生化藥物制造工藝郭偉云

1、重要生物藥物制造工藝,E-mail：xinmigwy@163.com Tel：3831677,發(fā)酵工程教研室 郭偉云,第 三 篇,1,2,3,本門課程由以下三大部分內(nèi)容組成,4,生物藥物的類別,（一）天然生物藥物 1.微生物藥物 microbial medicine 2.天然生化藥物 Biochemical medicine 3. 海洋生物藥物 marine medicine,（二）生物技術(shù)藥物

2、（新生物制品） 1.DNA重組藥物（DNA recombinant medicine）——基因工程與蛋白質(zhì)工程藥物 2. 基因藥物,（三）合成或半合成生物藥物,5,1.迅速被體內(nèi)酶降解2.腎小球過(guò)濾清除3.抗原－抗體反應(yīng)4.溶解度差導(dǎo)致沉淀,蛋白質(zhì)藥物在使用中出現(xiàn)的問(wèn)題,體外聚乙二醇修飾（PEG化）,(1)增大藥物分子量，避免被腎小球過(guò)濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(diǎn)(4

3、)增加藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學(xué)鍵在體內(nèi)隨時(shí)間水解，緩慢釋放藥物,,,,+,蛋白或多肽,偶聯(lián)物,聚乙二醇,,,CH3(-O-CH-CH)n-OH,修飾粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）延長(zhǎng)半衰期修飾人腫瘤壞死因子消除副作用修飾白介素I受體拮抗劑（rhIL-1Ra） 延長(zhǎng)半衰期修飾牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗腫瘤活性修飾超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修飾天冬酰氨酶（Aspartase） 克

4、服免疫原性提高半衰期修飾人干擾素（IFN）提高半衰期修飾血紅蛋白（Hb）血液代用品修飾胰島素提高半衰期,我國(guó)在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作,生化藥物制造工藝,第 十 三 章,9,生化藥物的定義、分類、特點(diǎn),,定義：具體運(yùn)用生物化學(xué)研究方法，從生物體中經(jīng)提取、分離、純化等手段獲得的天然存在的生化活性物質(zhì)或?qū)⑸鲜鲞@些物質(zhì)加以結(jié)構(gòu)改造或人工合成創(chuàng)造出的自然界沒(méi)有的新的活性物質(zhì)，通稱生化藥物（Biochemical medic

5、ine）。,10,重點(diǎn),分 類,,11,維生素類藥物,,,生化藥物的特性,,1．藥理學(xué)特性：,藥理活性高，針對(duì)性強(qiáng),毒副作用少，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,生理副作用常有發(fā)生免疫原反應(yīng)，過(guò)敏反應(yīng),12,生化藥物的特性,,2．理化特性：,13,3．天然生物藥物是新型藥物的先導(dǎo)物,通過(guò)合理的藥物設(shè)計(jì)，可以創(chuàng)造出療效更高，作用更專一，更易為機(jī)體接受，副作用與不良反應(yīng)更小的新藥。,14,有機(jī)溶劑分級(jí)分離、等電點(diǎn)沉淀等--------粗提物。,離子交換層析

6、、凝膠層析、超濾等技術(shù)--------提高了產(chǎn)品的純度和收率,多種層析技術(shù)、超速離心等--------高純度的生化藥物,15,生化藥物的資源,植 物,動(dòng) 物,動(dòng)物臟器血液、分泌物及其它代謝物,微 生 物,海 洋 生 物,16,主要從以下臟器中制取生化藥物,17,毒蜥,Exendin-4是自毒蜥唾液中提取的一種多肽，研究發(fā)現(xiàn)該多肽與人體內(nèi)的GLP-1在序列上有53％的同源性，同GLP-1一樣具有促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素

7、分泌及保護(hù)胰島β細(xì)胞等作用。2005年經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于二型糖尿病的治療。Exenatide是Exendin-4的人工合成品。,Exenatide,18,麻省Transmolecular公司的科學(xué)家將放射性I131附著于自蝎子毒液中提取的一種多肽制成藥物，研究發(fā)現(xiàn)該藥物具有靶向性，對(duì)晚期神經(jīng)膠質(zhì)瘤有較好療效，患者只需要從外部注射這種化合物，而無(wú)需再進(jìn)行化療或放射治療。,蝎 毒 肽,19,生物藥物的資源,植 物,動(dòng) 物,動(dòng)物臟器血

8、液、分泌物及其它代謝物,微 生 物,海 洋 生 物,20,利用微生物作為工具,微生物的代謝物,微生物菌體,21,生物藥物的資源,植 物,動(dòng) 物,動(dòng)物臟器血液、分泌物及其它代謝物,微 生 物,海 洋 生 物,22,海藻類：已知的海藻有1萬(wàn)多種,海洋動(dòng)物類：腔腸動(dòng)物類、節(jié)肢 動(dòng)物類、軟體動(dòng)物類、魚(yú)類、爬行動(dòng) 物類、海洋哺乳動(dòng)物類,海洋微生物：,23,僧袍芋螺,齊考諾肽（ziconotide）最初由僧袍芋螺中提取，現(xiàn)已人工合成，是一

9、種神經(jīng)細(xì)胞鈣通道阻斷劑。作為一種非阿片類鎮(zhèn)痛藥物，用于治療嚴(yán)重的慢性神經(jīng)性疼痛，其鞘內(nèi)注射劑經(jīng)FDA批準(zhǔn)于2005年上市。,齊考諾肽（ziconotide）,24,DidemninB是一種由7個(gè)氨基酸和2個(gè)羧酸組成的帶有分枝的環(huán)縮肽，既能抑制蛋白質(zhì)的合成,也能抑制DNA、RNA的合成，對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞周期作用的研究表明，它可殺傷各期細(xì)胞，尤以G1至S期細(xì)胞敏感，它可快速完全介導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。目前Didemin B已能夠人工全合

10、成。,海鞘來(lái)源的抗癌肽 Didemnin B,25,海兔體內(nèi)存在著多種結(jié)構(gòu)獨(dú)特、生理功能各異的次生代謝產(chǎn)物，如萜類、毒素、甾體、大環(huán)內(nèi)酯及肽類等，其中肽類化合物尤為引人注目。其中Dolastatin15和Dolastatin 10主要用于小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等實(shí)體瘤的治療。,海兔來(lái)源的抗癌作用肽,26,海藻類：已知的海藻有1萬(wàn)多種,海洋動(dòng)物類：腔腸動(dòng)物類、節(jié)肢 動(dòng)物類、軟體動(dòng)物類、魚(yú)類、爬行動(dòng) 物類、海洋哺乳動(dòng)物類

11、,海洋微生物：,27,第一節(jié) 氨基酸類藥物,28,本節(jié)內(nèi)容,氨基酸的種類,氨基酸類藥物的制造方法,29,氨基酸輸液,氨基酸的分類,蛋白質(zhì)氨基酸：編碼氨基酸,非蛋白氨基酸：D型氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸等,衍生氨基酸：5-羥色胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等,必需氨基酸和非必需氨基酸：亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸。,30,31,八種必需氨基酸：攜一兩本黃色書(shū)來(lái),攜--纈氨酸一--異亮氨酸兩--

12、亮氨酸本--苯丙氨酸黃--甲硫氨酸（硫?yàn)辄S色）色--色氨酸書(shū)--蘇氨酸來(lái)--賴氨酸,氨基酸記憶口訣,32,六伴窮光蛋：硫、半、光、蛋→半胱、光、蛋（甲硫）氨酸→含硫氨基酸 酸谷天出門：酸、谷、天→谷氨酸、天門冬氨酸→酸性氨基酸 死豬肝色臉：絲、組、甘、色氨酸→一碳單位來(lái)源的氨基酸 只攜一兩錢：支、纈、異亮、亮→纈、異亮、亮氨酸→支鏈氨基酸 一本落色書(shū)：異、苯、酪、色、蘇→異亮、苯丙、酪、色、蘇氨酸→生糖兼生酮 揀來(lái)精

13、讀之：堿、賴、精、組→賴氨酸、精氨酸、組氨酸→堿性氨基酸 芳香老本色：芳香、酪、苯、色→酪、苯丙、色氨酸→芳香族氨基酸 不搶甘肅來(lái)：脯、羥、甘、蘇、賴→脯、羥脯、甘、蘇、賴氨酸→不參與轉(zhuǎn)氨基的氨基酸,所有氨基酸：六伴窮光蛋， 酸谷天出門， 死豬肝色臉， 只攜一兩錢。 一本落色書(shū)， 揀來(lái)精讀之。 芳香老本色， 不搶甘肅來(lái)。,發(fā)酵法：蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、賴氨酸、亮氨酸等,酶法

14、：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等,氨基酸類藥物的制造方法,重點(diǎn),33,基本原理：,以毛發(fā)等蛋白質(zhì)為原料，通過(guò)酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法。,* 主要過(guò)程：水解、分離和結(jié)晶精制。,34,蛋白質(zhì)水解法,品種：L-胱氨酸、L－精氨酸、L－亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸及L-絲氨酸等。,酸水解法：水解迅速而徹底，無(wú)消旋作用；色氨酸破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基，且產(chǎn)生大量廢液污染環(huán)境

15、。堿水解法：水解迅速而徹底，色氨酸不被破壞；含羥基或巰基的氨基酸全被破壞，且產(chǎn)生消旋，工業(yè)上多不采用。酶水解法：反應(yīng)條件溫和，無(wú)需特殊設(shè)備，氨基酸不被破壞，無(wú)消旋作用；水解不徹底，產(chǎn)物中除氨基酸外，尚含有多肽。工業(yè)上主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨。,蛋白質(zhì)水解法,重點(diǎn),35,發(fā)酵的基本原理 借助微生物在有氧或無(wú)氧條件下進(jìn)行生命活動(dòng)制備微生物菌體或其代謝產(chǎn)物的過(guò)程。,發(fā)酵法,36,菌種誘變與選育,種子制備,發(fā)酵培養(yǎng),產(chǎn)物

16、分離純化,,,,發(fā)酵的基本過(guò)程,37,培養(yǎng)基配制與滅菌,,缺點(diǎn)產(chǎn)物濃度低，設(shè)備投資大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高。,*絕大部分氨基酸可通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)，有些由于得率低，未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。,38,基本原理：,又稱酶工程技術(shù)，是在特定酶的作用下使某些有機(jī)物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸的技術(shù)。,* 主要過(guò)程,前體合成,,菌體培養(yǎng),,轉(zhuǎn)化反應(yīng),,產(chǎn)品純化與精制,酶轉(zhuǎn)化法,39,,,,,,,微生物植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞,化學(xué)合成，生物合成，天然存在,底 物 （AA前體

17、）,生物反應(yīng)器,含L-AA反應(yīng)液,L-AA,,,,,,酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-AA流程,40,,,133.10,89.09,2.77,6.0,酸性氨基酸,中性氨基酸,溶于水和鹽酸，不溶于乙醇和乙醚,在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚,41,,,酶轉(zhuǎn)化反應(yīng),工藝路線,42,工 藝 路 線,43,* 優(yōu)點(diǎn)工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)物濃度高，轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)效率較高，副產(chǎn)物少，固定化酶或細(xì)胞可進(jìn)行連續(xù)操作，節(jié)省能源和勞務(wù)，并可反復(fù)使用。,* 缺點(diǎn)固定化細(xì)胞或固定

18、化酶代價(jià)高。,44,以酸、醛、酯及某些氨基酸為原料，經(jīng)氨解、水解、縮和、取代及氫化還原等化學(xué)反應(yīng)合成α-氨基酸的方法稱為化學(xué)合成法。,化學(xué)合成法,45,* 特點(diǎn)理論上所有氨基酸均可由化學(xué)合成法制造，但只有當(dāng)采用其他方法生產(chǎn)很不經(jīng)濟(jì)時(shí)才采用化學(xué)合成法生產(chǎn)。,46,,2005版中國(guó)藥典收載的氨基酸原料藥,氨基酸輸液,47,氨基酸輸液 多種結(jié)晶L-氨基酸依特定比例混合制成的靜脈內(nèi)輸注液稱為氨基酸輸液。

19、 當(dāng)由于疾病等原因，不能經(jīng)口攝取的時(shí)候，把純度高的氨基酸混合液作為最合適的氮源，從靜脈注入身體是比較合理的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給方法。,氨基酸輸液的組方原理與配方模式,48,不同類型的AA輸液，根據(jù)在臨床上的用途不同可以分為以下幾類：,49,思考題,氨基酸類藥物的制造方法有哪些？簡(jiǎn)述其原理及其過(guò)程？蛋白質(zhì)水解法有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？,50,第二節(jié) 多肽與蛋白質(zhì)類藥物,51,本節(jié)內(nèi)容,多肽與蛋白質(zhì)類藥物概述,多肽與蛋白質(zhì)類藥物的

20、制造方法,52,重要的多肽與蛋白質(zhì)類藥物的制備,53,多肽類藥物分類,54,多肽類藥物分類,55,蛋白質(zhì)類藥物分類,56,蛋白質(zhì)類藥物分類,57,化學(xué)合成法,基因工程法,多肽與蛋白質(zhì)類藥物的制造方法,重點(diǎn),58,原料選擇,蛋白質(zhì)藥物－Separation and Purification,59,重點(diǎn),,Protein--Separation,原料選擇,提取,60,重點(diǎn),清蛋白可溶于稀鹽、稀酸、稀堿?？杀伙柡土蛩徜@沉淀。eg:白蛋白

21、，卵清蛋白,球蛋白不溶于水但溶于稀鹽，可以被半飽和的硫酸銨沉淀。eg: IgG，肌球蛋白,谷蛋白不溶于水、醇和中性鹽溶液，但溶于稀酸或稀堿。eg:米谷蛋白,谷醇溶蛋白不溶于水及無(wú)水乙醇，但溶于70-80%乙醇中。非極性側(cè)鏈多eg:小麥醇溶蛋白,組蛋白溶于水和稀酸，但可被稀氨水沉淀，分子中含His、Lys多。eg:小牛胸腺組蛋白,魚(yú)精蛋白溶于水及稀酸，不溶于氨水，分子呈堿性。eg:鮭精蛋白,硬蛋白不溶于水、

22、稀酸、稀堿、鹽。有較強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度。eg:角蛋白，膠原,Protein--Purification,純化 根據(jù)目的蛋白與雜質(zhì)之間的差異進(jìn)行純化。1.根據(jù)蛋白質(zhì)的pI的不同進(jìn)行純化，其方法有：1）pI沉淀法 2）pI沉淀法與鹽析法相結(jié)合3）等電聚焦法 2.蛋白質(zhì)分子形狀和大小的不同進(jìn)行純化，其方法有 1）凝膠過(guò)濾 2）超濾法 3） 離心法

23、 4）透析法3.蛋白質(zhì)的溶解度不同進(jìn)行純化，其方法有： a)鹽溶與鹽析法 b）結(jié)晶法 c）有機(jī)溶劑沉淀法4.蛋白質(zhì)電離性質(zhì)不同進(jìn)行分離：離子交換法5.蛋白質(zhì)功能專一性不同進(jìn)行純化：親和層析法6.蛋白質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中分配不同進(jìn)行純化：萃取法7.蛋白質(zhì)的選擇性吸附的性質(zhì)進(jìn)行純化：吸附法8.蛋白質(zhì)的其他特殊性質(zhì)進(jìn)行純化,62,重點(diǎn),,蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)和等電點(diǎn),,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在

24、某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) （isoelectric point，pI）,等電聚焦電泳（Isoelectric focusing—IEF）,Isoelectric focusing,,凝膠過(guò)濾層析Gel filtration chromatography,,超濾（ultrafiltration）,原理:是利用壓力或離心力，強(qiáng)

25、行使水和其他小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在半透膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的,,透析（dialysis）,原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透而將其與小分子物質(zhì)分開(kāi) 常用的半透膜為玻璃紙或纖維素材料,按照分子大小進(jìn)行分離，分離取決于透析袋截留的分子量。,透析——只用來(lái)除鹽類和小分子雜質(zhì),,鹽析(salt precipitation),原理：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀

26、。,鹽溶,原理：分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中,,有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀,脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間相互作用。,,,陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：平衡離子帶正電荷 陰離子交換樹(shù)脂：平衡離子帶負(fù)電荷,陽(yáng)離子交換層析過(guò)程,離子交換樹(shù)脂,蛋白質(zhì),,,高離子強(qiáng)度洗脫液洗,高離子強(qiáng)度洗脫液洗,加樣,,平衡液洗,,,,,收集,離子交換層析（ Ion exchange ）,,Affinity

27、chromatography,,分離純化方法的選擇,1.分離純化早期使用方法的選擇特點(diǎn)：提取液中的物質(zhì)十分復(fù)雜，目的蛋白濃度較稀。方法選擇原則：低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大為合適。,2.各種分離純化方法的使用順序原則：相同性質(zhì)的純化方法一般不重復(fù)使用。純化方法順序先后的安排上要考慮到有利于減少工序，提高效率。3.分離純化后期的保護(hù)性措施4．對(duì)每一步驟方法的優(yōu)劣進(jìn)行綜合評(píng)價(jià) 每一個(gè)分離純化步驟方法的好壞

28、，除了從分辨本領(lǐng)和重現(xiàn)性二方面考慮外， 還注意方法本身的回收率的高低。,80,重點(diǎn),純化方法選擇指南,81,多肽與蛋白質(zhì)的化學(xué)合成概述,,合成原理：是一個(gè)重復(fù)添加AA的過(guò)程，一般自C端向N端合成。,合成方法： （1）液相合成 （2）固相合成 （1963年R.B.Merrifield 創(chuàng)立，并

29、因此獲1984年 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）,82,多肽合成的主要步驟 氨基的保護(hù)和羧基的活化 羧基的保護(hù)和氨基的活化 接肽和去保護(hù)基氨基保護(hù)基 芐氧羰基——強(qiáng)酸脫除 叔丁氧羰基（BOC）——三氟乙酸（TFA）脫除 9-芴甲氧羰基（Fmoc）——堿脫除,83,多肽的固相合成（Fmoc保護(hù)法）（1978年改

30、進(jìn)的方法，避免了強(qiáng)酸處理）,84,N,N′-二環(huán)已基碳酰亞胺,9-芴甲氧羰基,胰島素,胰腺是人體重要的消化器官，主要包括分泌消化酶為主的外分泌細(xì)胞和導(dǎo)管系統(tǒng)，及由多種內(nèi)分泌細(xì)胞組成的胰島。胰島素是由胰島中ß細(xì)胞分泌的肽類激素，分子結(jié)構(gòu)為51個(gè)氨基酸組成有兩個(gè)二硫鍵連接的2條肽鏈。,胰島素單體,胰島,胰腺,85,胰島素的合成與分泌,ß細(xì)胞最初生成胰島素原，后經(jīng)分泌小泡運(yùn)送到細(xì)胞膜，由胞吐作用經(jīng)細(xì)胞膜釋放入血。釋放過(guò)程

31、中脫去一段C肽，形成A、B鏈結(jié)構(gòu)的胰島素。血液中內(nèi)生胰島素和C肽的比例是對(duì)等的。,胰島素原,C肽,B鏈,86,胰島素的結(jié)構(gòu),胰島素的兩個(gè)肽鏈分別為21個(gè)氨基酸組成的A鏈和30個(gè)氨基酸組成的B鏈。氨基酸排列有種屬差異。豬胰島素與人胰島素僅在B鏈第30位氨基酸上有所不同，牛胰島素在A鏈上還有兩個(gè)氨基酸不同。,人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu),87,豬胰島素牛胰島素賴脯人胰島素（禮來(lái)公司、速效Ins） 門冬胰島素 （諾和諾德公司、速效Ins

32、 ） 甘精胰島素 (安萬(wàn)特公司、長(zhǎng)效Ins),,人胰島素（Insulin）,B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29B28 A21 ;B31 ;B32,88,胰島素,用X線衍射法測(cè)出豬胰島素晶體的立體結(jié)構(gòu)為(中國(guó)，1971)：六個(gè)胰島素分子和兩個(gè)鋅離子的胰島素六聚體。兩個(gè)胰島素分子形成二聚體，三個(gè)二聚體圍繞著三重軸形成對(duì)稱排列的六聚體。作為胰島素的儲(chǔ)存形式，在胰島素

33、制劑注射到人體內(nèi)也需要經(jīng)過(guò)由六聚體解離為二聚體，再分解為單體釋放入血液被利用的過(guò)程。,89,3D Structure of Insulin,胰島素二聚體（dimer）,胰島素六聚體（hexamer ）,90,20世紀(jì)末——人胰島素類似物研制成功,胰島素的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)對(duì)維持其生物活性有很重要的意義，人工合成的胰島素制劑受此影響在皮下注射后需有一定的解離時(shí)間才能發(fā)揮效力，故治療時(shí)需提前20-30分鐘注射胰島素。糖尿病人需要更接近生理狀態(tài)

34、、使用方便的胰島素制劑。利用基因重組技術(shù)，修飾胰島素的氨基酸組合。,91,目前臨床使用的胰島素來(lái)源,,92,動(dòng)物來(lái)源的胰島素（28種）,93,半合成來(lái)源的胰島素（5種）,94,基因重組來(lái)源的胰島素（27種）,95,通化東寶 1998年12月研制出中國(guó)第一支基因重組胰島素“甘舒霖” 甘舒霖® R-- 常規(guī)重組人胰島素注射液 甘舒霖® N-- 低精蛋白重

35、組人胰島素注射液 甘舒霖® 30R-- 30/70混合重組人胰島素注射液 （ 30%常規(guī)重組人胰島素和70%低精蛋白重組人胰島素）深圳科興 蘇泌啉-- 常規(guī)重組人胰島素注射液 蘇泌啉恩-- 低精蛋白重組人胰島素注射液 徐州萬(wàn)邦 萬(wàn)邦林-- 常規(guī)重組人胰島素注射液

36、 萬(wàn)蘇林—豬胰島素制劑,胰島素國(guó)內(nèi)主要生產(chǎn)廠家,其他（持有藥品注冊(cè)證） ---南京新天生物化學(xué)制藥有限公司、華西醫(yī)科大學(xué)制藥廠、上海第一生化制藥廠、武漢生化制藥廠 等。,96,臨床用胰島素分類,普通胰島素：從動(dòng)物胰臟中提取人胰島素傳統(tǒng)中長(zhǎng)效胰島素 長(zhǎng)效人胰島素類似物速效人胰島素類似物非注射胰島素,97,,傳統(tǒng)中長(zhǎng)效胰島素制劑 低精蛋白鋅胰島素：胰島素、魚(yú)精蛋白和鋅的結(jié)晶

37、。 例：禮來(lái)公司， Humulin N(rDNA、大腸桿菌) 諾和諾德， Novolin N (rDNA、釀酒酵母) 胰島素鋅混懸液：精蛋白鋅胰島素與常規(guī)胰島素的混懸液 例：禮來(lái)公司， Humulin 30/70 (30%常規(guī)胰島素，70%精蛋白鋅胰島素) Humulin 50/50

38、 諾和諾德， Novolin 30/70 Novolin 50/50缺陷：作用時(shí)間少于24小時(shí)作用峰值明顯，夜間低血糖危險(xiǎn)性高吸收不穩(wěn)定結(jié)霜現(xiàn)象，由于溫度過(guò)冷或過(guò)熱導(dǎo)致胰島素在玻璃瓶壁沉淀，喪失活性,,,98,長(zhǎng)效胰島素-人胰島素類似物,1. 甘精胰島素（ glargine ）： 商品名Lantus®--

39、----甘氨酸替代胰島素A鏈21位門冬氨酸、并在B鏈末端增加兩 個(gè)精氨酸。 ●使胰島素結(jié)合更多帶正電的氨基酸殘基，改變等電點(diǎn)，使等電點(diǎn)由5.4上升至中性。這樣，胰島素類似物在酸性條件下可溶，在生理的近中性條件下結(jié)晶。2. Insulin Detemir：商品名Levemir ® ------胰島素B鏈29位賴氨酸側(cè)鏈通過(guò)?；B接一個(gè)N-16-烷基 酸的14碳游離脂肪酸●該游離脂肪酸能與

40、白蛋白結(jié)合，延緩與胰島素受體結(jié)合，從而延長(zhǎng)其半衰期。,99,Insulin Detemir（Levemir ® ）諾和諾德公司研制,,glargine （Lantus®）法國(guó)安萬(wàn)特公司研制,100,速效胰島素,特點(diǎn)：起效快，皮下注射后15分鐘起效。 達(dá)峰快，注射后15分鐘起效，30～60分鐘達(dá)到藥效高峰。藥效維持時(shí)間短，大約在3小時(shí)左右（2～4小時(shí)）。,藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與進(jìn)餐后人體內(nèi)源性胰島素分泌十分相似，

41、能夠很好地控制當(dāng)餐后血糖而且不容易發(fā)生低血糖。,101,B26-30對(duì)于胰島素結(jié)合于胰島素受體的功能無(wú)關(guān)，但是對(duì)胰島素形成二聚體有關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 。因此對(duì)此區(qū)段進(jìn)行修飾將產(chǎn)生一些自聚合能力下降但是與胰島素受體結(jié)合能力不變的新型速效胰島素類似物 。,研制機(jī)理,已上市藥物： Lispro 、 Aspart、Apidra,102,Lispro （賴脯胰島素 ，Humalog ® ）是第一個(gè)用于臨床的速效胰島素類似物，由美國(guó)禮來(lái)公司研制

42、生產(chǎn)，將人胰島素的B28與B29位的氨基酸對(duì)換。,103,,優(yōu)泌樂(lè)賴脯胰島素,Aspart（門冬胰島素，Novolog ® ）由丹麥諾和諾德公司研制生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)與人胰島素的區(qū)別在于用天冬氨酸取代了B鏈28位上的脯氨酸。,104,諾和銳門冬胰島素,諾和銳30特充,APIDRA （賴谷胰島素，Apidra ® ）安萬(wàn)特公司研制，以賴氨酸和谷氨酸分別取代了人胰島素B3位的天冬氨酸和B29位的賴氨酸。,,105,胰島素肺部

43、吸入制劑--------Exubera,美國(guó)輝瑞、Nektar公司以及法國(guó)萬(wàn)安特共同研發(fā)于2006.1.27被FDA批準(zhǔn)一種作用快的胰島素干粉吸入劑適用于餐前給藥，其胰島素吸收具有速效化的特征,106,非注射用胰島素,正在研究中的其它非注射胰島素給藥途徑包括:     口腔噴霧     鼻腔給藥    

44、60;直腸栓劑給藥 均還在研究階段     滴眼劑     透皮或口腔粘膜給藥,,107,胰島素注射方式的改進(jìn),幾十年來(lái),胰島素注射器已經(jīng)有了很大的改進(jìn)。許多品牌廠商制造胰島素專用注射器,針頭經(jīng)過(guò)特殊處理,因而注射時(shí)不感到疼痛,而且針眼很小。注射器針筒上直接標(biāo)有胰島素單位(IU)，注射幾個(gè)單位胰島素只要按標(biāo)記抽取,不

45、需換算。,一次性注射器,108,胰島素注射方式的改進(jìn),一種利用高壓將胰島素“噴”入皮下的裝置，無(wú)需針頭，加之其經(jīng)久耐用，常給懼怕針頭的兒童使用。但此裝置價(jià)格較貴，拆洗安裝過(guò)程較繁瑣，噴射時(shí)局部壓力較大，尚未廣泛推廣使用。目前高壓注射器多用于人群計(jì)劃免疫和多人集中注射的情況。,高壓無(wú)針注射儀,109,胰島素注射方式的改進(jìn),胰島素筆是一種形如鋼筆的專用注射裝置,將胰島素液儲(chǔ)存于筆中,使用前調(diào)好劑量旋鈕,患者自己注射方便易行。胰島素筆配有專

46、用筆盒,可隨身攜帶,更方便于旅行出差時(shí)使用。筆上配有觸感式劑量調(diào)整旋紐 ，也能適用于眼睛不方便的患者。,胰島素筆,110,胰島素注射方式的改進(jìn),胰島素泵是目前最方便、最現(xiàn)代化的注射方式，可以自動(dòng)定時(shí)定量地注射胰島素，能較好模擬生理性胰島素分泌，可以準(zhǔn)確控制胰島素的輸入劑量，并能經(jīng)導(dǎo)管連續(xù)不斷按需要將胰島素輸入患者皮下。隨著技術(shù)的發(fā)展，胰島素泵越發(fā)小巧，功能亦不斷完善，目前的胰島素泵僅重約100克,如一臺(tái)尋呼機(jī)大小，攜帶方便。,胰島素泵

47、,111,胰島素制備工藝,,重點(diǎn),112,Ins的性質(zhì),113,Insulin crystas,酸醇提取法提取動(dòng)物胰島素,114,注意事項(xiàng),115,,酶促半合成人胰島素,116,,重組DNA技術(shù)制造人胰島素,AB鏈合成法：以人工合成的人胰島素A鏈和B鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融合基因，分別在大腸桿菌中表達(dá)A鏈和B鏈，然后再通過(guò)化學(xué)氧化作用，通過(guò)二硫鍵連接起來(lái)。反轉(zhuǎn)錄酶法：通過(guò)胰島素原的cDNA合成，表達(dá)產(chǎn)物是胰島素原，經(jīng)工具

48、酶切開(kāi)，除去C-肽得人胰島素。,117,,,Ins A鏈,Ins B鏈,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,發(fā)酵,A鏈,B鏈,純化,二硫鍵,活性胰島素,AB鏈合成人胰島素,118,,反轉(zhuǎn)錄酶法合成人胰島素,119,思考題,目前多肽和蛋白質(zhì)類藥物的制造方法有哪些？提取分離純化法生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥物包括哪些過(guò)程？有哪些注意事項(xiàng)？目前胰島素的制備方法有哪些？,120,第三節(jié) 核酸類藥物,Nucleic acid Medicine,121,本節(jié)內(nèi)容,核酸類藥

49、物概述,核酸類物質(zhì)的分離提取及其發(fā)酵生產(chǎn),122,重要的核酸類藥物的制備,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,堿基,,,,,,,,DNA：AGCT,RNA：AGCU,RNA：D-α-核糖 DNA：D-α-脫氧核糖,123,,,一、核酸類藥物概述,（一）依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成分類：分四類,124,125,抑制尿酸合成，解熱鎮(zhèn)痛抗炎,1、核酸堿基及其衍生物別嘌呤醇（Allopu

50、rinol）、巰嘌呤（Mercaptopurine）、磺硫嘌呤（Tisupurine）、氟尿嘧啶等2、核苷及其衍生物腺苷類：腺苷、腺苷甲硫氨酸（SAM）、阿糖腺苷(Ara-A)等尿苷類：尿苷、呋喃氟尿嘧啶、氮雜尿苷（Azauridine）等胞苷類：阿糖胞苷（Ara-C）、環(huán)胞苷、氮雜胞苷等肌苷類：肌苷、肌苷二醛、異丙肌苷等脫氧核苷類：氮雜脫氧核苷、脫氧硫鳥(niǎo)苷等,126,3.核苷酸及其衍生物單核苷酸類：AMP、UMP、IMP

51、、cAMP、CoA等核苷二磷酸類：尿二磷葡萄糖（UDPG）、胞二磷膽堿（CDP-Choline)等核苷三磷酸類：ATP、CTP、UTP、GTP等核苷酸類混合物：5－核苷酸、2 －核苷酸、3－核苷酸等4.多核苷酸二核苷酸：CoⅠ、CoⅡ、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）多核苷酸類：RNA、DNA、poly I:C、poly A:U、轉(zhuǎn)移因子（TF）等,（二）依據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及臨床應(yīng)用情況分類,1、具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)如：肌苷、A

52、TP、GTP、CTP、UTP、Co I 等來(lái)源：提取或發(fā)酵特點(diǎn)：毒副作用小用途：有助于改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量平衡，加速受損組織的修復(fù)，臨床已廣泛應(yīng)用于放射病、血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥、慢性肝炎、心血管疾病等。,127,（二）依據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及臨床應(yīng)用情況分類,2、自然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核酸類結(jié)構(gòu)的類似物如：巰嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等來(lái)源：以核酸類物質(zhì)為前體通過(guò)“化學(xué)法” 或“酶法

53、”進(jìn)行半合成特點(diǎn)：毒性較大用途：是當(dāng)今人類治療病毒、腫瘤、艾滋病等的重要手段，也是產(chǎn)生干擾素，免疫抑制的臨床藥物。,128,疊氮胸苷(AZT, azidothymidine)：又名齊多夫定，是胸苷的類似物，它能抑制HIV的復(fù)制，阻止病毒的增生。由英國(guó)首先開(kāi)發(fā)，于1987年上市，為臨床上第一個(gè)抗HIV的藥物。,HIV-1,,,人的細(xì)胞,,,反轉(zhuǎn)錄,,,,RNA,,cDNA,,整合入宿主DNA,新病毒,AZT在病毒RNA→DNA的階段是

54、反轉(zhuǎn)錄酶的底物，但在細(xì)胞中卻不是DNA聚合酶的合適底物。這樣AZT的作用是一種選擇性的毒物，可以抑制病毒cDNA的產(chǎn)物，阻斷新的病毒的合成。,129,反義藥物,反義核酸是指天然存在的或人工合成的，能與靶DNA或RNA堿基互補(bǔ)，并能與之結(jié)合特異阻斷其翻譯的一段DNA或RNA。反義核酸技術(shù)是指利用反義核酸特異地抑制某些基因的表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)。,130,,Reverse transcription,中心法則 (Central Do

55、gma),,Replication,131,反義藥物優(yōu)點(diǎn)： 1)高度特異性； 2)高生物活性、豐富的信息量； 3)高效性； 4)最優(yōu)化的藥物設(shè)計(jì)； 5)低毒、安全

56、反義藥物缺點(diǎn)：天然的寡核苷酸難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而一旦進(jìn)入又易被胞內(nèi)核酸酶降解，很難直接用于治療。,反義藥物,132,133,二、核酸類物質(zhì)的分離提取及其發(fā)酵生產(chǎn),DNA和RNA在細(xì)胞中常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白的形式存在。 在濃NaCl（1～2mol/L）溶液中， DNA-核蛋白（DNP）的溶解度很大， RNA-核蛋白（RNP）的溶解度很小，在稀NaCl （0.14 mol/L）溶液中，DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大。因此可利用

57、不同濃度的NaCl溶液，將DNP和RNP分別抽提出來(lái)。,DNA與RNA的提取與制備,核酸的提取,DNA的提?。阂话闶抢肈NA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液而不溶于0.14mol/L NaCl溶液。RNA的提?。豪肦NA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl溶液的性質(zhì)，先提取得到RNP。,134,重點(diǎn),將抽提得的核蛋白用SDS處理，DNA或RNA即與蛋白質(zhì)分開(kāi)，可用

58、氯仿-異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇，DNA即析出。為防止DNA或RNA酶解，提取時(shí)加入EDTA。,135,,,工業(yè)用RNA的提取,,,,RNA制備,具有生物活性RNA的制備,RNA的生產(chǎn),136,1、工業(yè)用RNA的提取,稀堿法,酵母等,,1％NaOH裂解細(xì)胞壁,溶液,,HCL中和,,加熱破壞酶,,冷卻到10OC,,離心,RNA溶液,,調(diào)pH2-2.5（接近RNApI）,,離心,RNA沉淀,濃鹽

59、法,酵母等,,10％NaCL,90OC提取,,離心,上清液,,調(diào)pH2-2.5,,離心,RNA沉淀,137,2、具有生物活性RNA的制備,138,從核糖核蛋白中分離RNA,(1)乙醇沉淀法：,核糖核蛋白,,溶于NaHCO3,水相,,用含辛醇的氯仿去蛋白,,乙醇,RNA沉淀,(2)鹽酸胍法：,核糖核蛋白,,2～4鹽酸胍38℃溶解,,冷卻至0℃,,離心,RNA沉淀,139,,DNA生產(chǎn)方法,1.工業(yè)用DNA的提取,140,141,核苷酸的制

60、備,142,重點(diǎn),（一）酶解法及堿水解法制備核苷酸,酶液,,DNA液,保溫,,,酶解液,,,,加熱，過(guò)濾,DNA降解液,,離子交換吸附，洗脫,dAMP、dCMP、dGMP、dTMP,酶解法制備脫氧核苷酸,143,酶水解: DNA或RNA為原料制備5′－核苷酸,常用的酶：橘青霉產(chǎn)生的5′－磷酸二酯酶,橘青霉培養(yǎng)液,,壓濾,酶液,,【酶解】,除菌體,DNA溶液,,酶解液,,加熱、調(diào)pH9.0,過(guò)濾,DNA降解液,,【離子交換】,吸附于氯型陰

61、離子樹(shù)脂,,分部洗脫,脫氧核苷酸,(dCMP、dAMP、dTMP、dGMP),RNA,,降解,,進(jìn)一步分離,戊糖核苷酸,144,堿水解：可制備3’和2’－核苷酸,145,（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸,146,,嘌呤核苷酸合成的中心,,產(chǎn)氨短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肌苷酸（IMP）：腺嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型嘌呤核苷酸生物合成途徑和代謝調(diào)控,R5P,,PRPP,,PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶,PRA,,,,IMP,,,分解,,腺嘌呤阻遏,GMPAMPADPATP,,反饋抑制,

62、,SAMP,,AMP,,ADP,,ATP,,XMP,,GMP,,GDP,,GTP,,鳥(niǎo)嘌呤,,PP,,,GMPATP,PRPP,,GTP,次黃嘌呤,,鳥(niǎo)嘌呤GMP,,147,◆保證IMP合成路線暢通： 保證關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活力---解除腺嘌呤及衍生物的阻遏和反饋抑制◆阻斷IMP的去路： 阻斷SAMP合成 阻斷IMP的分解篩選獲得缺乏SAMP合成酶的腺嘌呤缺陷菌株，提供亞適量的腺嘌呤?！羰狗e累的IMP

63、滲透到細(xì)胞外： 增大細(xì)胞膜通透性選育Mn2+不敏感的變異株,IMP積累的主要途徑（前提）,148,,肌苷酸的發(fā)酵生產(chǎn),（一）直接發(fā)酵法：原料易得，效率較高，但有自身的反饋調(diào)節(jié)和存在降解肌苷酸的酶系。（二）二步發(fā)酵法（目前生成肌苷酸的主要方法）1、發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷2、肌苷磷酸化：Inosine(肌苷)＋ATP→IMP＋ADP（三）半合成法生產(chǎn)肌苷酸 在發(fā)酵過(guò)程中添加前體物次黃嘌呤后，經(jīng)由微生物產(chǎn)生的胞外酶轉(zhuǎn)化成

64、肌苷酸。但次黃嘌呤來(lái)源困難，至今未工業(yè)化生產(chǎn)。,149,重點(diǎn),核苷的制備,150,發(fā)酵法生產(chǎn)核苷,151,枯草芽孢桿菌嘌呤核苷酸合成途徑,,,,,SAMP,AMP,IMP,,,GMP,XMP,3,4,5,6,7,8,黃嘌呤缺陷型,（II）,鳥(niǎo)嘌呤缺陷型（經(jīng)誘變?nèi)笔?號(hào)酶）,（III）,,,,AICAR,SAICAR,PRA,PRPP,,,,,2,1,,,,（一）,（一）,（一）,（一）,1：PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶2、7：SAMP裂解酶3：

65、IMP脫氫酶4：XMP氨化酶5：GMP還原酶6：SAMP合成酶8：AMP脫氫酶,當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量腺嘌呤時(shí)Ⅰ 積累IMP 肌苷Ⅰ＋Ⅱ 積累IMP 肌苷Ⅲ 積累XMP 黃苷,,,,,,,,,,,枯草桿菌的磷酸單酯酶活力很強(qiáng),ADP,（Ⅰ）,152,思考題,核酸提取的原理是什么？目前核苷酸制備有哪些方法？肌苷酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法有哪些？,153,第四節(jié) 酶類藥物,154,本節(jié)內(nèi)容,酶類藥物的概述,酶類

66、藥物的提取與純化,155,重要的酶類藥物的制備,酶的分類,156,157,158,,原料選擇,生物材料的預(yù)處理,提取,濃縮,純化,結(jié)晶,,,,,,159,酶類藥物的提取和純化,原料選擇,動(dòng)植物組織,富含所需物質(zhì),生理狀態(tài)及營(yíng)養(yǎng),提純方便廉價(jià),動(dòng)物宰殺后立即取材,原 則,,受限較多，產(chǎn)量有限,微生物發(fā)酵是發(fā)展方向,160,,原料選擇,生物材料的預(yù)處理,提取,濃縮,純化,結(jié)晶,,,,,,161,酶類藥物的提取和純化,,1、動(dòng)物材料

67、的預(yù)處理：（1）機(jī)械法：有絞碎、刨碎、勻漿、研磨、超聲波、擠壓等方法，有些酶用機(jī)械法處理后仍不能有效的提取，可結(jié)合其他處理法。（2）反復(fù)凍融：冷到-10℃左右，再緩慢溶解至室溫，如此反復(fù)多次。由于細(xì)胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細(xì)胞中顆粒及整個(gè)細(xì)胞破碎，使酶釋放出來(lái)。（3）丙酮粉：組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可以減少 酶的變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開(kāi)，促使某些結(jié)酶釋放

68、到溶液中。,,生物材料的預(yù)處理,162,重點(diǎn),163,,原料選擇,生物材料的預(yù)處理,提取,濃縮,純化,結(jié)晶,,,,,,164,酶類藥物的提取和純化,詳細(xì)了解酶的性質(zhì)，保持酶活性。,,酶的濃縮,（1）工業(yè)上：超濾、離子交換濃縮、真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍干燥濃縮,（2）實(shí)驗(yàn)室： 除上述方法外，對(duì)少量樣品可用下列方法 1. 凝膠吸水法：用SephadexG-15或G-25吸水，再經(jīng)離心或過(guò)濾 2. 用聚乙二醇濃縮,16