納米銀對土壤氮素微生物轉化過程的影響及其機制.pdf

1、納米銀(AgNPs)是應用最廣泛的商品化納米材料之一，近年來消費品中含有AgNPs的數(shù)量和比例增加，隨AgNPs生產制造、使用及廢棄的過程使其不可避免的進入陸生系統(tǒng)之中。AgNPs擁有良好的長效廣譜抗菌作用，對多種微生物具有強烈抑制作用。土壤氮素轉化過程主要由土壤微生物介導，當AgNPs進入土壤環(huán)境后對土壤微生物的活性造成損傷。AgNPs作為新型污染物質進入農田環(huán)境中，對土壤微生物、作物氮素利用均會造成一定程度的影響，其中由硝化細菌所介

2、導的土壤硝化反應對AgNPs均有高度敏感性。研究調查AgNPs在土壤中的遷移轉化、化學特性及毒理作用是監(jiān)控及治理新型土壤污染物的必要手段，探討AgNPs對土壤微生物的抑制機理以及對氮素轉化微生物和相關功能基因表達量的影響，對治理和緩解釋放到土壤環(huán)境中的AgNPs所產生的危害提出具體的指導方向。
　　本研究在實驗室培養(yǎng)條件下，采用批量處理實驗方法探討AgNPs暴露對土壤微生物多樣性、土壤氮素轉化關鍵微生物過程、AgNPs對土壤微生物

3、抑制機理以及AgNPs對土壤氮初級轉化速率的影響進行研究。通過實驗室純培養(yǎng)條件下基于Illumina測序平臺研究了暴露在AgNPs環(huán)境中對土壤微生物多樣性的影響;探究土壤AgNPs對土壤氨化、硝化作用強度的影響，并采用實時熒光定量(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction Detecting System，QPCR)擴增儀測定AgNPs對土壤氮素轉化關鍵功能基因拷貝數(shù)的影響;研究A

4、gNPs對土壤氮素轉化關鍵微生物活性的抑制機理，采用氨氧化細菌模式菌株歐洲亞硝化毛桿菌Nitrosomonas europeae作為研究對照，比較不同劑量、尺寸及釋放Ag+對N.europeae活性的影響;基于15N同位素稀釋技術研究在AgNPs對土壤氮初級硝化速率、土壤氮初級礦化速率的影響，并測定AgNPs對土壤無機氮肥及有機氮肥轉化、酶活性的影響。本文為AgNPs新型污染物所導致的土壤微生物群落結構的改變、土壤氮循環(huán)的影響及肥料利用

5、提出量化分析結果的參考。本文主要研究結果如下:
　　1.采用實驗室純培養(yǎng)的方式將土壤分別暴露在AgNPs含量為10、50、100mg/kg的環(huán)境中28℃培養(yǎng)7d，采用氯仿熏蒸及土壤誘導呼吸的方式測定AgNPs對土壤微生物生物量氮和活性的影響，并通過提取土壤細菌總DNA采用Illumina測序平臺對V4區(qū)域進行土壤微生物群落多樣性分析。研究結果表明，土壤暴露在AgNPs環(huán)境中抑制土壤微生物的活性，當AgNPs含量分別為10、50、1

6、00mg/kg時，空白對照組土壤微生物生物量氮含量分別高于AgNPs處理組33.0％、58.7％、71.1％;空白對照組誘導呼吸量高于AgNPs處理組1.17％、17％、29.3％，即低劑量AgNPs暴露條件下對土壤誘導呼吸量抑制不顯著。土壤微生物多樣性研究結果分析表明，在屬分類水平土壤AgNPs暴露劑量和所檢測出細菌類群的種類呈現(xiàn)負相關，但優(yōu)勢門類檢測數(shù)量基本一致。不同劑量AgNPs暴露下對土壤微生物主導菌群門類（變形菌門Proteo

7、bacteria、酸桿菌門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteria）不產生顯著作用，變形菌門群落豐度百分比與土壤AgNPs含量呈正相關，酸桿菌門、放線菌門的群落豐度百分比與AgNPs含量呈負相關。高劑量AgNPs暴露下土壤微生物群落中的α-、β-、γ-、δ-變形菌綱豐度在細菌綱水平豐度高于對照組。酸桿菌綱發(fā)育分類下的目、科、屬在各分類水平群落豐度百分比均屬于絕對優(yōu)勢豐度菌群，且各發(fā)育水平下的群落豐度百分比和土壤A

8、gNPs劑量呈負相關。
　　2.實驗室純培養(yǎng)條件下研究AgNPs對土壤硝化作用強度，采用實時熒光定量PCR(qPCR)測定AgNPs對土壤硝化功能基因amoA、Arch-amoA基因拷貝數(shù)的影響;利用氨氧化細菌模式菌株歐洲亞硝化毛桿菌Nitrosomonas europeae研究AgNPs對土壤硝化細菌活性抑制的機理，將N.europeae接種到含有不同劑量、尺寸AgNPs的培養(yǎng)基中探究對細菌抑制程度的影響。
　　研究結果表

9、明，土壤暴露在AgNPs環(huán)境中對土壤硝化作用產生抑制，土壤硝化反應的抑制程度和AgNPs暴露劑量呈正相關，其中土壤AgNPs含量分別為50mg/kg和100mg/kg時AgNPs對該暴露劑量下的土壤硝化作用抑制率組間差異不顯著。土壤AgNPs暴露劑量分別為10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg時，AgNPs對土壤微生物硝化功能基因amoA基因表達量的抑制率分別為34.4％、68.8％和91.8％，即土壤AgNPs含量100mg

10、/kg時對硝化作用抑制率極顯著。N.europeae接種到含AgNPs(50nm)的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)其亞抑制作用的濃度范圍為5-10mg/L，且在此濃度范圍培養(yǎng)5-8h時AgNPs對細菌所產生抑制率下降，即在此培養(yǎng)時間段內N.europeae細胞活性緩慢恢復;當N.europeae暴露在AgNPs劑量為20mg/L的培養(yǎng)基中時對細菌活性抑制率高達77％，且抑制率不隨培養(yǎng)時間變化。采用流式細胞(FCM)技術測定不同劑量、粒徑AgNPs對N.e

11、uropeae細胞致死率的影響，結果表明AgNPs(50nm)所釋放出的Ag+導致細胞壞死率占該劑量AgNPs所引起細胞壞死率的45％;通過透射電鏡-能譜儀(TEM-EDS)檢測發(fā)現(xiàn)AgNPs粒子可穿透細胞膜進入細胞內部，與細胞結構緊密吸附結合造成細胞損傷;在同劑量下AgNPs粒子的尺寸越小，導致的細胞壞死率越高，小粒徑AgNPs在低劑量時能顯著影響細胞壞死率。
　　3.通過稀釋平板計數(shù)法測定AgNPs暴露下土壤可培養(yǎng)氨化細菌、反

12、硝化細菌的數(shù)量，并測定AgNPs對蛋白酶活性、土壤反硝化功能基因nosZ基因拷貝數(shù)的影響;將反硝化模式菌株反硝化無色桿菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞單菌Pseudomonas stutzeri分別接種到含AgNPs的培養(yǎng)基中，探究AgNPs對反硝化細菌的影響。研究結果表明，暴露在AgNPs環(huán)境中的土壤可培養(yǎng)氨化細菌數(shù)量及蛋白酶活性均受到抑制，可培養(yǎng)氨化細菌數(shù)量及酶活性抑制程度與土壤AgNPs暴露劑量呈

13、正相關。AgNPs對土壤可培養(yǎng)反硝化細菌數(shù)量、nosZ基因拷貝數(shù)均未產生顯著抑制作用，即土壤反硝化細菌對AgNPs具有強烈的抗性。反硝化無色桿菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞單菌Pseudomonas stutzeri分別接種到含AgNPs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，當培養(yǎng)基中AgNPs劑量為5mg/L時通過掃描電鏡(SEM)觀察到兩種菌體表面均形成緊密的莢膜，且此劑量下對細菌生長無抑制作用;當培養(yǎng)基中AgN

14、Ps劑量為20mg/L時，兩種菌體表面形成緊致的莢膜層，且通過透射電鏡(TEM)觀察到Achromobacter denitrificans的細胞膜完整，對細菌生長抑制不顯著。
　　4.實驗室純培養(yǎng)條件下批量實驗處理，測定AgNPs劑量分別為10、50、100mg/kg時土壤硝酸還原酶、亞硝酸還原酶隨時間酶活性的變化;通過施加無機氮肥CO(NH2)2、(NH4)2SO4、KNO3探究AgNPs對土壤氮素轉化酶活性的影響;在AgNP

15、s暴露下的土壤分別施加秸稈和豬糞，探究AgNPs對土壤有機氮肥轉化的影響;基于i5N稀釋技術測定不同劑量AgNPs暴露下對土壤氮初級硝化速率及礦化速率的影響。
　　研究結果表明，當土壤暴露在AgNPs的培養(yǎng)條件下時，硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性與土壤AgNPs暴露劑量呈負相關。土壤AgNPs含量為10mg/kg時，硝酸還原酶活性未受抑制;當土壤AgNPs含量100mg/kg時，硝酸還原酶活性抑制顯著。土壤AgNPs暴露劑量為50m

16、g/kg和100mg/kg時，硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性與對照組相比抑制顯著，但處理組間抑制程度相當。通過施加無機氮肥CO(NH2)2、(NH4)2SO4可促進暴露在AgNPs環(huán)境中土壤脲酶的活性，其酶活性依舊受到AgNPs的抑制作用;暴露于AgNPs環(huán)境中的土壤施加KNO3、CO(NH2)2對硝酸還原酶均有一定促進作用;施加CO(NH2)2及(NH4)2SO4在未添加AgNPs及低劑量AgNPs(10mg/kg)處理土壤中，對亞硝酸

17、還原酶活性無顯著促進作用;AgNPs暴露條件下的土壤，施加KNO3促進羥胺還原酶活性。在土壤AgNPs暴露劑量為100mg/kg的條件下分別施加秸稈和豬糞，暴露在AgNPs環(huán)境下的土壤NH4+-N、NO3--N含量均低于分別僅施加秸稈和豬糞的處理組土壤，即AgNPs抑制土壤分解細菌的活性，使得有機氮肥施加后不易被分解成無機氮。
　　在培養(yǎng)初期2h-3d時，土壤氮初級硝化速率及土壤氮初級礦化速率和AgNPs暴露劑量呈負相關;培養(yǎng)后期

18、的部分培養(yǎng)時間段AgNPs處理組轉化速率略高于對照組。在2h-1d培養(yǎng)時間段，土壤空白對照組的氮初級礦化速率分別高于土壤AgNPs含量為10mg/kg、50mg/kg和100mg/kg的9.3％、22.63％和34％，氮初級礦化速率分別高于24.1％、62.3％和82.2％。在AgNPs暴露下的土壤施加NH4NO3，土壤中NO3--N含量與AgNPs劑量呈負相關，表明AgNPs劑量和土壤硝化作用抑制率呈正相關。施加NH4NO3使對照組及