食品有害微生物檢測與控制10大腸桿菌

1、食品有害微生物檢測與控制(10),食品中大腸桿菌的檢驗,大腸菌群的食品衛(wèi)生學意義,作為糞便污染食品的指標菌，MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對人體健康危害程度愈低作為腸道致病菌污染食品的指針，大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關系要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量,食品中大腸桿菌的檢驗,1982年美國 食物中毒；,我國：1997年在一定范圍內開展監(jiān)測，已陸續(xù)

2、有十余個省份在市售食品、進口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌，并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7，,GB4789.3-2010 大腸菌群測定,定義：Coliforms，一群在36℃培養(yǎng)48h可發(fā)酵乳糖、產酸 產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。該菌主要來 源自人畜糞便，作為糞便 污染指標評價食品的衛(wèi)生 狀況，推斷食品中腸道致 病菌污染的可能。,食品中大腸桿菌

3、的檢驗,大腸桿菌是人和溫血動物腸道內普遍存在的細菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時，可引起感染 。,大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。一般認為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。,總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳酸、產酸產氣、

4、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。,耐熱大腸菌群即糞大腸菌群，作為一種衛(wèi)生指標菌，耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物，因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染，可能存在大腸桿菌。但是，耐熱大腸菌群的存在并不代表對人有什么直接的危害。,致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞，具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）和腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等。,O157:H7（EH

5、EC)腸出血性大腸桿菌，感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴重的腸道傳染病，已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。,,,,,,大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關系,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,概述,生物學特性 1) 形態(tài)與染色 2) 培養(yǎng)特性 3) 生化特性 4）抵抗力 5）致病性 1) 形態(tài)與染色 G－、有鞭毛、無芽孢或有莢膜，兩端鈍圓短桿菌。大小為(1.1－1.5) &

6、#181;m X (2.0－ 6.0) µm (活菌)或(0.4－0.7) µm X(1.0－3.0) µm (染色菌)，絕大多數(shù)菌株有周身鞭毛，能運動，周身還有菌毛，無芽孢，某些菌株具有莢膜。,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,概述,2) 培養(yǎng)特性 在普通培養(yǎng)基上：長成2－3mm的S型小菌落； 在鮮血瓊脂平板上:生長，有些菌株可見β型溶血環(huán)**； 在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳

7、糖而產生有色菌落 在SS培養(yǎng)基上:大腸桿菌一般不能生長，少數(shù)生長的菌落也因發(fā)酵乳糖而呈紅色； 在伊紅美藍瓊脂平板上:生長成紫黑色帶有金屬光澤的菌落； 在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長，形成莢膜，管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,概述,3) 生化特性 大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖 ：葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；大部分菌株可迅速發(fā)酵乳

8、糖，各菌株對蔗糖、水楊苷、衛(wèi)矛醇及棉子糖的發(fā)酵力不一致，吲哚 ＋， MR ＋，V－P －，枸櫞酸胺鹽 －(I M V C + + - -)，尿素酶 －，硫化氫 －，氰化鉀培養(yǎng)基不中生長，丙二酸鹽利用－，可使谷氨酸和賴氨酸脫羧基，苯丙氨酸－，氧化酶－，接觸媒＋。,食品中大腸桿菌的檢驗,3 致病性 (1)致病因素：①侵襲力 ②內毒素 ③腸毒素 ①侵襲力 大腸桿菌具有K抗原和菌毛： K抗原：有抗吞噬作

9、用，有抵抗抗體和補體的作用 菌毛：能幫助細菌粘附于粘膜表面。有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥。 ②內毒素 大腸桿菌細胞壁具有內毒素的活性： 其脂類A是毒性部位 特異多糖有助于細菌抵抗宿主的防御機制。,Company Logo,概述,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,概述,③腸毒素 大腸埃希氏菌腸毒素有兩種： a.不耐熱腸毒素(LT)：

10、蛋白質，加熱65℃經30min即被破壞， 促進腸粘膜細胞大量分泌腸液,引起腹瀉； 生食 b.耐熱腸毒素(ST)，ST無免疫性，耐熱，100℃經10-20min不被破壞，它也可引起腹瀉。,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,概述,(2)所致疾病 ①腸外感染 ①腸外感染 泌尿系統(tǒng)感染 敗血癥 膽囊炎

11、 肺炎 新生兒或嬰兒腦膜炎等。,Company Logo,概述,②腹瀉 4 種大腸桿菌都可引起腹瀉： 產毒素大腸桿菌--是嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要原因； 致病性大腸桿菌--是嬰兒腹瀉的主要原因，嚴重者可致死； 侵襲性大腸桿菌--主要引起較大兒童和成年人腹瀉，有時甚至可引起爆發(fā)流行； 出血性大腸埃希氏菌 O157--引起的主要臨床癥狀是腹瀉(重者水樣腹瀉

12、)、腹痛、嘔吐，是老幼患者死亡的主要原因。,食品中大腸桿菌的檢驗,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,第一法：MPN法第二法： VRBA-MUG平板計數(shù)法第三法：Petrifilm測試片法,大腸菌群計數(shù)檢驗流程,,,,,,,0,將產氣的試管內樣品接種到BGLB肉湯,LST不產氣（-）?小導管里無氣泡,?LST產氣（+）,食品中大腸桿菌的檢驗,MPN法,第二法 VRBA平板計數(shù)法,,,,,,,選擇15~150平板計數(shù)

13、典型和可疑菌落,36℃±1 ℃ 18h ~24h,挑選10個菌落接種到BGLB,典型菌落為紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)，0.5mm,,食品中大腸桿菌的檢驗,MPN法,食品中大腸桿菌的檢驗,MPN法,大腸桿菌計數(shù)MPN法檢驗程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質,,10倍稀釋,,選擇3個連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST,,48±2h,36℃±1℃,不產氣,產氣,,,,EC肉湯,,45℃±0.2℃

14、,24±2h,,,不產氣,產氣,,,EMB瓊脂平板,,36℃±1℃,24±2h,,營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng),,生化試驗，革蘭染色,,查MPN表，報告,,,,如何報告結果？,根據(jù)經確證后的對應濃度陽性管數(shù)查MPN表MPN：最可能數(shù)，基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法,食品中大腸桿菌的檢驗,MPN法,食品中大腸桿菌的檢驗,美國食品藥品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，

15、2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria 原理：由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解β-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基傘形酮游離出來，在366nm紫外光下產生藍色熒光。觀察到藍色熒光即可認為是大腸桿菌陽性。 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷（MUG）對大腸桿菌的生長繁殖既沒有抑制作用也沒有促進作用，對菌落形態(tài)也沒有影響。

16、,Company Logo,VRBA-MUG平板計數(shù)法,第二法 VRBA-MUG平板計數(shù)法,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,VRBA-MUG平板計數(shù)法,VRBA-MUG平板計數(shù)法檢驗程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質,10倍系列稀釋,選擇2~3個適宜稀釋度的樣液，接種VRBA-MUG平板,紫外光下，計數(shù)發(fā)熒光的菌落,報告結果,,,,,36℃±1℃,18~24h,食品中大腸桿菌的檢驗,由希華

17、,徐標,李恒慶,宗雪梅.熒光法快速測定水中糞大腸菌群[J/OL].中國環(huán)境監(jiān)測,2019(02):1-5[2019-05-10].https://doi.org/10.19316/j.issn.1002-6002.2019.02.13.,Company Logo,VRBA-MUG平板計數(shù)法,選擇不同的地表水廢水樣品進行熒光法與多管發(fā)酵法比對測試，討論方法適用性。,熒光法與多管發(fā)酵法結果之間有顯著的線性相,食品中大腸桿菌的檢驗,Compa

18、ny Logo,PetrifilmTM測試片法,第三法 PetrifilmTM測試片法,PetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌群測試片是一種預先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和葡萄糖苷酶指示劑，可增強菌落計數(shù)效果。E .coli能產生?-葡萄糖苷酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應，產生藍色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產生的氣體。培養(yǎng)結束后計數(shù)藍點帶氣泡的菌落即為大腸桿菌數(shù)，紅點帶氣泡

19、和藍點帶氣泡的菌落之和為大腸菌群數(shù)。,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,PetrifilmTM測試片法,大腸桿菌PetrifilmTM測試片檢驗程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質,10倍系列稀釋,選擇2~3個適宜稀釋度的樣液，接種PetrifilmTM大腸桿菌測試紙片,計數(shù)藍色帶氣泡菌落,報告結果,,,,36℃±1℃,24±2h或48±2h,,食品中大腸桿菌的檢驗,Compan

20、y Logo,PetrifilmTM測試片法,史夢雨.消毒餐飲具中大腸菌群的兩種方法比較[J].中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2018,33(12):76-77.,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,PetrifilmTM測試片法,食品中大腸桿菌的檢驗,Company Logo,大腸菌群控制,大腸菌群控制（冷凍飲品生產為例子）,人,機,料,法,環(huán),食品中大腸桿菌的檢驗,大腸菌群控制,“人”,①完善企業(yè)更衣消毒設施，獨立設置更衣間與消毒間

21、，更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。,②消毒間安裝洗手池、酒精噴淋器、干手器。,③車間進入門口放鞋靴消毒池。,④嚴格規(guī)定進入生產車間的人員必須清洗和消毒手，必須穿經消毒的工作衣，更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進入車間。,食品中大腸桿菌的檢驗,大腸菌群控制,“機”,①嚴格落實《生產設施、設備清洗消毒制度》，定期對生產設備及管道用CIP 清洗消毒或用90 ℃以上的熱水消毒，預防大腸菌群的滋生和繁殖。②一旦產品中檢出大腸菌群，要對生產設備和

22、管道進行徹底消毒。,食品中大腸桿菌的檢驗,大腸菌群控制,“料”,①嚴格驗收原輔料，重點查驗大腸菌群項目，盡可能購買不含大腸菌群原輔料。②對原料產品標準中沒有檢驗大腸菌群的進行自檢，做到心中有數(shù)。③定期自檢生產用水，必要時進行殺菌處理。④包裝袋使用前進行紫外殺菌處理。,食品中大腸桿菌的檢驗,大腸菌群控制,“法”,①滅菌一定要徹底，一般溫度在90 ℃以上，滅菌15 min 以上，就能使產品達到無菌狀態(tài)。②注模消毒后一定要用無菌水進行沖

23、洗，避免注模二次污染。③要避免交叉污染，嚴格區(qū)分開生區(qū)和熟區(qū)。,食品中大腸桿菌的檢驗,大腸菌群控制,“環(huán)”,①在生產車間安裝足夠的紫外滅菌燈，對生產環(huán)境定時殺菌。②生產車間定時通風除濕，防止大腸菌群的滋生和繁殖。,,*1993年，Jack In The Box快餐連鎖店出售未煮熟的污染漢堡引起700多人（以兒童為主）食物中毒，并造成4人死亡。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠揚。* 2001年夏天，在大腸桿菌O157:H7

24、爆發(fā)殃及35人之后，ConAgra Foods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。美國疾病預防和控制中心估計，美國每年因大腸桿菌O157:H7致病總人數(shù)大約為73 000人，盡管上報的病例已有所下降。 *1998年，佐治亞州亞特蘭大水上公園發(fā)生的大腸桿菌O157:H7大爆發(fā)使得多名兒童住院。 *1996年5-8月，日本中學和幼兒園相繼發(fā)生多起大腸桿菌O157 集體 中毒事件，波及44個地區(qū)，7萬例，死亡12人.與芽菜有關

25、。,Company Logo,,,益生菌：不致病，能合成維生素B和維生素K，生產大腸菌素，對機體有利； 條件致病菌：在機體因內外因素所致抵抗力下降或菌體侵入腸外組織或器官時條件下致病； 致病菌：引起腸道感染的有四類： 產腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC） 出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC) 腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinv

26、asive E.coli，EIEC) 腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenic E.coli，EPEC） 帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒最重要原因，人的帶菌亦可污染食品，引起中毒。,Company Logo,,EMB瓊脂,主要成分：乳糖、營養(yǎng)物質。指示劑系統(tǒng)：伊紅和美監(jiān)。原理：大腸菌群分解乳糖產酸，使伊紅與美藍結合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可產生金屬光澤。黑色程度與光澤產生情況與伊紅、美藍二者

27、的比例有關。不發(fā)酵乳糖產酸的細菌，在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍結合，因而形成無色的菌落。部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。（應注意非典型的菌落）。典型菌落：具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。非典型的可疑菌落：粉紅色，無黑心,Company Logo,,靛基質試驗：甲基紅試驗：V-P試驗：檸檬酸鹽試驗：,Company Logo,4、甲基紅（MR）試驗和V-P試驗,二、常見生理生化試驗,糖（醇）類代謝

28、試驗,1、MR試驗原理： 一些細菌分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的PH值下降到4.5以下，加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色反應2、V-P試驗原理 一些細菌分解葡萄糖為丙酮酸，進一步脫羧產生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰丁二酮，進而與培養(yǎng)基內蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應生成紅色化合物。（試驗結果同MR試驗）,

29、二、常見生理生化試驗,糖（醇）類代謝試驗,V-P試驗 方法：將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振搖。,結果：在數(shù)分鐘內出現(xiàn)紅色為陽性；如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。,二、常見生理生化試驗,蛋白質和氨基酸的代謝試驗,1、明膠液化試驗 一些細菌可產生胞外酶，使明膠蛋白分解為氨基酸,而失去明膠的凝固能力。,陽性,陰性,2