藥品無菌檢查

1、藥品無菌檢查及相關知識,吉林省藥品檢驗所微生物室,主要內容,1、藥品無菌檢查法基礎2、2015年版藥典無菌檢查法的變動3、潔凈實驗室微生物的監(jiān)測和控制4、菌種的管理5、二級生物安全實驗室,藥品無菌檢查法,定義及特點培養(yǎng)基、沖洗液方法學驗證供試品的無菌檢查無菌檢查的要點,藥品無菌檢查法,無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表

2、明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現微生物污染。也并不表示所有的產品都是無菌的。反之，當供試品中檢出微生物污染，則可以認為批產品的微生物污染風險相當高。,藥品無菌檢查法,無菌制劑比非無菌制劑存在更高的風險一系列的藥品不良事件2006年的“欣弗事件”---安徽華源生產的“克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液”引起了11人死亡，93人感染，企業(yè)倒閉，總經理自殺。未按批準的工藝參數滅菌，降低滅菌溫度、縮短滅菌時間，增加滅菌柜裝載量，影響了滅菌效果，經中

3、檢所檢驗，發(fā)現無菌不合格。2012年10月，美國新英格蘭合成制藥中心生產的注射用類固醇霉菌污染，造成數百人感染真菌腦炎，至年底統(tǒng)計死亡39人。這些事故促使無菌制劑GMP監(jiān)管的進步，同時也對無菌檢驗提出更高更嚴的要求。,藥品無菌檢查法,特點無菌檢驗結論為一次性，藥典規(guī)定為不得復試，為什么不得復試，菌落的分布具有不均勻性，檢驗過程是破壞性的，不具有重復性。---------------對操作過程的要求非常高。過程的控制------

4、----1、環(huán)境控制；2、操作影響，人員、物流是否引入外源性污染？,無菌性檢查,靈敏度檢查,SOP操作,有效的結果,有效的方法,環(huán)境保證,培養(yǎng)基保證,方法學驗證,過程控制,結果判斷,可靠的結論,,藥品無菌檢查法,培養(yǎng)基配制后采用驗證合格的滅菌程序滅菌。什么是驗證合格的？保存條件：2-25℃、避光，非密閉容器在3周內使用，密閉容器一般在1年內使用。流乙醇酸鹽流體：供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層不超過深度的1/5，否則100℃水浴加熱至

5、粉紅色消失（不超過20分鐘），只能加熱一次，培養(yǎng)結束后氧化層不超過1/2,藥品無菌檢查法,藥品無菌檢查法,培養(yǎng)基適用性檢查無菌性—每批次培養(yǎng)基取不少于5瓶（支），培養(yǎng)14天，應無菌生長。靈敏度 6種菌（<100cfu） 金、銅綠、生孢---------流乙醇酸鹽流體 7支，12ml/支，每種菌接種2支，陰性一支， 枯草、白念、黑曲--

6、--------胰酪大豆胨液體 7支，每種菌接種2支，9ml/ 支，一支陰性 流乙醇酸鹽流體培養(yǎng)3天，胰酪大豆胨液體 5天， 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判斷該培養(yǎng)基的靈敏度符合規(guī)定,藥品無菌檢查法,沖洗液0.1%蛋白胨水溶液pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液可選用其他經驗證過的適宜的溶液,藥品無菌檢查法,方法適用性試驗證明所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。若檢驗程序或產品發(fā)生變化可能影響檢驗結

7、果時，應重新進行方法適用性試驗。菌種：金葡、大腸、枯草、生孢、白念、黑曲方法：1、薄膜過濾 2、直接接種,藥品無菌檢查法,薄膜過濾法試驗組：取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。將培養(yǎng)基加至濾筒內。對照組：另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，培養(yǎng)時間不得超過5天。,藥品無菌檢查法,直接接種法 取流乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（

8、不少于15ml）6管，分別加入金葡、大腸、生孢各2管，其中一管接入供試品，另一管作為對照，TSB（不少于10ml）6管，分別加入枯草、白念、黑曲各2管，其中一管加入供試品，另一管作為對照，培養(yǎng)時間不得超過5天。結果判斷：與對照管比較，試驗組的試驗菌生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計； 如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長----供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌

9、作用-----增加沖洗量、培養(yǎng)基用量、中和劑或滅活劑、更換濾膜品種，重新進行方法適用性試驗。,藥品無菌檢查法,供試品的無菌檢查 檢驗數量：一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量 出廠產品按表1，上市產品監(jiān)督檢驗按表2 最少檢驗數量不包括陽性對照用的。 檢驗量：按表3，采用薄膜過濾法時，只要供試品

10、特性允 許，應將所有容器內的全部內容物過濾。,藥品無菌檢查法,1、薄膜過濾法 封閉式薄膜過濾器只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾抗生素樣品選用低吸附的濾膜水溶性供試品過濾前先將少量沖洗液過濾以潤濕濾膜油類供試品的濾膜和濾器在使用前應充分干燥沖洗量一次一般為100ml，總沖洗量不得超過1000ml，以免膜上的微生物受損?？倹_洗量特別大時應盡量減小流速。,藥品無菌檢查法,水溶性的液體--

11、---直接過濾或混合至含不少于100ml適宜稀釋液的無菌容器中，混勻，立即過濾，如供試品有抑菌作用，須沖洗一般不少于三次。水溶性的固體----溶取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽復溶。非水溶性供試品-----直接過濾，或乳化后（加吐溫80等）立即過濾，用含0.1-1%吐溫80的沖洗液沖洗，培養(yǎng)基中可加入吐溫80可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油性供試品-----溶解于適量無菌十四烷酸異丙酯中，過濾，加熱仍然沒法過濾的，萃取，靜置

12、，取水層過濾無菌氣霧劑----在-20℃冷凍1小時，取出在容器上鉆一小孔釋放拋射劑后再無菌開啟容器，轉移至無菌容器中。裝有藥物的注射器供試品——注意應采用適宜的方法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查帶有導管的醫(yī)療器具（輸血、輸液袋等）---每個最小包裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內壁，過濾沖洗液。同時注意應采用直接接種法對配帶的無菌針頭做無菌檢查,藥品無菌檢查法,2、直接接種法培養(yǎng)基的用量符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基

13、體積的10%，同時，流乙醇酸鹽每管裝量不少于15ml，TSB不少于10ml適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的。,藥品無菌檢查法,混懸液等非澄清水溶液供試品 取規(guī)定量，等量接種至各管培養(yǎng)基中固體供試品 取規(guī)定量，直接等量接種至各管培養(yǎng)基中，或加入適宜的溶劑溶解，或按標簽說明復溶后，取規(guī)定量等量接種至各管培養(yǎng)基中。非水溶性供試品 加入適量的乳化劑及稀釋劑使其乳化再接種，或直接接種至含乳化劑的培養(yǎng)基中敷料供試品 以無菌

14、操作拆開每個包裝，于不同部位剪取約100mg或1cm*3cm的供試品，等量接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。腸線、縫合線等供試品 取最小包裝，無菌拆開包裝，等量接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。滅菌醫(yī)用器具供試品 必要時將其拆散或切成小碎段，等量接種于各管足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中。放射性藥品 取供試品1支，等量接種于裝量為7.5ml的流乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和TSB中。每管接種量為0.2ml。,藥品無

15、菌檢查法,陽性對照 無抑菌作用及抗革蘭氏陽性菌為主的----金葡 抗革蘭氏陰性菌為主的------大腸 抗厭氧菌的------生孢梭 抗真菌的-----白念 陽性對照72小時內生長良好 陰性對照 相應的溶劑、稀釋液、沖洗液同法操作， 不得有菌生長,藥品無菌檢查法,培養(yǎng)及觀察液體培養(yǎng)基渾濁 物理變化？化學變化？生物學變化？培養(yǎng)14天，逐日觀察并記錄

16、，注意和陽性、陰性對比，培養(yǎng)14天后依然無法從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液轉種至同種新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天，觀察是否再次出現渾濁。,藥品無菌檢查法,若明顯渾濁------怎么辦？1）立即轉接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保存；3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；4）如果發(fā)現硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應增加血平板劃線，并在厭氧條件下

17、培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應進一步鑒定，并逐一保藏。,藥品無菌檢查法,結果判斷陽性對照生長良好，陰性不得有菌，否則試驗無效若供試品澄清，或雖然渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定若任何一管渾濁并確證有菌生長，判不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，符合下面至少一個條件：1、無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求2、回顧試驗過程，發(fā)現有可能引起微生物污染的因素3、供試品管中生長的微生物經

18、鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。 若確認無效，應重試。,藥品無菌檢查法,要點一個標準的SOP，物料進場，外圍消毒劑消毒表面，拆除外包裝，潔凈傳遞，風淋、紫外照射，過氧化氫滅菌等，由低級別向高級別遞進，最后到達A級核心區(qū)人員進場，合理的更衣程序，A/B級：應用頭罩將所有頭發(fā)以及胡須等相關部位全部遮蓋，，必要時戴防護目鏡。應戴經滅菌且無顆粒物（如滑石粉）散發(fā)的橡膠或塑料手套，穿經滅菌或消

19、毒的腳套，褲腿應塞進腳套內，袖口應塞進手套內。工作服應為滅菌的連體工作服，不脫落纖維或微粒，并能滯留身體散發(fā)的微粒。無菌操作技術，動作熟練，關鍵點的控制實驗過程的監(jiān)控：環(huán)境菌，表面微生物，手部微生物，對環(huán)境菌進行鑒定，建立檔案，以便OOS調查，進行溯源。,2015年版藥典的變化,主要修訂點改良馬丁培養(yǎng)基修訂為胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基（TSB）無菌檢查實驗條件由“萬級下的局部百級”修訂為“B+A”三部藥典的統(tǒng)一,2015年版藥典的變

20、化,培養(yǎng)基的變化,2015年版藥典的變化,意義1、與國際接軌USP\BP2、培養(yǎng)-觀察的體系改變，取消嚴格意義上的以真菌、細菌劃分的培養(yǎng)，而以需氧、厭氧的培養(yǎng)體系來劃分，是一個更加廣泛，更加互補的體系。,2015年版藥典的變化,培養(yǎng)基的改變導致陽性菌的培養(yǎng)條件改變培養(yǎng)基靈敏度實驗：,2015年版藥典的變化,方法適用性實驗：,2015年版藥典的變化,菌種的培養(yǎng)條件改變,2015年版藥典的變化,無菌檢查實驗條件由“萬級下的局部百級”

21、修訂為“B+A”和以前的100級、10000級的區(qū)別？需要怎么控制環(huán)境？,潔凈實驗室,潔凈室的定義及分級兩版藥典對潔凈室的要求對比潔凈室微生物的監(jiān)測與控制微生物鑒定隔離器簡介消毒劑的選擇與使用幾種空間滅菌方法,潔凈實驗室,潔凈室的定義與分級藥品潔凈實驗室是指用于藥品無菌或微生物檢驗用的潔凈實驗室、隔離系統(tǒng)及其它受控環(huán)境。潔凈室不是絕對無菌的。概念不等于無菌室（命名需準確）,潔凈實驗室,潔凈室的分級ISO146

22、44---按懸浮粒子大小劃分了潔凈室的級別（等級1-9級）ISO14698---潔凈室及其相關控制環(huán)境,潔凈實驗室,各國不同法規(guī)對于潔凈室污染控制的要求對比美國聯邦標準FED-STD-209E：率先建立了由懸浮粒子含量規(guī)定空氣潔凈度的分級標準，以每立方英尺空氣所含最大允許微粒的數量確定，分為1、10、100、1000、10000、100000六個級別。國際標準ISO14644-1：空氣潔凈度分為9個級別，比美國聯邦標準多出3個。

23、美國FDA《無菌工藝藥品CGMP工業(yè)指南》：以動態(tài)期間在物料漏置臨近處所測數據為依據，強調了動態(tài)概念，對微生物進行了控制，100、1000、10000、100000對應ISO5、6、7、8美國藥典《1116》：根據美國聯邦標準改編，M1-M7歐盟GMP：A、B、C、D，靜態(tài)、動態(tài)監(jiān)測、強調了粒子的在線監(jiān)測2010年版GMP:等同于歐盟,潔凈實驗室,按空氣懸浮粒子大小和數量的不同參考現行“藥品生產質量管理規(guī)范”分為A、B、C、D 4

24、 個級別。,潔凈實驗室,初次使用的潔凈實驗室應進行參數確認，確認參數包括物理參數、空氣懸浮粒子和微生物。,物理參數,空氣懸浮粒子,微生物,浮游菌,沉降菌,表面微生物,空氣過濾器完整性，氣流組織、空氣流速，換氣次數、壓差、溫度和相對濕度,,參數確認,,執(zhí)行標準《潔凈室施工及驗收規(guī)范》附錄D3 高效空氣過濾器現場掃描檢漏方法粒子計數器法、附錄E12 氣流的檢測、附錄E1 風量和風速的檢測、附錄E2 靜壓差的檢測、附錄E5 溫濕度的檢

25、測,潔凈實驗室,2015年版與2010年版的物理指標相比 100級與A級比較，單向流斷面風速相差較大，100級潔凈區(qū)需要增加循環(huán)風量才能達到A級，10000級潔凈區(qū)空調系統(tǒng)需要增加1倍的送風量，才能達到B級,潔凈實驗室,潔凈室微生物監(jiān)測和控制 定期清潔、消毒、消毒效果驗證包括：非生物活性的空氣懸浮粒子數和有生物活性的微生物監(jiān)測，其中微生物監(jiān)測包括環(huán)境浮游菌和沉降菌監(jiān)測，及關鍵的檢測臺面、人員操作服表面及5 指手

26、套等的微生物檢測。,潔凈實驗室,懸浮粒子用于空氣潔凈度分級的空氣懸浮粒子尺寸范圍在0.1μm-1000μm的固體和液體粒子。,潔凈實驗室,方法：GB/T16292-2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的測試方法》采樣點數目：最少采樣數，兩種方法，一、NL—最少采樣點A—潔凈室或被控潔凈區(qū)的面積，單位為平方米（單向流，垂直于氣流方向上的橫截面積）,潔凈實驗室,二|查表,潔凈實驗室,采樣點位置與分布：離地面0.8m高度的水平面

27、上均勻分布采樣點多于5點時，也可在離地面0.8-1.5m高度的區(qū)域內分層布置，每層不少于5點靜態(tài)測試時，采樣點布置力求均勻（附錄A），動態(tài)測試，應根據關鍵操作區(qū)布置。,潔凈實驗室,采樣次數：對任何小潔凈室（區(qū)）或局部空氣凈化區(qū)域，采樣點數目不少于2個，總采樣次數不少于5次，每個采樣點的采樣次數可以多于1次，不同采樣點的采樣次數可以不同每次采樣量：,潔凈實驗室,計算：（計算詳細見GB標準）結果：每個采樣點的平均懸浮粒子濃度必須

28、不大于規(guī)定的級別界限全部采樣點的懸浮粒子濃度平均值均值的95%置信上限必須不大于規(guī)定的級別界限，UCL≤級別界限,潔凈實驗室,浮游菌、沉降菌：,潔凈實驗室,方法：GB/T16293-2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》 GB/T16293-2010 《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》浮游菌最少采樣點——參照懸浮粒子 GB/T16292-2010采樣點的位置——參照懸浮粒子 GB/T16292

29、-2010 工作區(qū)測點位置離地0.8-1.5m左右（略高于工作面） 送風口測點位置離開送風面30cm左右。 可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加測點。采樣次數——每個采樣點采樣一次,潔凈實驗室,最小采樣量：,注意事項單向流區(qū)域，采樣器采樣口朝向應正對氣流方向；非單向區(qū)域，采樣口朝上。采樣點避開回風口。測試人員站在采樣口的下風側，盡量少走動。為避免培養(yǎng)皿運輸

30、或搬動過程的影響，應對培養(yǎng)皿做陰性對照（不暴露采樣），應無菌生長。記錄———測試者名稱，日期，測試依據，潔凈室的平面位置，測試儀器，方法描述，包括測試環(huán)境條件，采樣點位置，布置圖，測試次數，采樣量，測試儀器檢定證書，動態(tài)測試應記錄現場人員數量位置，設備的數量和位置，測試結果。,潔凈實驗室,結果每點浮游菌平均濃度（個/m3）=菌落數/采樣量 結果評定每個測點的浮游菌平均濃度必須低于標準的界限靜態(tài)測試，某點浮游菌平均濃度超過

31、評定標準，則應重新采樣兩次，兩次結果均合格才能判定為合格。,潔凈實驗室,沉降菌 最少采樣點參照懸浮粒子GB/T16292-2010 采樣點的位置參照懸浮粒子GB/T16292-2010最少培養(yǎng)皿數,潔凈實驗室,結果計算平均菌落數=(M1+M2+……MN)/NM1——1號培養(yǎng)皿菌落數N ——培養(yǎng)皿總數結果評定—同浮游菌,潔凈實驗室,表面微生物表面微生物測定是對環(huán)境、設備和人員的表面微生物進行監(jiān) 測，方

32、法包括接觸碟法和擦拭法。接觸碟法——將充滿規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基的接觸碟對規(guī)則表面或平面進行取樣，然后置合適的溫度下培養(yǎng)一定時間并計數，每碟取樣面積約為25 cm2，微生物計數結果以cfu/碟報告；擦拭法——接觸碟法的補充，用于不規(guī)則表面的微生物監(jiān)測，特別是設備的不規(guī)則表面。擦拭法是采用合適尺寸的無菌模板確定擦拭的面積，取樣后，將拭子置合適的緩沖液或培養(yǎng)基中，充分振蕩，然后采用適宜的方法計數，每個拭子取樣面積為約25 cm2，微生物計數結

33、果以cfu/拭子報告。接觸碟法和擦拭法采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間同浮游菌或沉降菌（一般采用TSA，當監(jiān)測結果有疑似真菌或考慮季節(jié)因素影響時，可增加SDA）表面菌測定應在實驗結束后進行。,潔凈實驗室,推薦的藥品潔凈實驗室的監(jiān)測頻次及監(jiān)測項目,潔凈實驗室,如果出現連續(xù)超過糾偏限和警戒限、關鍵區(qū)域內發(fā)現有污染微生物存在、空氣凈化系統(tǒng)進行任何重大的維修、消毒規(guī)程改變、設備有重大維修或增加、潔凈室（區(qū)）結構或區(qū)域分布有重大變動、引起微生物污

34、染的事故、日常操作記錄反映出傾向性的數據時應考慮修改監(jiān)測頻次。,潔凈實驗室,潔凈實驗室,偏差處理 當微生物監(jiān)測結果超出警戒限度和糾偏限度時，應當按照偏差處理規(guī)程進行報告、記錄、調查、處理以及采取糾正措施，并對糾正措施的有效性進行評估。微生物鑒定 建議對受控環(huán)境收集到的微生物進行適當水平的鑒定1、有助于預期常見菌群。2、有助于評估清潔/消毒方法、消毒劑的有效性。3、有助于污染源的調查，輔助OOS調查。,潔凈實

35、驗室,微生物鑒定通則9205“藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則”建議對潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進行鑒定，以掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染調查。無菌試驗結果陽性和無菌生產模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗時，對檢出的微生物鑒定至少達到種屬水平，必要時達到菌株水平。,潔凈實驗室,微生物鑒定借助現有的分類系統(tǒng)，通過對未知微生物的特征測定，對其進行細菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分，或屬、種及菌株水平確定的過程。,潔凈實驗室,鑒定

36、程序—分離純化—初篩試驗—表型微生物鑒定—基因型微生物鑒定（16SrDNA、 18SrDNA、聚合酶鏈式反應、DNA-DNA雜交、焦磷酸測序、多位點序列分型等 ）,潔凈實驗室,分離純化純培養(yǎng)物是指來源于同一單細胞的細胞群體平板劃線法是最常用的技術,潔凈實驗室,初篩試驗（革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察細胞形態(tài)、重要的生化反應） 重要的生化篩選試驗—氧化酶試驗：氧化酶陽性：不發(fā)酵的革蘭氏陰性桿菌、

37、 氧化酶陰性：腸道菌—過氧化氫酶試驗 陽 性：葡萄球菌 陰性：鏈球菌—凝固酶試驗 陽 性：致病性

38、 陰性：非致病性,潔凈實驗室,表型微生物鑒定—培養(yǎng)物 （菌落形態(tài)、菌落顏色、形狀、大小和產色素）—形態(tài)學（細胞形態(tài)、大小、形狀、鞭毛、內容物、革蘭氏染色、芽孢 和抗酸染色、孢子形成模式）—生理學（氧氣耐受性、pH值范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性）—生化反應（碳源利用、碳水化合物的氧化或發(fā)酵、酶的模式）—抑制性（膽鹽耐

39、受性、抗生素敏感性、染料耐受性）—血清學（凝集反應、熒光抗體）—化學分類（脂肪酸構成、微生物霉素、全細胞組分）—生態(tài)學（微生物來源）,潔凈實驗室,基因型微生物鑒定—微生物由于特殊環(huán)境的影響，表型特征常發(fā)生變異，傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定手段難以得到種水平結果，以其核酸序列為鑒定基礎，從遺傳進化角度闡明微生物種群之間的分類學關系—（16SrDNA、 18SrDNA、聚合酶鏈式反應、DNA-DNA雜交、焦磷酸測序、多位點序列分型等 ）,潔凈實

40、驗室,潔凈實驗室,潔凈實驗室,—《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》對細菌的分類是通過遺傳物質的分析比較來實現?！蜩b定法不但技術需要保證，還需要昂貴的分析設備和材料，通常在關鍵微生物調查中使用，如產品不合格調查，若使用，方法必須經過確認鑒定方法的確認包括：準確度、專屬性、重現性、靈敏度、陽性預測值、陰性預測值,潔凈實驗室,隔離器 分類：硬倉、軟倉結構：1、空氣處理系統(tǒng)（高效空氣過濾器） 2、傳遞接口及傳

41、遞門 3、滅菌設備（一般為過氧化氫、過氧乙酸等滅菌） 4、配套設備與輔助設備,潔凈實驗室,潔凈實驗室,潔凈實驗室,隔離系統(tǒng)的驗證1、操作驗證2、隔離器完整性驗證3、滅菌驗證4、滅菌循環(huán)驗證5、隔離器內部潔凈度驗證6、儀器儀表驗證,潔凈實驗室,藥品潔凈實驗室怎樣實現微生物的良好控制？處于受控狀態(tài)？1、硬件設施的滿足 潔凈室的驗收應符合規(guī)范，換氣次數，送風量、環(huán)境溫濕

42、度等等2、良好的環(huán)境管理， 清潔、消毒程序，并嚴格執(zhí)行，選擇適當的消毒方式，合理的消毒劑，清潔消毒頻率。監(jiān)測到位。3、減少人員干預，人是最大的污染源，規(guī)范人員進出潔凈區(qū)的程序，嚴格按照A/B潔凈區(qū)的要求做好人員防護。做好人員培訓。4、控制物流的干擾，做好物流的消毒、外表面滅菌工作，減少物流的污染5、應當對監(jiān)測數據進行分析、回顧，通過收集的數據和趨勢分析，總結和評估潔凈實驗室是否受控。,潔凈實驗室,消毒劑的選擇與使用微生物的抗力

43、從小到大排列一般為：—細菌繁殖體—真菌繁殖體—真菌孢子—病毒—分枝桿菌—細菌芽孢,潔凈實驗室,消毒劑選擇、使用 將消毒劑種類分為四個作用水平（1）滅菌：可殺滅一切微生物（包括芽孢）達到滅菌保證水平的方法。甲醛、戊二醛、環(huán)氧乙烷、過氧乙酸、過氧化氫等。（2）高水平消毒法：可以殺滅各種微生物，對芽孢殺滅達到消毒效果的方法。這類消毒方法應能殺滅一切細菌繁殖體（包括結核分枝桿菌）、病毒、真菌及其孢子和絕大多數細菌芽孢

44、。用含氯、二氧化氯、過氧乙酸、過氧化氫、含溴消毒劑、臭氧、二溴海因等甲基乙內酰脲類化合物和一些復配的消毒劑等消毒因子進行消毒的方法。（3）中水平消毒法：殺滅和去除細菌芽孢以外的各種病原微生物的消毒方法，碘類消毒劑(碘伏、碘酊等)、醇類、醇類和氯已定的復方，醇類和季銨鹽類化合物的復方、酚類等消毒劑進行消毒的方法。（4）低水平消毒法：只能殺滅細菌繁殖體（分枝桿菌除外）和親脂病毒的化學消毒劑。如單鏈季銨鹽類消毒劑(苯扎溴銨等)、雙胍類消毒

45、劑如氯己定、植物類消毒劑和汞、銀、銅等金屬離子消毒劑。,潔凈實驗室,消毒劑的配制：1、按供應商的使用說明配制和儲存。2、A/B級區(qū)域應使用經除菌過濾的消毒劑。3、盡量高級別的水配制，純化水、滅菌水、注射用水,配好后放置一會。影響消毒劑效力的因素： 濃度、接觸時間、 pH值、溫度、微生物的數量和種類,潔凈實驗室,消毒劑的選擇原理1、根據市售消毒劑的抗菌譜、根據區(qū)域等級，A/B級選用殺孢子劑，其他區(qū)域可配合使用其他水平的消

46、毒劑，定期使用殺孢子劑。2、根據使用說明，規(guī)范使用濃度和作用時間3、根據待消毒表面的材質。如對設備表面的腐蝕程度對操作者的安全性。（殘留、腐蝕、粘膜刺激）4、和清潔劑，其他消毒劑的相容性5、選用多種類的消毒劑，交替使用，避免微生物對其產生耐受性。,潔凈實驗室,幾種空間滅菌方法：熏蒸滅菌概念 1980年收錄于USP，在一定溫度和壓力的密閉條件下，化學消毒劑轉為氣態(tài)滲透到生物體內，使生物致死。有助于降低潔凈區(qū)死角的微

47、生物污染。 甲醛：對所有微生物都有殺滅作用。殺孢子劑 通常推薦12小時滅菌時間，排氣、通風至少24小時，過程漫長，有致癌作用，現在已很少使用 臭氧：對所有微生物都有殺滅作用。殺孢子劑 無殘留，無污染，臭氧對人體有害，為強氧化劑，對多種物品有損壞，橡膠老化、銅片生銹，織物褪色等。過氧化氫：對所有微生物都有殺滅作用。殺孢子劑 2H2O2→2 H2O+O2過氧化氫滅菌安全，環(huán)

48、境友好，不產生有毒有害殘留物最終分解產物為H2O和O2，無毒無殘留。,潔凈實驗室,紫外消毒的應用紫外線：空氣消毒、物體表面消毒 用UV進行表面消毒時，要求燈管距離污染表面不超過1m，30WUV燈照射時，照射時間不應短于30分鐘，燈管周圍1.5-2.0m為消毒有效區(qū)。應對燈的紫外線照射強度進行監(jiān)測，當強度低于規(guī)定值時，及時更換。方法：生物指示劑/物理學檢測生物指示：大腸桿菌，照射劑量應達到20000μw·s/c

49、m2 ,枯草桿菌黑色變種芽孢應達到100000μw·s/cm2 。物理學檢測方法：燈管的紫外線強度（μw/cm2）用中心波長為253.7nm的紫外線強度測定儀（標定有效期內），在燈管垂直位置1m處測定。,潔凈實驗室,判定指標（1）電壓220V，室溫20～25℃， 253.7nm紫外線輻射強度（垂直1m處） 普通30W直管型紫外線燈≥70μw/cm2； 高強度紫外線燈 ≥200μw /cm2。

50、（2）表面消毒接受的照射劑量，應達殺滅目標微生物所需。應達到100000μw.s /cm2。 劑量（μw.s /cm2）=輻射強度（μw/cm2）×時間（s）。,菌種的管理,《9203 藥品微生物實驗室質量管理指導原則》 藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。CMCC-----中國醫(yī)學菌種保藏中心 CMCC（

51、F）\CMCC（B）,F--------真菌；B--------細菌ATCC-美國標準菌種收藏中心,菌種的管理,定義標準菌株 至少定義到屬或種水平的菌株。按其特征進行分類和描述，有明確的來源。標準儲備菌株 從國內或國外菌種保藏機構獲得的標準菌株經過復活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，即為標準儲備菌株。應進行純度和特性確認?？捎糜谥苽涿吭禄蛎恐? 次轉種的工作菌株。工作菌株 由標準菌株、標準儲備菌株轉接后

52、獲得的同種菌株。工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5 代。,菌種的管理,菌種的管理,申購：菌種管理人員提出購買申請驗收：接受菌種時應檢查菌種的名稱，代號，數量，完整性，記錄信息。菌種復活：冷凍菌種的復活，無菌操作打開玻璃管，用相應的液體培養(yǎng)基0.5-1ml溶解冷凍菌種，轉移至適宜的培養(yǎng)基中復活。確認：用無菌接種環(huán)取復活的培養(yǎng)物，在相應的培養(yǎng)基平板上劃線分離培養(yǎng)，觀察典型的菌落形態(tài)，菌落形態(tài)的一致性，挑取單個菌落形態(tài)進行革蘭氏染

53、色、鏡檢，觀察染色特性及微生物形態(tài)學特征，生化反應或用菌種鑒定系統(tǒng)進行進一步鑒定。,菌種的管理,保藏-----確保在相應的保藏條件下的菌種不會變異且性能穩(wěn)定，經濟簡便。甘油冷凍保藏：液體培養(yǎng)物加入等體積的20%甘油，混勻，分裝于1ml的小管，-80℃---30℃保存；或菌苔刮取后分散于無菌水中，加入等體積20%甘油的TSB中。再分裝。瓷珠保藏法　 將培養(yǎng)好的微生物細胞或孢子制成懸浮液，轉入裝有無菌多孔玻璃珠（或瓷珠）的無

54、菌瓶中，使其吸附于玻璃珠表面，去除多余懸浮液，低溫冷凍保存的一種菌種保藏方法。 SN/T 2660-2010 食品微生物實驗室菌種保藏方法：-70℃可保存10年斜面低溫保藏： 把待保藏菌接種在適宜的斜面培養(yǎng)基表面，充分生長后，在4℃左右冰箱保存。銅綠不能用此法保存。,菌種的管理,菌種的管理,傳代：工作菌株的傳代次數不得超過5 代（標準菌株為第0 代）。1 代是指將活的培養(yǎng)物接種到微生物生長的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，任何形式的轉種

55、均被認為是傳代1次。傳代時，應對工作菌株的特性和純度進行確認。 使用：使用工作菌種制備菌液，做好記錄。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2-8度，可在24小時內使用。銷毀：傳代、使用過程產生的所有活的微生物均應進行高壓滅菌處理。,菌種的管理,菌種的標識 每一支菌種都應以適當的標簽、標識來表示其名稱、菌號、接種日期、代數等信息。,例如1：大CMCC(B)44102標140606/0/3，其中“大”表

56、示大腸埃希菌，“標”代表標準菌株，“140606”指標準菌株的購買日期即2014年6月6日，“0”代表是零代，“3”代表是一共購買3支。 例如2：大CMCC(B)44102儲（瓷）140606/2/10，其中“大”表示大腸埃希菌，“儲”代表標準儲備菌株， “瓷”表示用瓷珠保藏法來保藏此菌種，“140606”指標準儲備菌株的傳代日期即2014年6月6日，“10”代表是一共制備了10支。,生物安全實驗室,生物安全實驗室簡介二級生物安全實

57、驗室的建設要求生物安全柜的分類與特點二級生物安全柜的使用,生物安全實驗室,《人間傳染的病原微生物名錄》根據微生物的危害程度將其分為4類，藥品微生物檢測所涉及到的菌都為第三類，應該在二級生物安全實驗室操作。具有一定的生物安全防護水平的實驗室統(tǒng)稱為生物安全實驗室。通過標準化的建筑、生物安全設備配置、個人防護、翔實的SOP 和嚴格的管理來實現 。,生物安全實驗室,氣溶膠 aerosol 懸浮于氣體介質中 粒徑一

58、般為 0.001-100μm的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的穩(wěn)定的分散體系。吸入 （病原微生物污染的空氣）（氣溶膠－0.001-100μm的固態(tài)、液態(tài)微小粒子懸浮在氣體介質中形成的相對穩(wěn)定的分散體系） 感染性病原微生物氣溶膠的吸入是造成實驗室相關感染的主要因素。,生物安全實驗室,二級生物安全實驗室建設要求（1）必須為實驗室安全運行、清潔和維護提供足夠的空間。在實驗室的工作區(qū)外還應當提供另外的可長期使用的儲存間。應當為安全操作及儲存溶劑、

59、放射性物質、壓縮氣體和液化氣提供足夠的空間和設施.在實驗室的工作區(qū)外應當有存放外衣和私人物品的設施。在實驗室的工作區(qū)外應當有進食、飲水和休息的場所（2） 實驗室墻壁、天花板和地板應當光滑、易清潔、不滲漏、耐化學品和消毒劑的腐蝕。地板應當防滑。實驗臺面應是防水的，并可耐消毒劑、酸、堿、有機溶劑和中等熱度的作用。實驗室器具應當堅固耐用，在實驗臺、生物安全柜和其他設備之間及其下面要保證有足夠的空間以便進行清潔。實驗室的門應有可視窗，并達到適

60、當的防火等級，最好能自動關閉 (3)  應保證實驗室內所有活動的照明，避免不必要的反光和閃光。要有可靠和充足的電力供應和應急照明，以保證人員安全離開實驗室。,生物安全實驗室,(4)  必須為實驗室提供可靠和高質量的水。要保證實驗室水源和飲用水源的供應管道之間沒有交叉連接。應當安裝防止逆流裝置來保護公共飲水系統(tǒng)。每個實驗室都應有洗手池，并最好安裝在出口處，盡可能用自來水. (5)  安全系統(tǒng)應當包括消防、

61、應急供電、應急淋浴以及洗眼設施。應當配備具有適當裝備并易于進入的急救區(qū)或急救室。 (6)  BSL-2實驗室，應在靠近實驗室的位置配備高壓滅菌器或其他清除污染的工具。 (7) 在設計新的設施時，應當考慮設置機械通風系統(tǒng)，以使空氣向內單向流動。如果沒有機械通風系統(tǒng)，實驗室窗戶應當能夠打開，同時應安裝防蟲紗窗。 (8)  必須考慮安全保衛(wèi)措施。必須使用堅固的門、安全窗戶以及門禁系統(tǒng)。適當時還應使用其他措施來加強安全

62、保障。,生物安全實驗室,生物安全實驗室,防護要求在實驗室工作時，必須穿著合適的工作服或防護服。在進行可能接觸到血液、體液以及其他具有潛在感染性的材料或感染性動物的操作時，應戴上合適的手套。手套用完后，應先消毒再摘除，隨后必須洗手。在處理完感染性實驗材料和動物后，以及在離開實驗室工作區(qū)域前，都必須洗手。為了防止眼睛或面部受到噴濺物的污染、碰撞或人工紫外線輻射的傷害，必須戴合適的安全眼鏡、面罩（面具）或其他防護設備。嚴禁穿著實驗室

63、防護服離開實驗室工作區(qū)域。不得在實驗室內穿露腳趾的鞋。禁止在實驗室工作區(qū)域進食、飲水、吸煙、化妝和處理隱形眼鏡。禁止在實驗室工作區(qū)域儲存食品和飲料。在實驗室內用過的防護服不得和日常服裝放在同一柜子內。,生物安全實驗室,生物安全柜（ Biosafety Cabinet BSC) 負壓過濾排風柜－在生物因子操作過程中用來保 護操作人員、環(huán)境和（或）實驗材料，防止感染 性材料在實驗中產生的氣溶膠向操作者和環(huán)境擴 散。

64、生物安全實驗室的重要設備，是病原微生物操作 的一級防護屏障，關系生命安全和環(huán)境安全，有 嚴格質量要求。安全柜分級：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 三個級別。,生物安全實驗室,生物安全柜種類BSC有三個級別，一共有六種。,生物安全實驗室,Ⅰ級生物安全柜 操作者可通過前窗操作口 在安全柜內進行操作。 前窗操作口向內吸入的負 壓氣流保護人員的安全。 污染氣流經高效過濾器過 濾后排出，保護環(huán)境不受 污染。 不保護操作對象。,

65、A-前窗操作口 B-觀察窗 C-排氣過濾器 D-負壓排氣通路Ⅰ級安全柜結構和氣流模式示意圖,生物安全實驗室,Ⅱ級生物安全柜根據結構特點和氣流模式 的不同分為 A1、A2、B1、B2四種類型操作者通過前窗操作口在安全柜內進行操作。操作口流入氣流：保護人員經高效過濾器過濾的下降氣流：保護產品被污染氣流經高效過濾器過濾后排出：保護環(huán)境,生物安全實驗室,ⅡA1型生物安全柜前窗操作口流入氣流的最低速率為0.38m/s

66、；下降氣流為部分流入氣流和部分循環(huán)氣流的混合 氣流，經高效過濾器過濾后送至工作區(qū)；污染氣流經過高效過濾器過濾后可以排到實驗室 中或經安全柜的外接排風管道排到大氣中； 安全柜內的污染部位可以處于正壓狀態(tài)；A1型安全柜不能用于揮發(fā)性有毒化學品和揮發(fā)性 放射性核素的實驗。,生物安全實驗室,IIA1型生物安全柜70% 氣體循環(huán)利用 30% 氣體外排.,,,,,環(huán)境空氣 污染的空氣 HEPA 過濾的空氣 負壓的污染

67、空氣,生物安全實驗室,操作口流入氣流的最低速率為0.50m/s；下降氣流為部分流入氣流和部分循環(huán)氣流的混合 氣流，經高效過濾器過濾后送至工作區(qū)；污染氣流經過高效過濾器過濾后可以排到實驗室 或經安全柜的外接排風管道排到大氣中；安全柜內所有污染部位均處于負壓狀態(tài)或者被負 壓通道和負壓通風系統(tǒng)環(huán)繞；安全柜用于進行以微量揮發(fā)性有毒化學品和痕量 放射性核素為輔助劑的微生物實驗時，必須連接 功能合適的排氣罩。,生物安全實

68、驗室,IIA2型生物安全柜70%氣體循環(huán)使用 .30%氣體排出，既可以接管道外排，也可以不接管道直接排放在實驗室,,,,,環(huán)境空氣 污染的空氣 HEPA 過濾的空氣 污染空氣,生物安全實驗室,Ⅱ級B1型生物安全柜操作口流入氣流的最低速率為0.50m/s；下降氣流大部分由未污染的流入氣流循環(huán)提供， 經過高效過濾器過濾后送至工作區(qū)；大部分被污染的下降氣流經過高效過濾器過濾后 通過專用的排氣管道排入大氣中；安全柜內所