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文檔簡介
1、隨著工業(yè)的快速發(fā)展,大量的工業(yè)廢水被排放到環(huán)境中,使得水體重金屬污染越來越嚴重,重金屬污染不僅對生態(tài)平衡構(gòu)成極大的威脅,還能直接或間接影響人類的健康。金屬硫蛋白(MT)的合成受金屬離子的誘導(dǎo),該誘導(dǎo)作用通過調(diào)節(jié)MT的轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn),MT是一類富含半胱氨酸的蛋白質(zhì),其半胱氨酸上的巰基對重金屬離子有極強的結(jié)合力,能夠結(jié)合重金屬形成無毒或低毒的絡(luò)合物,具有解除重金屬毒性的功能。本文以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因,構(gòu)建金屬硫蛋白重組表達載體轉(zhuǎn)
2、化畢赤酵母,研究工程菌株對重金屬脅迫的熒光響應(yīng)及對重金屬的抗性。
以釀酒酵母基因組DNA為模板,PCR擴增獲得金屬硫蛋白啟動子PCUP1片段,將其替換載體pPIC9K上原有的啟動子PAOX1,構(gòu)建重組載體pCUP9K;以質(zhì)粒pYX112-GFP為模板,PCR擴增獲得GFP基因序列,插入pCUP9K的多克隆位點,構(gòu)建重組表達載體pCUP9K-GFP;采用重疊延伸PCR技術(shù),以質(zhì)粒pGEM-T-AsMT2b和pYX112-GFP為
3、模板,設(shè)計特異性引物,分別PCR擴增獲得AsMT2b和GFP基因,再將兩者準確拼接獲得融合基因,構(gòu)建重組表達載體pCUP9K-AsMT2b-GFP和pPIC9K-AsMT2b-GFP。
將構(gòu)建成功的重組表達載體單酶切線性化,用氯化鋰法分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得工程菌株GS115-1(pCUP9K-GFP)、GS115-2(pCUP9K-AsMT2b-GFP)和GS115-3(pPIC9K-AsMT2b-GFP)。熒光顯微
4、鏡下用波長460-480 nm的藍光照射,可以觀察到工程菌菌體發(fā)出的綠色熒光,而對照菌沒有發(fā)出熒光,表明GFP在工程菌中獲得正確表達。分離工程菌的發(fā)酵上清液,用熒光分光光度計進行掃描,結(jié)果顯示在激發(fā)波長為475 nm時,508 nm處有一發(fā)射峰,其光譜特征與GFP一致,表明工程菌能夠?qū)麅?nèi)表達的GFP分泌至胞外。
將工程菌GS115-1置于含有不同重金屬(銅、鉻、鎘、砷)離子的培養(yǎng)液中,在一定時間后檢測其發(fā)酵上清液的熒光值,結(jié)
5、果表明,工程菌對銅離子有明顯的熒光響應(yīng),且熒光強度與銅離子濃度(0-1000μM)呈正相關(guān),可以通過進一步改進工藝和參數(shù),由工程菌的熒光強度來指示水體中銅離子的相對含量。在培養(yǎng)液中分別添加銅離子和甲醇,對工程菌GS115-2和GS115-3進行誘導(dǎo),取發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳,檢測到目的蛋白AsMT2b-GFP,該結(jié)果進一步說明工程菌能夠?qū)麅?nèi)表達的外源蛋白分泌至胞外。用含不同重金屬(銅、鉻、鎘、砷)的平板培養(yǎng)工程菌GS115-
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