第七章放射免疫技術(shù)-長沙醫(yī)學(xué)院

1、第七章 放射免疫技術(shù),第一節(jié)　放射免疫技術(shù) 一、原理及分類 二、常用的放射性核素 三、標(biāo)記物制備及鑒定 四、抗血清鑒定,第二節(jié)　放射免疫分析 一、基本原理 二、實驗方法及測定第三節(jié) 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA與RIA的比較,思考題小結(jié),免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進行檢測。標(biāo)記技術(shù)：將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。標(biāo)記免疫分析：用可微

2、量或超微量檢測的示蹤劑標(biāo)記抗原、抗體，檢測免疫反應(yīng)結(jié)果并確定待檢物。,標(biāo)記免疫技術(shù)－基本概念,,常見標(biāo)記免疫技術(shù),放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù),第一節(jié) 放射免疫技術(shù),早期的放射免疫技術(shù)是基于競爭性結(jié)合反應(yīng)原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又發(fā)展了非競爭性結(jié)合的免疫放射分析(IRMA)。該類技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域中各種微量蛋白質(zhì)

3、、激素、小分子藥物和腫瘤標(biāo)志物的定量分析，對相關(guān)學(xué)科的發(fā)展起到了極大地推動作用。,放射免疫RIA以標(biāo)記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。,免疫放射IRMA以過量標(biāo)記抗體與抗原非競爭結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結(jié)合標(biāo)記抗體。,放射受體分析RRA放射配體結(jié)合分析RBA,其它,一、放射免疫技術(shù)－原理及分類,二、放射免疫技術(shù)－常用的放射性核素,125I

4、 3H 射線 γ β理化性 活潑 差核素豐度 >90% －半衰期 60.2d 12.3y標(biāo)記方法

5、 簡單 復(fù)雜標(biāo)記設(shè)備 低廉 昂貴測量條件 簡單 復(fù)雜,,,常用標(biāo)記核素,125碘-標(biāo)記物的制備－標(biāo)記,125I-,化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放射性負電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基

6、上的氫原子。,125I或125I+,125I-標(biāo)記物（混合物）,,,Ch-T、LPO氧化,取代反應(yīng),直接標(biāo)記法,三、放射免疫技術(shù)－標(biāo)記物制備及鑒定,,,,,,,使用無還原劑的高比放射性碘源被標(biāo)記物用量要少ch-T用量要低控制總反應(yīng)體積<200μl反應(yīng)時間1-2分鐘弱堿性反應(yīng)條件,間接標(biāo)記法,聯(lián)接標(biāo)記( bolton-Hunter )預(yù)先將125I用ch-T法標(biāo)記琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基團可與蛋白分子上的

7、氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記物被碘化。,,,bolton-Hunter,,,125碘-標(biāo)記物的制備－純化,凝膠過濾法離子交換層析法 聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜法,聚合、損傷物,標(biāo)記蛋白,游離125I,125碘-標(biāo)記物的制備－鑒定,標(biāo)記物質(zhì)量高比放射性高純度完整免疫活性,放射化學(xué)純度單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率應(yīng)大于95%,免疫活性標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比

8、該值越大, 標(biāo)記物免疫活性好,比放射單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強度單位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性過高，將影響標(biāo)記物免疫活性,計算法：依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記率）來計算標(biāo)記物的比放射性.自身置換法 ：比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來測定標(biāo)記物的比放射性,結(jié)果準(zhǔn)，測定復(fù)雜,比放射性－計算法,,結(jié)果欠準(zhǔn)，計算簡便,自身置換曲線 反應(yīng)系統(tǒng)：限量Ab和

9、遞增劑量(cpm)的標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原的結(jié)合率(B/T%)隨標(biāo)記抗原總量的增加而減少 兩條曲線平行,若標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)品抗原具有相同的免疫活性,標(biāo)準(zhǔn)曲線 反應(yīng)系統(tǒng):抗體（限量）、標(biāo)記抗原（定量）和劑量遞增的標(biāo)準(zhǔn)抗原組成 標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率(B/T%)隨標(biāo)準(zhǔn)抗原的增加而競爭抑制性減少,比放射性－自身置換法,標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線平行表明在相同的放射性結(jié)合水平上，二實驗中抗體上結(jié)合 的抗原物質(zhì)總量相同計算置換曲線平行段某結(jié)

10、合率的放射性強度(cpm/ml換算 為nCi/ml) 計算標(biāo)準(zhǔn)曲線平行段相應(yīng)結(jié)合率對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抗原化學(xué)量 (ng/ml)以平行段多點結(jié)合率對應(yīng)的放射強度和標(biāo)準(zhǔn)抗原量進行直 線回歸，其斜率即為比放射性(nCi/ng),四、放射免疫技術(shù)－抗血清鑒定,抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定簇之間的結(jié)合強度用親和常數(shù)Ka表示。單位為稀度單位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高靈敏度、精確

11、度和準(zhǔn)確度,親和性,親合力高,親合力低,放射免疫技術(shù)－抗血清鑒定,特異性:指一種抗體識別相應(yīng)抗原決定簇的能力交叉反應(yīng)率：將反應(yīng)的最大結(jié)合率抑制下降50% 時特異性抗原與類似物的劑量（ED50）之比抗體交叉反應(yīng)程度直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,特異性,效價,五、方法學(xué)評價,除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性之外，應(yīng)注意以下指標(biāo)：可靠性劑量-反應(yīng)曲線高劑量鉤狀效應(yīng),第二節(jié) 放射免疫分析,一、放射免疫分析－基

12、本原理,競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力,,Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點，二者通過競爭方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關(guān)系。,,以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系－劑量反

13、應(yīng)曲線,,注：T即是B與F的總和,二、放射免疫分析－實驗方法及測定,抗原抗體反應(yīng),Ag*,Ag,,,反應(yīng)條件體積溫度時間pH,Ab,(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag),平衡非平衡一步法二步法,分離結(jié)合、游離標(biāo)記物,二抗體沉淀法,PEG 沉淀法,PR 試劑法,活性炭吸附法,,分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響 操作應(yīng)簡單、重復(fù)性好經(jīng)濟,測量、數(shù)據(jù)處理,晶體閃爍計數(shù)器 包括了NaI閃爍晶 體

14、、光電倍增管 以及計數(shù)器測量的放射性信 號是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分 鐘計數(shù)(cpm),計算,參數(shù)cpmB/T (%)F/T (%)B/F (%)B/B0 (%),擬合,注：T即是B與F的總和,第三節(jié) 免疫放射分析,一、免疫放射分析－基本原理,以過量125I標(biāo)記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng), 用固相免疫吸附劑對B或F進行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡單。,單

15、位點 IRMA,先用過量標(biāo)記抗體與待測抗原進行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物；用固相抗原結(jié)合未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離, 測定上清液的放射量,雙位點 IRMA,先用固相抗體與抗原結(jié)合，再用過量的標(biāo)記抗體與抗原的另一決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄剩余標(biāo)記抗體，測固相上放射性。,二、IRMA與RIA比較,放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強、精密度好, 常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)

16、的測定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足, RIA將逐漸被取代。,放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用,1.放射免疫技術(shù)的核心是什么？2.制備放射性125I標(biāo)記物的基本原理是什么？有哪些方法？3.評價125I標(biāo)記物質(zhì)量的指標(biāo)有哪些？4.用于放射免疫技術(shù)的抗體應(yīng)滿足哪些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)？5.放免分析中標(biāo)記/未標(biāo)記抗原、抗體的用量特點及與免疫復(fù)合物的量變關(guān)系？6.反應(yīng)結(jié)束后，如何將免疫復(fù)合物與游離標(biāo)記物分離開？7.放

17、射免疫分析實驗中，如何確定待測抗原的含量？8.免疫放射分析與放射免疫分析的反應(yīng)原理有何不同？9.γ閃爍計數(shù)器記錄的信號即是放射核素的衰變嗎？10.靈敏度、特異性和測定范圍，免疫放射分析與放射免疫分析有何區(qū)別？,思考題,放射免疫技術(shù)的基本原理是放射性核素可探測的靈敏性、精確性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，主要包括RIA和IRMA。RIA所用的標(biāo)記物應(yīng)具備高比活度、高純度和完整的免疫活性；抗血清應(yīng)具有較高的抗體親和力、高度的特異性和適