MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受機(jī)制研究及應(yīng)用.pdf

1、利用植物修復(fù)土壤污染是一種新興的環(huán)境生物技術(shù)，其研究的基礎(chǔ)是超積累植物(hyperaccumulator)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，但超積累植物大都具有生物量相對(duì)較小、根系不夠發(fā)達(dá)等缺陷，不能投入到大型生產(chǎn)實(shí)踐中。MIR156作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控因子，可以調(diào)控植物生長(zhǎng)周期、生物量及根系發(fā)育等。本研究首先以擬南芥為試驗(yàn)材料，采用基因敲除和過表達(dá)技術(shù)，產(chǎn)生過表達(dá)MIR156擬南芥植株（35S∷MIR156A）和MIM156敲除擬南芥植株(Ubi1

2、0∷MIM156)，并研究它們對(duì)Cd脅迫的耐受表型及耐受機(jī)制。然后，選擇鎘超累積植物伴礦景天，開展MIR156調(diào)控植物鎘脅迫耐受機(jī)制研究成果的應(yīng)用，即在伴礦景天愈傷組織上，進(jìn)行MIR156的過表達(dá)和敲除，以探究MIR156-SPLs網(wǎng)絡(luò)途徑調(diào)控下植物相關(guān)鎘耐受和富集差異，解析MIR156-SPLs信號(hào)途徑改良伴礦景天的可行性。主要結(jié)論如下:
　　(1)擬南芥植株真葉長(zhǎng)出后轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株表型逐漸表現(xiàn)出不同，35S∷MIR15

3、6A葉片發(fā)生速率明顯快于WT，并且下表皮毛發(fā)生顯著晚于WT，葉片較圓缺刻少，開花延遲。Ubi10∷MIM156表現(xiàn)出快速成熟的表型，葉片數(shù)量低于35S∷MIR156A和WT，葉片缺刻多。
　　(2)為了研究MIR156在擬南芥響應(yīng)鎘脅迫的過程中的作用，首先觀察鎘脅迫處理擬南芥的表型和損傷等級(jí)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，相比WT，MIR156過表達(dá)的植株35S∷MIR156A在遭受鎘脅迫后損傷較輕，而MIR156敲除的植株Ubi10∷MIM15

4、6易發(fā)生嚴(yán)重的鎘脅迫損傷表型。
　　(3)擬南芥地上、地下的Cd含量的測(cè)定結(jié)果表明，根部鎘的吸收量:35S∷MIR156A＞Ubi10∷ MIM156＞ WT;而地上部分的鎘含量與地下不同，Ubi10∷MIM156＞ WT＞35S∷MIR156A。雖然Ubi10∷ MIM156地下的鎘吸收量最低，35S∷MIR156A植株最高，但是地上部分的鎘含量卻與地下部分相反，這表明Ubi10∷MIM156鎘轉(zhuǎn)運(yùn)效率明顯高于WT和35S∷.M

5、IR156A，本研究結(jié)果表明MIR156可參與調(diào)控植物鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
　　(4)為了闡明Cd在擬南芥MIR156過表達(dá)植株35S∷MIR156A和MIR156敲除的植株Ubi10∷MIM156中的分布差異的分子機(jī)制，測(cè)定了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子(ATP-binding cassette transporters)、HAM(heavy metal ATPases)和ZIP(Zrt/Irt-likeProtein)等多個(gè)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的表達(dá)量

6、。結(jié)果顯示，負(fù)責(zé)將根部的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入根部細(xì)胞的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)子ZIP1-4和將根部細(xì)胞內(nèi)的Cd運(yùn)輸進(jìn)入液泡的ABCC1基因在35S∷MIR156A中的表達(dá)量均明顯高于WT，而在Ubi10∷MIM156中明顯低于WT。莖中負(fù)責(zé)將Cd運(yùn)輸?shù)降厣喜糠值腍MA4基因的表達(dá)量為:Ubi10∷MIM156＞35S∷MIR156A＞W(wǎng)T?；诖耍Y(jié)合三種材料地下地上部分鎘積累結(jié)果，推測(cè)35S.∷MIR156A材料中，鎘吸收進(jìn)入根內(nèi)細(xì)胞多，大量鎘被運(yùn)輸固定

7、在細(xì)胞液泡中，同時(shí)莖的向上運(yùn)輸能力降低，最終導(dǎo)致根部鎘的超量積累。
　　(5) MIR156在植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。在正常生長(zhǎng)條件和5μM硫酸鎘脅迫下，均為35S.∷MIR156A生物量明顯高于WT，Ubi10∷MIM156顯著低于WT。35S∷MIR156A植株的側(cè)根數(shù)量明顯高于WT和Ubi10∷MIM156植株，而35S∷MIR156A根系覆蓋廣。Ubi10∷MIM156的主根根長(zhǎng)明顯長(zhǎng)高于WT和35S∷MIR156A

8、，表明該Ubi10∷MIM156更有利于修復(fù)深層土壤。
　　(6)以伴礦景天葉片為外植體，使用添加了300mg/L的水解酪蛋白的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，建立了再生體系，為伴礦景天遺傳轉(zhuǎn)化提供受體材料。結(jié)果表明:愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為:2，4-D1mg/L+6-BA0.3mg/L，誘導(dǎo)率為9201％;最優(yōu)分化培養(yǎng)基為:2，4-D0.1mg/L+6-BA1mg/L，分化率為27.44％;適宜的芽增殖培養(yǎng)基為:2，4-D0.1mg/L

9、+6-BA0.5mg/L;適宜的生根培養(yǎng)基為:IBA1-2mg/L。伴礦景天的抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)表明:適合伴礦景天愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的抗生素類型為G418（慶大霉素衍生物），臨界濃度為40mg/L，篩選時(shí)間為20天。
　　(7)以包含NPTII（氨基糖苷類-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶）抗性標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體PBI21為骨架，構(gòu)建了MIR156A超表達(dá)載體(MIR156PBI)和靶基因模擬Mimicry156表達(dá)載體(MIMPBI)。將PBI1

10、21空載、MIR156PBI、MIMPBI載體借助基因槍轟擊伴礦景天愈傷組織，經(jīng)過G418多代篩選獲得抗性愈傷組織。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)入MIR156PBI載體的愈傷組織鮮重增長(zhǎng)最快、空載體次之、轉(zhuǎn)入MIMPBI載體的愈傷組織增長(zhǎng)最慢。
　　(8)用1000μMCdSO4和0μMCdSO4處理?xiàng)l件下愈傷組織的鮮重增長(zhǎng)率的比值衡量Cd脅迫對(duì)伴礦景天愈傷組織的影響，轉(zhuǎn)PBI121、MIR156PBI、MIMPBI載體的比值為0.49、0.66