微生物的利用-大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

1、微生物的利用,1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離2分離以尿素為氮源的微生物,大腸桿菌的培養(yǎng)和分離,實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)器具與材料實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論知識(shí)拓展,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增培養(yǎng)的操作利用LB固體平面培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)進(jìn)行大腸桿菌的分離說(shuō)明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理,,實(shí)驗(yàn)原理,培養(yǎng)基大腸桿菌LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基劃線分離法菌種的低溫保存無(wú)菌技術(shù),培養(yǎng)基,一、培養(yǎng)基定義及營(yíng)養(yǎng)成分

2、1、定義 人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，稱為培養(yǎng)基。2、營(yíng)養(yǎng)成分 培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源、生長(zhǎng)因子等,,2、營(yíng)養(yǎng)成分① 碳源為微生物提供碳元素的物質(zhì)，可分為有機(jī)碳源和無(wú)機(jī)碳源。如 CO2、NaHCO3 等無(wú)機(jī)碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機(jī)碳源，異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源；單質(zhì)碳不能作為碳源。注意：碳源&能源的辨析,2、

3、營(yíng)養(yǎng)成分② 氮源為微生物提供氮元素的物質(zhì)，可分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。有機(jī)氮源包括牛肉膏，蛋白胨等，無(wú)機(jī)氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利用 N2。,2、營(yíng)養(yǎng)成分③ 生長(zhǎng)因子通常指那些微生物生長(zhǎng)所必需而且需要量很小，自身不能合成或合成量不足機(jī)體生長(zhǎng)需要的有機(jī)化合物。一般可分為維生素、氨基酸、嘌呤與嘧啶這三類。,2、營(yíng)養(yǎng)成分④ 無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)、代謝必不可少的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。無(wú)機(jī)鹽

4、生理功能主要是：作為酶活性中心的組成部分；構(gòu)成微生物細(xì)胞的各種組分；調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞的滲透壓平衡、調(diào)節(jié)pH和控制細(xì)胞的氧化還原位；作為某些微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì)。常見(jiàn)種類：磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物，以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。,2、營(yíng)養(yǎng)成分注意：①這幾類營(yíng)養(yǎng)成分不一定都需要一一單獨(dú)添加。②不是所有培養(yǎng)基都必須同時(shí)含有碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子。,二、培養(yǎng)基的類型,1、按照物理性質(zhì)劃分液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)

5、基，半固體培養(yǎng)基2、按照成分劃分天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基3、按照用途劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加富培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基,a.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑，配置成液體狀態(tài)。 應(yīng)用：在用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物時(shí)，通過(guò)振蕩或攪拌可以 增加培養(yǎng)基的通氣量，同時(shí)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)分布均勻。液體培養(yǎng)基常用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，以及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究。,b.固體培養(yǎng)基：加入較多凝固劑，配置成固體狀態(tài),主要用于 獲取單菌落，并對(duì)

6、微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏等。 常用的凝固劑有瓊脂、明膠、和硅膠。 絕大多數(shù)微生物而言，瓊脂是最理想的凝固劑，由藻類( 海產(chǎn)石花菜)中提取的一種復(fù)雜多糖；明膠是由膠原蛋白制備得到的產(chǎn)物，是最早用來(lái)作為凝固劑的物質(zhì)；硅膠是由無(wú)機(jī)的硅酸鈉等制成的膠體。,,c.半固體培養(yǎng)基：加入較少凝固劑，培養(yǎng)基中瓊脂含量一般為 0.2％—0.7%。 應(yīng)用：可用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定等。 1、按照物理性質(zhì)劃分 考點(diǎn)：注意固體&a

7、mp;液體培養(yǎng)基的判斷 關(guān)鍵字：液體培養(yǎng)基：振蕩、大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等 固體培養(yǎng)基：凝固劑、平板、單菌落等,,天然培養(yǎng)基：這類培養(yǎng)基含有化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物，也稱非化學(xué)限定培養(yǎng)基。 （因?yàn)樘烊挥袡C(jī)物成分是十分混雜不穩(wěn)定的。）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基就屬于此類。基因克隆技術(shù)中常 用的LB(Luria—Bertani)培養(yǎng)基也是一種天然培養(yǎng)基。 常用的天然有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆

8、芽汁 、玉米粉、土壤浸液、麩皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡蘿卜汁、椰 子汁等，嗜糞微生物可以利用糞水作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 應(yīng)用：天然培養(yǎng)基成本較低，除在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用外，也適于用來(lái)進(jìn)行工業(yè)上大規(guī)模的微生物發(fā)酵生產(chǎn)。,,合成培養(yǎng)基：是由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，也稱 化學(xué)限定培養(yǎng)基。高氏I號(hào)培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基就屬于此種類型。 應(yīng)用：配制合成培養(yǎng)基時(shí)重復(fù)性強(qiáng)，但與天然培養(yǎng)基相比其成本較高 ，微生物在其中生長(zhǎng)速度較慢

9、，一般適于在實(shí)驗(yàn)室用來(lái)進(jìn)行有關(guān)微生 物營(yíng)養(yǎng)需求、代謝、分類鑒定、生物量測(cè)定、菌種選育及遺傳分析等方面的研究工作。,①基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 應(yīng)用：基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以用來(lái)作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。②加富培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成 的一類營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，用來(lái)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物。 這些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動(dòng)植物組織 液

10、等。 應(yīng)用：加富培養(yǎng)基可以用來(lái)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物，以及從環(huán)境中富集和分離某種微生物。,,③鑒別培養(yǎng)基： 是用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。 在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學(xué)物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中 生長(zhǎng)后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基 中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種特征性變化，可將該種微生物與其他微生物 區(qū)分開(kāi)來(lái)。 應(yīng)用：鑒別培養(yǎng)基主要用于微生物的快速分類鑒定，以及分離

11、和篩選產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物的微生物菌種。 常見(jiàn)例子：伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基，鑒別大腸桿菌，使其出現(xiàn)帶金屬光澤深紫色菌落。 剛果紅培養(yǎng)基，鑒別能分解纖維素的微生物，在這里微生物周圍形成透明圈。,,④選擇培養(yǎng)基： 用來(lái)將某種或者某類微生物，從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基。 根據(jù)不同種類微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì) ，抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)。常見(jiàn)類型： a

12、.依據(jù)某些微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)需求設(shè)計(jì) 如：利用以纖維素或石蠟油作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，可以從混雜的微生物群體中分離出能分解纖維素或石蠟油的微生物 ; 利用以蛋白質(zhì)作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以分離產(chǎn)胞外蛋白酶的微生物 ; 缺乏氮源的選擇培養(yǎng)基可用來(lái)分離固氮微生物。,b.在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì) , 這種化學(xué)物質(zhì)沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)作用 , 對(duì)所需分離的微生物無(wú)害 , 但可以抑制或殺死其他微生物 。 如 ：在培養(yǎng)基中加入青霉素、 四環(huán)素或鏈霉素 ,

13、 可以抑制細(xì)菌 和放線菌生長(zhǎng) , 而將酵母菌和霉菌分離出來(lái)。 現(xiàn)代基因克隆技 術(shù)中也常用選擇培養(yǎng)基 , 篩選含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株。 在培養(yǎng)基中加入高濃度的NaCl可得到金黃色葡萄球菌。注意：有的培養(yǎng)基可以同時(shí)是選擇+鑒別培養(yǎng)基 當(dāng)要分離金黃色葡萄球菌時(shí) , 在培養(yǎng)基中加入 7.5%NaCl 、甘露糖醇和酸堿指示劑 。 金黃色葡萄球菌可耐高濃度 NaCl, 且能利用甘露糖醇產(chǎn)酸。因此 ，能在上述培養(yǎng)基生長(zhǎng)，而且菌落周圍培養(yǎng)基顏色

14、發(fā)生變化，則該菌落有可能是金黃色葡萄球菌 , 再通過(guò)進(jìn)一步鑒定加以確定。,,除上述四種主要類型外，培養(yǎng)基按用途劃分還有很多種，比如：分析培養(yǎng)基 常用來(lái)分析某些化學(xué)物質(zhì) ( 抗生素、維生素 ) 的濃度，還可用來(lái)分析微生物的營(yíng)養(yǎng)需求；還原性培養(yǎng)基 專門用來(lái)培養(yǎng)厭氧型微生物；組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基含有動(dòng)、植物細(xì)胞 , 用來(lái)培養(yǎng)病毒、 衣原體 、立克次 氏體等專性活細(xì)胞寄生的微生物。 盡管如此 , 有些病毒和立克次氏體目前還不能利用人工培養(yǎng)基來(lái)培

15、 養(yǎng) , 需要接種在動(dòng)植物體內(nèi)、 動(dòng)植物組織中才能增殖。常用的培養(yǎng)病毒與立克次氏體的動(dòng)物有小白鼠、家鼠和豚鼠 , 雞胚也是培養(yǎng)某些病毒與立克次氏體的良好營(yíng)養(yǎng)基質(zhì) 。,第一題,,大腸桿菌是革蘭氏陰性兼性厭氧的腸道桿菌，原核生物，以二分裂方式繁殖。,細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物。細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等。細(xì)菌無(wú)成型的細(xì)胞核，細(xì)胞壁由肽聚糖組成。由于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，細(xì)菌可分為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁厚，

16、無(wú)莢膜，多產(chǎn)生外毒素；革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁薄，有莢膜，多產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)青霉素更為敏感。 大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一般對(duì)人無(wú)害，但任何大腸桿菌進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌在基因工程技術(shù)中被廣泛的應(yīng)用，它的質(zhì)粒是最常用的運(yùn)載體，它也是基因工程中常用的受體細(xì)胞。,,LB液體培養(yǎng)基 擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌LB固體平面培養(yǎng)基 劃線分離培養(yǎng)大腸桿菌,劃線分離法,通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面

17、，連續(xù)劃線，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，形成單菌落，單菌落的分離是消除污染雜菌的通用方法，也是篩選高表達(dá)量的最簡(jiǎn)便方法之一,無(wú)菌技術(shù),1、定義指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。目的：防止外來(lái)雜菌入侵，獲得純凈的培養(yǎng)物。,2、實(shí)現(xiàn)無(wú)菌的常用方法 消毒 滅菌① 消毒：采用相對(duì)較為溫和物理或化學(xué)方法，殺死物體表面或內(nèi)部部分的微生物（不包括芽孢和孢子）。

18、常見(jiàn)的消毒方法：煮沸消毒法、紫外線消毒法、巴氏消毒法以及利用化學(xué)藥品消毒等,② 滅菌： 指用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物（包括芽孢和 孢子）。 常見(jiàn)的滅菌方法：灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等,,3、主要內(nèi)容 主要包括三個(gè)方面： 無(wú)菌環(huán)境設(shè)施、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)器材、無(wú)菌操作方法① 無(wú)菌環(huán)境設(shè)施： 無(wú)菌環(huán)境只是相對(duì)而言，指人們利用物理的方法或化學(xué)的方法，在某一可控制空間內(nèi)使微生物數(shù)量降低至最低限度，接近于無(wú)菌的一種空間

19、。 主要方法：無(wú)菌室 無(wú)菌柜 超凈工作臺(tái),② 無(wú)菌實(shí)驗(yàn)器材： 凡是實(shí)驗(yàn)中使用的器材，能滅菌處理的必須滅菌。如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、試管等）、培養(yǎng)基、無(wú)菌衣 、口罩等，無(wú)法滅菌處理的，使用前必須經(jīng)消毒處理，例如無(wú)菌室內(nèi)的凳、試管架、天平等，這些雖然無(wú)法滅菌，但是可以消毒，可用化學(xué)藥品熏蒸、噴灑或擦拭。,③ 無(wú)菌操作方法： a.對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒; b.將用于微生物培養(yǎng)的器皿

20、、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌; c.為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行; 注意：通常，可在酒精燈旁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；小規(guī)模的操作可以使用無(wú)菌箱或超凈工作臺(tái)，工作量大的使用無(wú)菌室，要求嚴(yán)格的可在無(wú)菌室內(nèi)再結(jié)合使用超凈工作臺(tái)。d. 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸； e. 使用過(guò)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)物等必須經(jīng)過(guò)滅菌處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散；,培養(yǎng)基的配制,培養(yǎng)基的配制原則① 選擇適宜

21、的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 總體而言，所有微生物生長(zhǎng)繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮 源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水及能源，但由于微生物營(yíng)養(yǎng)類型復(fù) 雜，不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求是不一樣的，因此首先要根 據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需求配制針對(duì)性強(qiáng)的培養(yǎng)基。 ② 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適 培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時(shí)微生物才能生長(zhǎng)良好，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過(guò)低時(shí)不能滿足微生物正常生長(zhǎng)所需，濃度過(guò)高時(shí)則 可能對(duì)微生物生長(zhǎng)起抑制作用。,,③ 控制pH條件 各類微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)

22、物的最適pH條件各不相 同，一般來(lái)講，細(xì)菌與放線菌適于在pH7～7.5范圍內(nèi)生長(zhǎng)，酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6范圍內(nèi)生長(zhǎng)。 值得注意的是，在微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH發(fā)生變化，若不對(duì)培養(yǎng)基pH條件進(jìn)行控制，往往導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)速度下降或(和)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量下降。因此，為了維持培養(yǎng)基pH 的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，常用的緩沖劑是 一氫和二氫磷酸鹽(如KH2PO

23、4 和K2HPO4)組成的混合物。 ④ 滅菌處理,,培養(yǎng)基的配制流程以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例： 計(jì)算→稱量→溶(熔)化→調(diào)pH→滅菌→倒平板① 計(jì)算：根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計(jì)算制作 100mL 的培 養(yǎng)基時(shí)，各種成分的用量。② 稱量：準(zhǔn)確地稱取各種成分。 ③ 溶化：將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯，加入少量的水， 加熱。當(dāng)牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。往燒杯中加入稱量好的蛋白胨和氯化鈉，用

24、玻璃棒攪拌，使其溶解。加入 瓊脂加熱使其熔化。在此過(guò)程中不斷用玻璃棒攪拌，防止瓊脂糊底而 導(dǎo)致燒杯破裂。當(dāng)瓊脂完全熔化后，補(bǔ)加蒸餾水至 100mL。,④ 調(diào) pH：培養(yǎng)霉菌時(shí)需將 pH 調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需將 pH 調(diào)至中性。 ⑤ 滅菌： 將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，放入高壓滅菌鍋，在壓力為 100kPa，溫度為 121℃的條件下，滅菌 15～30min。 滅菌： 注意事項(xiàng)： a.滅菌的主要因素是溫度而

25、不是壓力。因此高壓鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力; b.滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力 表的壓力降至“0”時(shí)，打開(kāi)排氣閥，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。,⑥ 倒平板： 待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。 倒平板操作： a.將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形 瓶，左手拔出棉塞； b.右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過(guò)火焰； c.用左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)

26、一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培 養(yǎng)基（約 10～20mL）導(dǎo)入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋； d.等待平板冷卻凝固后，將平板倒置過(guò)來(lái)放置，使皿蓋朝下，皿底在上。,有關(guān)倒平板的操作錯(cuò)誤的是（ ）A． 將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上 B． 使打開(kāi)的錐形瓶瓶口迅速通過(guò)火焰 C． 將培養(yǎng)皿打開(kāi)，培養(yǎng)皿蓋倒放在桌子上 D． 等待平板冷卻凝固后需要倒過(guò)來(lái)放置A、將過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，防止培養(yǎng)皿被污染，A正

27、確；B、使打開(kāi)的錐形瓶瓶口迅速通過(guò)火焰，對(duì)錐形瓶的口徑處進(jìn)行灼燒滅菌，防止空氣中的雜菌污染，B正確；C、倒平板時(shí)不能把培養(yǎng)皿蓋完全打開(kāi)并放到桌面上，這樣會(huì)污染培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，C錯(cuò)誤；D、倒平板后冷卻需要倒過(guò)來(lái)放置，防止皿蓋上的水珠滴落到培養(yǎng)基上，D正確．故選：C．,（為什么要倒平板）,下列操作屬于滅菌方法的是（ ） A．接種前用酒精棉球擦拭雙手和工作臺(tái)面B．接種中試管口等易被污染的部位通過(guò)火焰 C．牛奶在 80℃下

28、煮 15min 以殺死其中的微生物 D．氯化汞溶液浸泡外植體 1～2min 后無(wú)菌水沖洗B巴氏消毒化學(xué)藥劑消毒,關(guān)于滅菌和消毒的不正確理解是（ ） A． 滅菌是指殺滅環(huán)境中的一切微生物包括芽孢和孢子 B． 消毒和滅菌實(shí)質(zhì)上是相同的，都能殺死一切微生物 C． 接種環(huán)用灼燒法滅菌 D． 常用消毒、滅菌方法有加熱法、過(guò)濾法、紫外線法、化學(xué)藥物法B、消毒是指消除或殺滅外環(huán)境中的病原體，使其無(wú)害化，滅菌則是要將所有的微生物和

29、病毒全部殺滅，以達(dá)到無(wú)菌的目的，滅菌一定可以達(dá)到消毒的目的，但消毒不一定能達(dá)到滅菌的效果，B錯(cuò)誤；C、接種工具常用灼燒法滅菌，C正確；D、常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學(xué)藥物消毒法等，滅菌可以采用高溫蒸汽滅菌法，D正確．故選：B．,消毒和滅菌是兩個(gè)不同的概念，滅菌是指徹底殺滅微生物使其永遠(yuǎn) 喪失生長(zhǎng)繁殖的能力．消毒僅指殺死一部分對(duì)人體有害的病原菌而 對(duì)被消毒的物體基本無(wú)害．下列哪些事物適用于消毒處理（ ）

30、①皮膚 ②飲用水 ③牛奶 ④注射器 ⑤培養(yǎng)皿 ⑥接種環(huán) ⑦培養(yǎng)基 ⑧果汁 ⑨醬油 ⑩手術(shù)刀 A． ①②③⑧⑨ B． ④⑤⑥⑦⑩ C． ①②④⑤⑥⑧ D． 以上全部,消毒指用比較溫和的方法殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，適用于那些不耐高溫的液體．如③牛奶、⑧果汁、⑨醬油，這樣可以使其中的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞．另外對(duì)要求不是很嚴(yán)格的①皮膚、②飲用水也用消毒的方法處理．而對(duì)于嚴(yán)格要求的④注射器、⑤培養(yǎng)皿、⑥接種環(huán)、⑦培養(yǎng)基、⑩手術(shù)刀等必須進(jìn)行滅菌處理

31、．所以，①②③⑧⑨應(yīng)該用消毒的方法處理．故選：A．,（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中，除考慮營(yíng)養(yǎng)條件外，還要考慮 ____ 、 ____ 和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、變異類型 容易選擇、 ______ 、 _____ 等優(yōu) 點(diǎn)，因此常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。 （2）在微生物培養(yǎng)操作過(guò)程中，為防止雜菌污染，需對(duì)培養(yǎng)基和培 養(yǎng)器皿進(jìn)行____(消毒、滅菌)；操作者的雙手需進(jìn)行清洗和_____； 靜止空氣中的細(xì)菌可用紫外

32、線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質(zhì)變性 ，還能 _______ 。（3）若用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌的個(gè)數(shù)，要想使所得估計(jì)值更接近實(shí)際值，除應(yīng)嚴(yán)格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測(cè)樣品稀釋的_______。（3）通常，對(duì)獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小，顏色等菌落特 征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步的 _________ 。 （4）培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，在接種前需要檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。對(duì)于 固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測(cè)方法是 ________ 。

33、（5） 若用大腸桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用過(guò)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)物必須經(jīng)過(guò) ________ 處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散。1 溫度 酸堿度 易培養(yǎng) 生活周期短2 滅菌 消毒 損傷DNA結(jié)構(gòu)3比例合適 3鑒定 和分類 4將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時(shí)間觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。5滅菌,,實(shí)驗(yàn)器具與材料,主要器具高壓蒸汽滅菌鍋，三角瓶，封口膜，培養(yǎng)皿，接種瓶，恒溫培養(yǎng)箱，搖床，酒精燈，超凈臺(tái)，裝有酒精棉球的廣口瓶，鑷子，

34、試管，棉塞，主要材料LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨+酵母提取物+氯化鈉+水）LB固體培養(yǎng)基（蛋白胨+酵母提取物+氯化鈉+瓊脂+水）空白斜面，大腸桿菌菌種斜面（保存在斜面培養(yǎng)基上的大腸桿菌）,,實(shí)驗(yàn)步驟,1培養(yǎng)基的配置2大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)3大腸桿菌的劃線分離培養(yǎng)4大腸桿菌的保存培養(yǎng)5實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論,1培養(yǎng)基的配置,1．稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需

35、加1g瓊脂。 (培養(yǎng)基中添加凝固劑如瓊脂，一般不能被微生物利用，只能起到凝固作用）2．溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂，整個(gè)過(guò)程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。 3．調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。,4．滅菌：在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅

36、菌15min。 5．倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過(guò)程是：①將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰；③用左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；④待平板冷卻凝固后，將平板倒過(guò)來(lái)放置。 倒過(guò)來(lái)放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過(guò)程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移已滅菌的培養(yǎng)基

37、時(shí)，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會(huì)在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。,滅菌和消毒,1．無(wú)菌技術(shù)：①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；②將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；③為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；④避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 2．消毒方法：①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；②對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；③對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)

38、首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒；④實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。 3．滅菌方法：①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；③表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。,比較消毒和滅菌：,注意事項(xiàng)：①實(shí)驗(yàn)中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在60～80℃烘箱中除去滅菌時(shí)的水分；

39、②物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開(kāi)排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，加熱結(jié)束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務(wù)必降至零時(shí)打開(kāi)鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸；③在用任何器皿轉(zhuǎn)接時(shí)，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺(tái)面上，接種時(shí)要在酒精燈火焰旁操作；④培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染；⑤接種時(shí)要膽大心細(xì)，動(dòng)作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵；⑥接種后

40、，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，水流擴(kuò)散會(huì)使菌落擴(kuò)散，就很難形成單菌落了。,2大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng),將保存大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角瓶放在左手中，靠近酒精燈火焰，右手拿著接種環(huán)，并用無(wú)名指和小指家住斜面的棉塞和三角瓶封口膜，將接種環(huán)在火焰上燒紅，冷卻后取斜面上的單菌落菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)集中，并用封口膜封口，在37度，每分鐘200轉(zhuǎn)的搖床上振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。,3

41、大腸桿菌的劃線分離培養(yǎng),1．劃線分離法：用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過(guò)程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在培養(yǎng)10～20h后，可由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會(huì)重疊。如果再將每個(gè)菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個(gè)斜面的菌群就是由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。,其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無(wú)名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開(kāi)。在此同時(shí)，用環(huán)狀

42、接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種針，通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。,灼燒的目的取菌種

43、前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到10－5 ～10－7之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開(kāi)的菌落。通常每

44、個(gè)培養(yǎng)皿有20個(gè)以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。劃線分離法，方法簡(jiǎn)單；涂布分離法，單菌落更易分開(kāi)，但操作復(fù)雜些。細(xì)菌的兩種分離法各有優(yōu)點(diǎn),都可采用。,4 大腸桿菌的保存培養(yǎng),在無(wú)菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37度下培養(yǎng)24小時(shí)，置于4度的冰箱中保存。菌種放在低溫環(huán)境中保存的目的是為了降低微生物的新陳代謝速率，延緩菌種細(xì)胞的衰老。,5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在37度恒

45、溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時(shí)后，看到劃線的開(kāi)始，菌落連續(xù)，說(shuō)明大腸桿菌在液體培養(yǎng)基里得到了大量擴(kuò)增，看到劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落，表明大腸桿菌已被分離。,,五、菌落和菌種種類的辨認(rèn),單個(gè)細(xì)菌用肉眼是看不見(jiàn)的，但是，當(dāng)單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，便會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。不同種類的細(xì)菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤度、透明度等方面具有一定的特征。 細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而

46、濕潤(rùn)的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺，長(zhǎng)孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動(dòng)；酵母菌落類似于細(xì)菌菌落，表面光滑而濕潤(rùn)，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。 如果菌落無(wú)法辨認(rèn)，只有借助于顯微鏡觀察。在顯微鏡下細(xì)菌一般為桿狀、球狀和弧狀，直徑都在1um左右；