)?不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方,不管哪種培

16、養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、 無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH 、氧氣、滲透壓的要求．,細(xì)菌喜葷，霉菌喜素,大腸桿菌配方：酵母提取物：0.5g 蛋白胨：0.5g Nacl：0.5g 瓊脂 ： 1g 水:50ml,細(xì)菌喜中性偏堿，霉菌喜中性偏酸,3培養(yǎng)基配制原則：,營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)目的要明確PH要適宜,（三）無(wú)菌技術(shù),1.無(wú)菌技術(shù)的概念,無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物

17、的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒 ；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌 ；（3）為避免周?chē)⑸镂廴荆瑢?shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周?chē)锲废嘟佑|。,從制備培養(yǎng)基到接種與培養(yǎng)等全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程要無(wú)菌操作,（１）消毒定義：,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,是指殺滅病原微生物的方法。區(qū)分為高程度消毒、中程度消毒、低程度消毒三種方式

18、。,1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min 如牛奶的消毒3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線(xiàn)消毒……,(2)消毒的方法：,滅菌,概念：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a 灼燒滅菌 b 干熱滅菌 c 高壓蒸汽滅菌,,灼燒滅菌,微生物的接種工具 (接種環(huán)、接種針)或其他金

19、屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒,注意適用范圍,干熱滅菌 160－170℃ ；1－2h,能耐高溫的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高壓蒸汽滅菌 100kPa 121℃ 15-30min,通常用于培養(yǎng)基的滅菌,,最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試

20、管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過(guò)，而空氣中的其他微生物不能通過(guò)。 而培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專(zhuān)為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。,1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？,2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、

21、燒瓶和吸管（3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手,答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,思考,1,大腸桿菌的培養(yǎng)和分離,3.微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序,1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存,,二、實(shí)驗(yàn)操作,1制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基2純化大腸桿菌3將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)1

22、2h和24h后，觀察并記錄,二、實(shí)驗(yàn)操作,1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）,大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)操作,培養(yǎng)基的配置與滅菌,取2個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。,LB液體培養(yǎng)基——細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細(xì)菌的劃線(xiàn)分離,封口膜：既通氣又不使菌進(jìn)入,2、純化大腸桿菌,接種方法有：劃線(xiàn)分離法和涂布分離法,劃

23、線(xiàn)分離法:通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫(huà)線(xiàn)的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫(huà)線(xiàn)后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體,這就是菌落.,微生物的接種技術(shù),1．計(jì)算、稱(chēng)量2．溶化3．調(diào)pH：　pH7．6　4．過(guò)濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎,操作步

24、驟,8．滅菌: 將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170 ℃下滅菌2h。 9．倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無(wú)雜菌污染才可用來(lái)接種. 10．無(wú)菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃

25、的溫室中培養(yǎng)24—48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。,倒平板技術(shù),平板劃線(xiàn)的操作,不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。,,,,1.旦劃破，會(huì)造成劃線(xiàn)不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；2.是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。,,,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),四、課題成果評(píng)價(jià),（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2 d后無(wú)

26、菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無(wú)菌要求 如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 （三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的

27、同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。,注意事項(xiàng):1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線(xiàn)多次.2.劃線(xiàn)首尾不能相接3.劃線(xiàn)后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,問(wèn)題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么

28、需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？,答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),微生物的恒溫培養(yǎng),平板劃線(xiàn)的操作,不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。,,,,1.旦劃破，會(huì)造成劃線(xiàn)不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；2.是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。,,,四、課題成果評(píng)價(jià),（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保

29、溫1～2 d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。 （二）接種操作是否符合無(wú)菌要求 如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。 （三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同

30、，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。,（四）大腸桿菌的劃線(xiàn)分離,注意事項(xiàng):1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線(xiàn)多次.2.劃線(xiàn)首尾不能相接3.劃線(xiàn)后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h,1、劃線(xiàn)分離法,問(wèn)題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線(xiàn)之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線(xiàn)操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避

31、免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線(xiàn)前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線(xiàn)結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線(xiàn)時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線(xiàn)的末端，從而通過(guò)劃線(xiàn)次數(shù)的增加，使每次劃線(xiàn)時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線(xiàn)結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線(xiàn)？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線(xiàn)操作時(shí)，

32、為什么總是從上一次劃線(xiàn)的末端開(kāi)始劃線(xiàn)？,答：劃線(xiàn)后，線(xiàn)條末端細(xì)菌的數(shù)目比線(xiàn)條起始處要少，每次從上一次劃線(xiàn)的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線(xiàn)次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。,4.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,5.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面

33、的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,涂布分離法,純種的菌種稀釋一般采取最簡(jiǎn)單常規(guī)的稀釋涂布平板法。 將菌種用接種環(huán)蘸取，放入培養(yǎng)液內(nèi)進(jìn)行一系列的梯度稀釋?zhuān)缓髮⒉煌♂尪鹊木悍謩e涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)即可。,涂布分離法,(1)系列稀釋操作:,涂布平板操作,劃線(xiàn)分離法和涂布分離法哪個(gè)更

34、好呢？,劃線(xiàn)分離：方法簡(jiǎn)單，但單 菌落較難分開(kāi)。涂布分離：?jiǎn)尉涓追?開(kāi)，但操作復(fù)雜。,分離后,一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一,（五）大腸桿菌分離后保存,1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保存。2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法,1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?,(1)

35、膽大心細(xì)，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長(zhǎng)條件，如PH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度,2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?,（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤(rùn)，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線(xiàn)菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線(xiàn)菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)別同

36、類(lèi)的不同物種，需借助化學(xué)和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。,3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置?,恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開(kāi)。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會(huì)導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離目的。,4.實(shí)驗(yàn)完成后,接種過(guò)細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理?,所有接觸過(guò)菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用

37、后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄,5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌,如何保證不被普通的大腸桿菌所污染?,轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒不是細(xì)菌中原有的，而是經(jīng)過(guò)改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng)。,接 種,,【典例解析】,例1．有關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽 D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量,解析：不同的微生

38、物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的具體情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無(wú)機(jī)物種類(lèi)繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無(wú)機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無(wú)機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無(wú)機(jī)氮源提供能量的情況還是存在

39、的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。,答案：D,例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前,答案：B,解析：滅菌是微生物發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說(shuō)的是滅菌的目的，因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯(cuò)誤的，因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜

40、菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專(zhuān)門(mén)接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會(huì)把所接菌種也殺死。,例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請(qǐng)據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類(lèi)型是 。（2）若不慎將過(guò)量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入 .,自養(yǎng)型微生物,含碳有機(jī)物,解釋?zhuān)哼^(guò)量食鹽可用于培養(yǎng)

41、金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌是異養(yǎng)型的。,（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。（4）表中營(yíng)養(yǎng)成分共有 類(lèi)。（5）不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要進(jìn)行的是 。,固氮微生物,3,調(diào)整pH,（6）右表中各成分重量確定的原則是 。（7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加的成分是