金屬硫蛋白基因工程菌的構(gòu)建及其對(duì)重金屬響應(yīng)的研究.pdf

1、隨著工業(yè)的快速發(fā)展，大量的工業(yè)廢水被排放到環(huán)境中，使得水體重金屬污染越來(lái)越嚴(yán)重，重金屬污染不僅對(duì)生態(tài)平衡構(gòu)成極大的威脅，還能直接或間接影響人類(lèi)的健康。金屬硫蛋白(MT)的合成受金屬離子的誘導(dǎo)，該誘導(dǎo)作用通過(guò)調(diào)節(jié)MT的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)，MT是一類(lèi)富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，其半胱氨酸上的巰基對(duì)重金屬離子有極強(qiáng)的結(jié)合力，能夠結(jié)合重金屬形成無(wú)毒或低毒的絡(luò)合物，具有解除重金屬毒性的功能。本文以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，構(gòu)建金屬硫蛋白重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)

2、化畢赤酵母，研究工程菌株對(duì)重金屬脅迫的熒光響應(yīng)及對(duì)重金屬的抗性。
　　以釀酒酵母基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得金屬硫蛋白啟動(dòng)子PCUP1片段，將其替換載體pPIC9K上原有的啟動(dòng)子PAOX1，構(gòu)建重組載體pCUP9K;以質(zhì)粒pYX112-GFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得GFP基因序列，插入pCUP9K的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCUP9K-GFP;采用重疊延伸PCR技術(shù)，以質(zhì)粒pGEM-T-AsMT2b和pYX112-GFP為

3、模板，設(shè)計(jì)特異性引物，分別PCR擴(kuò)增獲得AsMT2b和GFP基因，再將兩者準(zhǔn)確拼接獲得融合基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCUP9K-AsMT2b-GFP和pPIC9K-AsMT2b-GFP。
　　將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體單酶切線性化，用氯化鋰法分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得工程菌株GS115-1(pCUP9K-GFP)、GS115-2(pCUP9K-AsMT2b-GFP)和GS115-3(pPIC9K-AsMT2b-GFP)。熒光顯微

4、鏡下用波長(zhǎng)460-480 nm的藍(lán)光照射，可以觀察到工程菌菌體發(fā)出的綠色熒光，而對(duì)照菌沒(méi)有發(fā)出熒光，表明GFP在工程菌中獲得正確表達(dá)。分離工程菌的發(fā)酵上清液，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示在激發(fā)波長(zhǎng)為475 nm時(shí)，508 nm處有一發(fā)射峰，其光譜特征與GFP一致，表明工程菌能夠?qū)麅?nèi)表達(dá)的GFP分泌至胞外。
　　將工程菌GS115-1置于含有不同重金屬（銅、鉻、鎘、砷）離子的培養(yǎng)液中，在一定時(shí)間后檢測(cè)其發(fā)酵上清液的熒光值，結(jié)

5、果表明，工程菌對(duì)銅離子有明顯的熒光響應(yīng)，且熒光強(qiáng)度與銅離子濃度（0-1000μM）呈正相關(guān)，可以通過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)工藝和參數(shù)，由工程菌的熒光強(qiáng)度來(lái)指示水體中銅離子的相對(duì)含量。在培養(yǎng)液中分別添加銅離子和甲醇，對(duì)工程菌GS115-2和GS115-3進(jìn)行誘導(dǎo)，取發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳，檢測(cè)到目的蛋白AsMT2b-GFP，該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明工程菌能夠?qū)麅?nèi)表達(dá)的外源蛋白分泌至胞外。用含不同重金屬（銅、鉻、鎘、砷）的平板培養(yǎng)工程菌GS115-