3-圓盤電泳課件(按改進版)

1、特別提醒,樣品濃度及加樣關(guān)系樣品來源：[說是最純的樣品，實際并不純，正好做電泳] 沃宏（Wo Hong ） 738328 10g LOT2010/04樣品名稱： 牛血清白蛋白 [ BSA ] [Albumin Bovine; from bovine serum;

2、Mr:68000] 樣品配制： 1.0mg/ml; 加樣體積： 20.0ul ，也可以，但色帶較寬（可能 與加樣體積過大有關(guān)），另外三條色帶其中一條較淡，有的 當(dāng)時難辨認，不是很清楚，或有或無的感覺。 建 議： 4.0mg/ml; 加樣體積： 10.0ul,,,,,,聚

3、丙烯酰胺凝膠圓盤電泳,,1、實驗原理 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳是以丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺，在催劑的作用下聚合而成的具有三維網(wǎng)壯結(jié)構(gòu)的大分子凝膠作為支持介質(zhì)的一種區(qū)帶電泳。在這種電泳中由于采用了凝膠孔徑，pH值，緩沖液成分和電位梯度的不連續(xù)系統(tǒng)，因此它具有高分辨率的三種效應(yīng)，即：濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)。在凝膠中當(dāng)對被分析的樣品進行這種電泳時，樣品中的各成分首先經(jīng)過濃縮，然后再根據(jù)他們各自所帶電荷，分子

4、量的大小以及形狀的差異，以不同的遷移率電泳分離而成帶。 因本實驗是采用聚丙烯酰胺凝膠在垂直的小玻管中進行的，經(jīng)電泳后分離的樣品帶形似圓盤，因此稱之為垂直管型聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳（簡稱圓盤電泳）。,,2、目的與要求 用圓盤電泳的方法分離蛋白質(zhì)樣品，通過實驗了解和熟悉應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳進行分析的方法和實驗過程。,,3、儀器、器材與裝置 ： 3-1、實驗儀器：（1）、 電 泳

5、儀： (a)：EPS604穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (南京科保儀器研究所) (b)：DYY-6C和DYY-7C型電泳儀 (北京市六一儀器廠) (c)：D

6、YY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (南京大學(xué)（儲平廠）（2）、 圓盤電泳槽裝置一套 (南京大學(xué)（儲平廠） （規(guī)格：12根玻管和6根玻管兩種）； （3）、 磁力攪拌器

7、 (上海滬西分析儀器廠 ) 90-1型恒溫磁力攪拌器 （4）、 混 合 器 (上海滬西分析儀器廠) WH-3微型旋蝸混合儀（5）、 天 平 （a）：BL-2200H,電子天平，最大稱量2200克，感量

8、：0.01g SHIMADZU CORPORATION （b）：BS110S, 電子天平，最大稱量110克，感量：0.1mg Sartorius北京賽多利斯天平有限公司,3-2、實驗器材：,（1）、 可調(diào)自動取液器： a：微量取液器（1

9、0ul，20 ull） b：常量取液器（1000ul）（2）、 微量注射器：（5ul ；10ul； 25ul）（3）、 醫(yī)用注射器：（10毫升或5 毫升二種）（4）、 8#針頭（5）、 有機玻璃凝膠小玻管架：(12孔 / 2排)（6）、 小玻管：（長：10cm，內(nèi)直徑：0.4cm和0.5cm） （7）、 量 筒：（250毫升， 100毫升 和10毫升

10、） （8）、 燒 杯 （9）、 試 管 （10）、 試管架 （11）、 洗耳球（12）、 玻 棒（13）、 剪 刀（14）、 膠布條（15）、 吸水紙,圖1、圓盤電泳槽裝置圖,,,4、試劑與配制：,4-1、實驗試劑：（1）、 丙

11、 烯 酰 胺 （Acr） （2）、 甲叉雙丙烯酰胺 （Bis）（3）、 過 硫 酸 銨 （AP）（4）、 四 甲基 乙二胺 （TEMED）（5）、 三羥甲基氨基甲烷 （Tris）（6）、 雞蛋白蛋白測試品 （CEA） （7）、 考馬斯

12、亮蘭G-25 （8）、 三氯醋酸 （TCA）（9）、 甘氨酸 （gly）（10）、溴酚蘭（11）、蔗 糖 （12）、鹽 酸,4-2、試劑的配制：,（1）、蔗糖溶液(測試品溶解液)的配制: 稱取蔗糖2.0 g，加蒸餾水10.0 ml（200 mg/ml）溶解混勻即可。 也可用5-1（2）步驟中“G”溶液（400 mg/ml）來配制測試品

13、（2）、1%的溴酚蘭溶液的配制： 稱取1.0g溴酚蘭，加100.0ml蒸餾水，溶解混勻即可。（3）、測試蛋白質(zhì)樣品溶液(1.0mg/ml)的配制： 稱取CEA樣品1.0 mg于小塑料離心管內(nèi)，加蔗糖溶液1.0 ml和溴酚蘭溶液4-6 滴，溶解后放在冰箱中備用（無須加熱）。（4）、10%的考馬斯亮蘭溶液的配制： 稱取1.0g考馬斯亮蘭G-

14、250，加10.0ml蒸餾水溶解混勻即可。（5）、染色固定液的配制： 稱取三氯醋酸15.0g，加蒸餾水100.0 ml（200 mg/ml），再加10%考馬斯亮蘭 G250溶液0.5ml（也可根據(jù)實際效果增加或減少）溶解混勻即可。（5）、四甲基乙二胺（TEMED）溶液的配制： 該試劑為液體溶液，直接取原液，無須配制。（6）、1.0 mol/L HCL溶液的配制：

15、 取1.0 ml 濃HCL（濃HCL-12 N），加11.0ml蒸餾水混勻即可。（7）、電極Buffer的配制： 分別稱取Tris：0.6g ， Gly：2.88g于燒杯中，先用少量蒸餾水溶解，然后用 蒸餾水定容至500毫升混勻（pH8.3）即可。,5、凝膠的聚合,5-1、凝膠貯液的配制： （1）、分離膠[7.5%]貯液的配制： A：稱取Tris. 3.7 g；加1.0 mol/

16、L HCL 4.8 ml；最后加蒸餾水至 10ml，pH8.9即可。 B：分別稱取Acr 3.0 g；Bis 0.08 g；加蒸餾水至10. 0 ml溶解混勻即可。 C：稱取過硫酸銨(AP) 0.028 g；加蒸餾水至10. 0 ml溶解、混勻即可。 D：蒸餾水 分別?。篈 ：B ：C

17、：D = 1.0ml ：2.0ml ：4.0ml ：1.0ml （8.0 ml） 按上述比例加完后，再另外單獨加 TEMED 20 -25ul,,（2）、濃縮膠[2.5%]貯液的配制： E： 稱取Tris. 0.598 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；最后加蒸餾水10ml, pH6.9即可。 F： 分別稱取Acr 1.0 g；Bis 0.25 g；加蒸餾水至

18、10. 0 ml溶解、混勻即可。 G： 稱取蔗糖4.0 g；加蒸餾水至10. 0 ml溶解、混勻即可。 H： 稱取過硫酸銨(AP) 0.028 g；加蒸餾水至10. 0 ml溶解混勻即可。 分別取：E ：F ：G ：H = 0.5 ml ：1.0 ml ：0.5ml ：2.0ml （4.0 ml） 按上述比例加完后，再另外單獨加TEMED

19、 30-40 ul,5-3、分離膠的制備：,（1）、將清潔、無破碎干燥的小玻管一端，用膠布貼封后，朝下垂直放入有機玻璃 凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的7.5 cm處作一記號。 （2）、用自動取液器（1000 ul）或注射器吸取上述配好的分離凝膠貯液 沿著小玻管內(nèi)壁小心準確加入7.5 cm高。 （3）、凝膠溶液加畢后，隨即用自動取液器或注射器吸取蒸餾水，輕輕 加至管中的凝膠表面，使其表

20、面覆蓋1.0cm 高水層。在灌膠和封水 的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。 （4）、將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進行聚合反應(yīng)，在正常情況下大約40分鐘 后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時，表明膠已聚合完畢，即可加濃縮膠。,5-4、濃縮膠的制備：,（1）、輕輕倒掉分離膠玻管上端的蒸餾水，并用吸水紙吸去未倒凈 的蒸餾水（但不能觸及膠面）然后再小心加入該濃縮膠貯液至 1.0cm

21、高。（2）、隨后同樣加1.0cm高的蒸餾水層覆蓋膠表面。于室溫下靜置， 以進行聚合反應(yīng)，正常情況下大約也在40分鐘左右后，待濃縮 膠出現(xiàn)乳白色時，表明膠已聚合完畢，結(jié)束聚合，同時將每一根凝 膠玻管用吸水紙輕輕吸去濃縮膠表面上的蒸餾水層，此時凝膠已制 備完成，即可進行點樣、電泳。,,6、電 泳：6-1、加樣：（下面2種加樣方法，任選其中一種） （1）、直接用20ul

22、自動取液器取10ul測試樣品溶液，輕輕加入到凝膠 玻管上端濃縮膠表面，然后再輕輕加入適量的電極Buffer溶液。 [圓盤電泳建議用第一種加樣方法] （2）、先用注射器加入適量的電極Buffer溶液到凝膠玻管上端濃縮膠表 面，然后用微量注射器取10ul測試樣品溶液，并將微量注射器針 頭通過電極Buffer溶液插入到濃縮膠表面，并輕輕加入之，加入

23、 完畢，輕輕取出微量注射器（此法，避免了樣品的擴散，對新手 特別有利）即可。 [垂直平板電泳建議用第二種加樣方法],,6-2、裝置凝膠管： 將加好樣品的凝膠管加樣端（上端），分別插入到上電泳槽孔中的各乳膠管孔內(nèi)，然后將已插滿凝膠管的上電泳槽下端放入加有電極溶液的下電泳槽內(nèi)。此時凝膠玻管下端管口易產(chǎn)生氣泡，可通過輕輕擺動凝膠玻管以去除氣泡。插入上電泳槽的玻管上端，用注射器輕輕滴滿電極溶液，以免產(chǎn)生氣泡，最后將上

24、電泳槽裝滿電極液。,,6-3、接通電源：接通電泳槽的兩端電極與電泳儀的電源，上槽電極接負極，下槽電極接正極，以穩(wěn)壓300 V （12管）開始進行電泳，直至指示劑前沿到達凝膠管底部約0.5 cm處，停止電泳（約2小時左右）。電壓應(yīng)由小逐步加大至額定值。確定電泳結(jié)束時間，以不應(yīng)將考馬斯亮蘭跑出凝膠管為止，原因是防止最小分子量蛋白質(zhì)跑出凝膠管。,,6-4、取出玻管內(nèi)的凝膠： 準備電泳結(jié)束時，首先關(guān)閉電源。取出小玻管，然后將一支帶

25、有8#針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來水），把針頭慢慢插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，一邊開始壓水，一邊同時使針頭慢慢貼緊管壁呈螺旋式前進，如果一端不行，再在管的另一端按同樣的方法剝離，這樣依靠水流的壓力和滑潤力，使玻管內(nèi)壁與凝膠分離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對著一干凈的試管（15CM長）內(nèi)，此時可以將凝膠柱壓出玻管進入試管內(nèi)。,,6-5、凝膠固定與染色：

26、 在含有凝膠柱的試管內(nèi)，加入適量染色液，放置染色30分鐘（凝膠中蛋白質(zhì)區(qū)帶亦被固定），完畢，棄去試管內(nèi)的染色液，再用自來水洗試管內(nèi)凝膠柱數(shù)遍，完后，浸泡在自來水中。 6-6、凝膠脫色（以自來水作脫色劑）： 間隔一定時間后，棄去試管內(nèi)浸泡凝膠柱的廢自來水，再用新鮮自來水洗試管內(nèi)凝膠柱數(shù)遍，完后，再浸泡在自來水中，如此反復(fù)多次，直至色帶完全清晰為止。,,7-實

27、驗結(jié)果: (1)-繪制凝膠圖 (2)- 書面文字結(jié)果,思考題簡述聚丙烯酰胺凝膠聚合的原理，如何調(diào)節(jié)凝膠的孔徑?2. 各管加完凝膠后，為什么要及時加蒸餾水封閉？3. 為什么在樣品中加含有少許溴酚藍的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚藍各有何用途？4. 上下兩槽電泳緩沖液電泳后，能否混合存放？為什么？,,（1）、分離膠[7.5%]貯液的配制： 分別取：A ：B ：C ：D = 1.0ml ：2.0ml

28、：4.0ml ：1.0ml （8.0 ml） 按上述比例加完后，再另外單獨加 TEMED 15 -20ul （2）、濃縮膠[2.5%]貯液的配制： 分別?。篍 ：F ：G ：H = 0.5 ml ：1.0 ml ：0.5ml ：2.0ml （4.0 ml） 按上述比例加完后，再另外單獨加TEMED 20-30 ul (3) - 相關(guān)條件提示: