半滑舌鰨GnIH和kisspeptin系統(tǒng)鑒定及其生理功能研究.pdf

1、下丘腦神經(jīng)肽促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)及親吻肽(kisspeptin,Kiss)在哺乳類生殖調(diào)控中起著直接而相反的作用。為了研究二者對(duì)魚類生殖軸的調(diào)控作用，本文以半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)為研究對(duì)象，首先運(yùn)用RT-PCR及RACE方法克隆獲得了gnih及其受體gnihr、親吻肽受體kiss2r的全長(zhǎng)cDNA序列，并鑒定出了部分kiss2序列

2、。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)gnih編碼兩種多肽GnIH-1及GnIH-2，而kiss2編碼一種核心十肽Kiss2-10。隨后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了gnih/gnihr及kiss2/kiss2r的組織分布以及gnih在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)特性。最后，通過離體孵育實(shí)驗(yàn)，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR及ELISA方法分別研究了GnIH和Kiss多肽對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)與垂體激素合成及分泌的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　1.G

3、nIH/GnIHR系統(tǒng)鑒定
　　1.1.半滑舌鰨gnih/gnihr基因克隆和組織表達(dá)分析
　　采用RT-PCR及RACE方法首次從半滑舌鰨腦中克隆得到了gnih/gnihr的全長(zhǎng)cDNA序列。半滑舌鰨gnih cDNA全長(zhǎng)為918 bp，其中5’非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)為24 bp，3’UTR為309 bp，開放閱讀框(open reading frame,ORF)為585 bp，編碼19

4、4個(gè)氨基酸的前體多肽。GnIH前體蛋白分子質(zhì)量為21.73 kDa，等電點(diǎn)為6.52。GnIH前體多肽編碼GnIH-1和GnIH-2兩種多肽。gnihr cDNA全長(zhǎng)為2201 bp，其中5’UTR為60 bp，3’UTR為776 bp，ORF為1365 bp，編碼454個(gè)氨基酸。GnIHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，包括七個(gè)跨膜區(qū)，七個(gè)磷酸化位點(diǎn)及五個(gè)糖基化位點(diǎn)。組織分布結(jié)果顯示gnih主要在腦中表達(dá)，在卵巢、心臟、胃中的表達(dá)量相對(duì)稍低；在垂

5、體及其他外周組織中表達(dá)量極低；gnihr主要分布于腦、垂體中，其次為卵巢、心臟，但在其他外周組織中表達(dá)量較低。
　　1.2.半滑舌鰨gnih在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)特性
　　在卵巢成熟過程中，腦gnih mRNA表達(dá)量在卵黃生成期（III期）略微增加，在成熟期（V期）顯著性下降，然而在排卵后期（VI期）又顯著性增加并達(dá)到峰值；垂體gnih mRNA表達(dá)量除在成熟期（V期）顯著性增加并達(dá)到峰值外，在卵巢成熟的其他時(shí)期保持穩(wěn)

6、定；卵巢gnih mRNA表達(dá)量在卵黃生成期（III期）急劇下降，并在整個(gè)卵巢成熟過程中保持較低的表達(dá)水平。
　　1.3.GnIH對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響
　　本研究首次通過下丘腦離體孵育的方法分析了 GnIH多肽對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響。研究結(jié)果顯示，GnIH-1促進(jìn)了gnrh2和gnih的表達(dá)，但是對(duì)gnrh3和kiss2的表達(dá)無顯著影響；然而GnIH-2抑制了gnrh3的表達(dá)，對(duì)gn

7、rh2、kiss2和gnih的表達(dá)無顯著影響。
　　1.4.GnIH對(duì)半滑舌鰨垂體激素合成及分泌的影響
　　本研究首次通過垂體離體孵育的方法分析了 GnIH多肽對(duì)半滑舌鰨垂體促性腺激素(gonadotropin, GTH)及生長(zhǎng)激素(growth hormone,GH)合成及分泌的影響。結(jié)果表明，GnIH-1促進(jìn)了gh mRNA的表達(dá)，對(duì)lhβ、fshβ、gthαmRNA的表達(dá)無顯著影響；GnIH-2則對(duì)這些基因的表達(dá)均無顯

8、著影響。此外，GnIH-1與GnIH-2均抑制了LH分泌，但對(duì)GH及FSH分泌無顯著影響。
　　2.Kiss/KissR系統(tǒng)
　　2.1.半滑舌鰨kiss2/kiss2r基因克隆和組織表達(dá)分析
　　本研究克隆得到了kiss2的部分cDNA序列，該序列長(zhǎng)度為274 bp，編碼90個(gè)氨基酸的前體蛋白。該前體多肽包括功能核心十肽Kiss2-10(FNFNPFGLRF)。半滑舌鰨kiss2r全長(zhǎng)cDNA序列為1966 bp，其

9、中5’ UTR為342 bp，3’UTR為481 bp，ORF為1143 bp，編碼380個(gè)氨基酸。Kiss2R也屬于G蛋白偶聯(lián)受體，包括七個(gè)跨膜區(qū)，八個(gè)磷酸化位點(diǎn)及三個(gè)糖基化位點(diǎn)。組織分布結(jié)果表明kiss2 mRNA主要在卵巢中表達(dá)，在腦與垂體中表達(dá)量相對(duì)較高，但其他外周組織中表達(dá)量較低。然而kiss2r則主要在腦中表達(dá)，在垂體及其他外周組織中表達(dá)水平較低。
　　2.2.Kiss2對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響

10、>　　本研究首次通過下丘腦離體孵育的方法研究了Kiss2對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響。結(jié)果表明，Kiss2對(duì)gnrh2和gnrh3表達(dá)無顯著影響；Kiss2促進(jìn)了gnih的表達(dá)，卻抑制了gnihr的表達(dá)；此外，Kiss2促進(jìn)了自身配體kiss2的表達(dá)，卻抑制了自身受體kiss2r的表達(dá)。
　　2.3.Kiss2對(duì)半滑舌鰨垂體激素合成及分泌的影響
　　本研究首次通過垂體離體孵育的方法研究了Kiss2對(duì)半滑舌鰨垂體